一种羊胎盘外泌体的制备方法及应用

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，尤其涉及一种羊胎盘外泌体的制备方法及应用。

背景技术

我国是世界第一养羊大国，目前羊的存栏量接近4亿只左右，羊肉产量超过500万吨，每年可供利用的羊胎盘潜藏量高达450万个。但目前国内对羊胎盘的加工利用率不足3％，直接废弃不仅造成资源浪费，而且还容易引发环境污染[1]。据《本草纲目》记载，胎盘又称紫河车或胞衣，味甘、咸、温，入肺、肝、肾三经，有益气养血、补肾益精之功效[2]。现代医学研究表明胎盘中含有胶原蛋白、免疫球蛋白、肾上腺分泌激素、雌激素、白细胞介素、干细胞生长因子、转化生长因子等生物活性物质[1]。羊胎盘主要成分是易被人体吸收的小分子肽，研究发现其含有17种氨基酸(必需氨基酸8种)、14种微量元素，同时具有修复组织损伤、养颜美容、抗衰老、增强免疫、抗肿瘤、护肝、抗氧化等作用[3]，被广泛用于功能食品、护肤化妆品和中药制剂等领域。

外泌体(Exosome)是由活细胞分泌的直径在30～100nm的亚细胞双层膜囊泡，在透射电子显微镜下，外泌体呈扁平茶盏状或球状(Théryetal.,2009；Yietal.,2012)。外泌体内容物含有与其细胞来源相似的生物活性物质，如蛋白质(细胞因子和生长因子等)和RNA(编码或非编码RNA)，在质膜上含有丰富的胆固醇、鞘磷脂、神经酰胺、脂筏及磷脂酰丝氨酸等脂类物质和特异性的表面配体(Sokolovaetal.,2011)。这些结构可以保护外泌体在细胞外环境中不被降解和稀释，并通过组织液或血液的远距离，输送到特异性靶细胞发挥调控作用。

目前市场上提取外泌体的方法是采用超高速离心法，该方法也是目前提取外泌体的金标准。超滤离心法的优势在于杂质少、纯度高，但仪器的成本过大，单次处理上清液的体积有限，难以符合大规模生产需要。色谱尺寸排阻法是基于尺寸大小的技术，能够快速提取外泌体且纯度高，但其受外力影响大，外泌体损耗较多。沉淀法是成本最低的外泌体纯化方法且无需特殊仪器，但其提纯的外泌体纯度低，杂质多，且难以分离沉淀的络合物。

随着医美市场对外泌体原料日益增长的需求，需要一种低成本、高产量、高质量、规模化的组织外泌体生产工艺。

[1]周洁静，侯银臣，刘旺旺，等.羊胎盘抗氧化肽制备工艺及其体外抗氧化活性研究[J].食品工业，2015，36(5):11－15.

[2]苏晔，魏泓.胎盘免疫调节因子的生物功能及临床应用进展[J].免疫学杂志，2002，18(3):117－118.

[3]王炳祥.山羊胎盘肽的分离和初步鉴定及营养、免疫、抗氧化作用的研究[D].泰安:山东农业大学，2011.

发明内容

为解决现有技术的缺陷，本发明提供了一种低成本、高产量、高质量、易存储、规模化的组织外泌体生产工艺。本发明优化了组织外泌体提取的工艺，在保证质量的同时，提高了外泌体的产量及保存时间。

本申请一方面提供了一种羊胎盘外泌体的制备方法，包括以下步骤：

1)将羊胎盘在2-8℃切片，并放入冷冻研磨机中研磨成糜状；加入0.5-1.5倍糜状羊胎盘体积的木瓜蛋白酶至糜状羊胎盘，在30-60℃,水浴震荡15-120分钟得到羊胎盘提取混合液；再加入与羊胎盘提取混合液等体积的预冷PBS，并在2-8℃匀浆得到组织匀浆；将组织匀浆用200-800目过滤器过滤，并用预冷PBS冲洗组织匀浆搅拌继续过滤，定容至糜状羊胎盘体积的50-100倍，得到液化组织液；

2)将液化组织液于2-8℃一次离心，转速1000-4000rpm，时长10-30min，取上清液；再将上清液于2-8℃二次离心，转速8000-12000rpm，时长10-30min，取二次上清液即为羊胎盘滤液；

3)将所述羊胎盘滤液用0.1-0.45um的第一滤芯微滤，滤出液再过100-300KD的第二滤芯超滤，收集浓缩液；向浓缩液中加入1-5％浓缩液质量的甘氨酸、羟乙基-β-环糊精、海藻糖；再将其放入-20℃冷冻2-4小时塑形，之后转入-80℃冰箱过夜冻实，最后置于冷冻干燥机中干燥18-24小时，得到冻干粉即为所述羊胎盘外泌体。

在某些更具体的实施方式中，步骤1)中所述羊胎盘的切片温度优选4℃，切片长为1-2cm，厚2-3mm，质量为450mg-1g，所述切片在研磨前置于预冷PBS中；冷冻研磨机的研磨温度为-2～-8℃。

在某些具体的实施方式中，可通过冰上操作控制温度，冰上操作的温度通常为4℃。也可以通过整体温度控制的方式，将环境温度控制在2-8℃。

在某些更具体的实施方式中，步骤1)中所述木瓜蛋白酶的加入量为1倍糜状羊胎盘体积，酶活为80U/mL，水浴温度优选37℃，震荡时间优选30分钟。

在某些更具体的实施方式中，步骤1)中匀浆的温度优选4℃；所述过滤器优选400目。

在某些更具体的实施方式中，步骤1)中定容至糜状羊胎盘体积的50倍，得到所述液化组织液；所述预冷PBS温度为2-8℃，优选4℃。

预冷PBS即为预先降温冷却的PBS溶液。

在某些更具体的实施方式中，步骤2)中第一次离心的温度优选4℃，转速优选3000rpm，时长优选10min；二次离心温度优选4℃，转速优选9000rpm，时长优选20min。

在某些更具体的实施方式中，步骤3)中第一滤芯优选0.1um，使用前用PBS冲洗3遍；所述第二滤芯优选150KD。

在某些更具体的实施方式中，步骤3)中甘氨酸的加入量为浓缩液质量的3％，羟乙基-β-环糊精的加入量为浓缩液质量的3％，海藻糖的加入量为浓缩液质量的2％，再将其放入-20℃冷冻4小时塑形，之后转入-80℃冰箱过夜冻实，最后置于冷冻干燥机中干燥23小时。

本发明另一方面还提供了一种上述方法制备的羊胎盘外泌体。

本发明另一方面还提供了一种外泌体保存方式。所述的羊胎盘提取的外泌体冻干粉置于常温保存。正常外泌体是需要保存在-80℃才可能长期保持活性。

本发明另一方面还提供了一种上述羊胎盘外泌体在制备化妆品或医用敷料中的应用。

本发明通过严格控制胎盘酶解的浓度与时间，保证最大限度外泌体的产量。酶解法使得组织细胞中大量的外泌体得以释放，提高外泌体的产量。离心等前处理去除了大量非外泌体组分，通过微滤和超滤方法，提高了外泌体的纯度和质量。其次，超滤中大滤径生产的外泌体直径大功效差，而滤径过小又会导致滤芯内压力大外泌体损耗严重，且生产时间延长。本发明通过控制超滤滤芯的滤径，在保证功效的基础上，最大程度地减少了外泌体的损耗。本申请使用羟乙基-β-环状糊精等作为冻干塑形剂，并筛选了加入比例，最大限度保证外泌体的生物学活性及较好的销售外观，在保存最大功效的同时大大降低了存储的难度。此外，本发明未使用特殊仪器，大大降低成本，且能生产大量的外泌体。

最后从羊胎盘中提取的外泌体冻存配方简洁，降低了外泌体存储温度条件，不用储存在-80℃的环境，延长保质期的同时最大限度的保存了外泌体的质量。

本发明的外泌体未来可作为化妆品原料及医用敷料，用于真皮浅层及表皮的创面护理，促进创面愈合，预防疤痕形成，也可用于皮肤美容，促进皮肤细胞再生，延缓衰老，修复痘痕，淡化色斑，提亮肤色等。

附图说明

图1为实施例1的Western blot法测定结果；

图2为BCA法蛋白浓度测定的标准曲线图；

图3为实施例1样品的粒径分布曲线；

图4为不同浓度羊胎盘外泌体对人皮肤成纤维细胞增值率的影响；

图5为实施例1样品抗氧化能力的曲线图；

图6为冻干样品图。

具体实施方式

以下将通过实施例来详细说明本申请的实施方式，借此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本申请中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备，均来自市售产品。本申请中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

本申请还存在其它多种可实施的技术方案，在此不做一一列举，本申请权利要求中要求保护的技术方案都是可以实施的。

“包含”或“包括”旨在表示组合物(例如介质)和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由……组成”意味着排除对于所述目的的组合具有任何重要意义的其他要素。因此，基本上由本文定义的元素组成的组合物不排除不会实质上影响要求保护的本申请的基本和新颖特征的其他材料或步骤。“由……组成”是指排除其他组成部分的微量元素和实质性的方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本申请的范围内。

实施例1：

一)羊胎盘组织液化处理：

1.将冷冻的羊胎盘组织在冰上(冰上操作成本低，冰上操作的温度为4℃)纵向切片；切片长1-2cm，厚2-3mm，约450mg-1g；切好后暂时加入预冷PBS中暂存，PBS淹没羊胎盘切片即可。

2.准备12根5mL的EP管，并放入羊胎盘切片与6颗3.2mm钢珠。

3.将EP管放入冷冻研磨仪中，在-5℃下研磨充分，将羊胎盘切片研磨成糜状。

4.将研磨仪中研磨的组织去钢珠后，将20ml糜状羊胎盘转移至50ml离心管中。再加入80U/mL的木瓜蛋白酶,20ml，在37℃水浴震荡30分钟；

5.将酶解后的样品溶液转移到500ml烧杯中。加入40ml预冷PBS后，轻轻匀浆；匀浆过程中在冰上进行；

6.组织匀浆通过400目网状过滤器过滤；收集滤液；

7.收集滤网中的胎盘组织加预冷PBS混匀，再过滤一次，合并滤液；最终用预冷PBS将滤液体积定容至1L得到液化组织液。

二)液化组织匀浆预处理；

1.离心去碎片：将液化组织液转移至离心管中于4℃以3000rpm离心10min，去除滤液中的碎片；离心后上清液转移到新的离心管中；

2.离心去杂质：转移后的上清液于4℃以9000rpm离心20min，去除样品中杂质，将离心后的上清液转移至新的离心管中。

三)细胞外囊泡浓缩

1.在通风橱中打开中空纤维小试设备，装上0.1um滤芯，用PBS冲洗3遍待用。

2.将收集的羊胎盘滤液通过0.1um滤芯微滤，收集滤出液。

3.再将0.1um滤出液过150KD滤芯。收集150KD的浓缩液。

四)外泌体冻干

1.向浓缩液中加入甘氨酸3％质量浓度，羟乙基-β-环糊精3％质量浓度，海藻糖2％质量浓度，先放入-20℃冷冻3小时，转入-80℃冰箱过夜冻实。

2.将冻实的外泌体放入冷冻干燥机中干燥23小时，后取出冻干粉，常温保存。

本实施例所使用预冷PBS温度为4℃。在本实施例中20g冷冻羊胎盘可以得到80ml0.394mg/ml多肽样品(体积为步骤三中浓缩液的体积)的外泌体。

实施例2：

一)羊胎盘组织液化处理：

1.将冷冻的羊胎盘组织在冰上(冰上操作成本低，冰上操作的温度为4℃)纵向切片；切片长1-2cm，厚2-3mm，约450mg-1g；切好后暂时加入预冷PBS中暂存，PBS淹没羊胎盘切片即可。

2.准备12根5mL的EP管，并放入羊胎盘切片与6颗3.2mm钢珠。

3.将EP管放入冷冻研磨仪中，在-8℃下研磨充分，将羊胎盘切片研磨成糜状。

4.将研磨仪中研磨的组织去钢珠后，将20ml糜状羊胎盘转移至50ml离心管中。再加入80U/mL的木瓜蛋白酶,30ml，在60℃水浴震荡120分钟；

5.将酶解后的样品溶液转移到500ml烧杯中。加入40ml预冷PBS后，轻轻匀浆；匀浆过程中在冰上进行；

6.组织匀浆通过800目网状过滤器过滤；收集滤液；

7.收集滤网中的胎盘组织加预冷PBS混匀，再过滤一次，合并滤液；最终用预冷PBS将滤液体积定容至2L得到液化组织液。

二)液化组织匀浆预处理；

1.离心去碎片：将液化组织液转移至离心管中于4℃以4000rpm离心30min，去除滤液中的碎片；离心后上清液转移到新的离心管中；

2.离心去杂质：转移后的上清液于4℃以12000rpm离心30min，去除样品中杂质，将离心后的上清液转移至新的离心管中。

三)细胞外囊泡浓缩

1.在通风橱中打开中空纤维小试设备，装上0.45um滤芯，用PBS冲洗3遍待用。

2.将收集的羊胎盘滤液通过0.45um滤芯微滤，收集滤出液。

3.再将0.45um滤出液过300KD滤芯。收集300KD的浓缩液。

4.向浓缩液中加入甘氨酸5％，羟乙基-β-环糊精5％，海藻糖5％(百分比为质量浓度)，先放入-20℃冷冻4小时塑形，转入-80℃冰箱过夜冻实。

5.将冻实的外泌体放入冷冻干燥机中干燥24小时，后取出冻干粉，常温保存

本实施例所使用预冷PBS温度为2℃。

实施例3：

一)羊胎盘组织液化处理：

1.将冷冻的羊胎盘组织在冰上(冰上操作成本低，冰上操作的温度为4℃)纵向切片；切片长1-2cm，厚2-3mm，约450mg-1g；切好后暂时加入预冷PBS中暂存，PBS淹没羊胎盘切片即可。

2.准备12根5mL的EP管，并放入羊胎盘切片与6颗3.2mm钢珠。

3.将EP管放入冷冻研磨仪中，在-2℃下研磨充分，将羊胎盘切片研磨成糜状。

4.将研磨仪中研磨的组织去钢珠后，将20ml糜状羊胎盘转移至50ml离心管中。再加入80U/mL的木瓜蛋白酶,20ml，在30℃水浴震荡15分钟；

5.将酶解后的样品溶液转移到500ml烧杯中。加入40ml预冷PBS后，轻轻匀浆；匀浆过程中在冰上进行；

6.组织匀浆通过200目网状过滤器过滤；收集滤液；

7.收集滤网中的胎盘组织加预冷PBS混匀，再过滤一次，合并滤液；最终用预冷PBS将滤液体积定容至1L得到液化组织液。

二)液化组织匀浆预处理；

1.离心去碎片：将液化组织液转移至离心管中于4℃以1000rpm离心10min，去除滤液中的碎片；离心后上清液转移到新的离心管中；

2.离心去杂质：转移后的上清液于4℃以8000rpm离心10min，去除样品中杂质，将离心后的上清液转移至新的离心管中。

三)细胞外囊泡浓缩

1.在通风橱中打开中空纤维小试设备，装上0.1um滤芯，用PBS冲洗3遍待用。

2.将收集的羊胎盘滤液通过0.1um滤芯微滤，收集滤出液。

3.再将0.1um滤出液过100KD滤芯。收集100KD的浓缩液。

4.向浓缩液中加入羟乙基-β-环状糊精(冻干冻干配方)至质量浓度为1％，先放入-20℃冷冻2小时塑形，转入-80℃冰箱过夜冻实。

5.将冻实的外泌体放入冷冻干燥机中干燥18小时，后取出冻干粉，常温保存

本实施例所使用预冷PBS温度为4℃。

对比例1

使用与实施例1相同的方法，仅改变步骤一中木瓜蛋白的酶解时的酶解温度。表1还记录的不同温度下羊胎盘外泌体中多肽的含量。

表1

木瓜蛋白酶最佳温度是50-60℃。温度过高，酶的结构会遭到破坏，且较高的温度会降低外泌体的活性，因此实验设计最高温度为60℃。从表1中可知，水解温度为37℃时，羊胎盘外泌体中多肽总量最多。

对比例2

使用与实施例1相同的方法，仅改变步骤一中木瓜蛋白酶的加入量和酶解时间，具体见表2。表2还记录了不同酶量及时间条件下，羊胎盘外泌体中多肽的含量。当加入的木瓜蛋白酶与糜状羊胎盘等体积，酶解时间为30分钟时，羊胎盘外泌体中多肽总量最多。

表2

对比例3

取实施例1所得的羊胎盘外泌体浓缩液，并按以下含量添加赋形剂。取2ml样液加入到10ml安瓿瓶中，各配方准备至少两瓶准备冻干。

实验方法

先通过将羟乙基-β-环糊精、甘露糖醇、甘氨酸、海藻糖、右旋糖酐五个作为因素，以1％，2％，3％，4％，5％为5种水平设计正交表(1％，2％，3％，4％，5％为加入的赋形剂与浓缩液质量比例)。配置完成后在-20℃冷冻塑形，后再-80℃度过夜冻实。冻干23h。优选出外泌体主要冻干因素为羟乙基-β-环糊精、海藻糖、甘氨酸。重复优化部分设计配方如表3，样品见图6。

表3

评分标准：

色泽：白色-1分；其他颜色-0分。

表面形态：非常平整-2分；平整-1分；不规则-0分。

是否收缩：未收缩-2分；略微收缩-1分；收缩严重-0分。

瓶底粘附性：黏附瓶底-1分；脱离-0分。

倒置稳定性：未脱离-1分；脱离-0分。

成品状态：细腻粉状-2分；粗糙粉状-1分；絮状-0分。

复溶性：5s内溶解-2分；10s内溶解-1分；更长或有沉淀-0分。

溶解涂抹后颗粒感：无颗粒感-1分；有颗粒感-0分。

其中：6号样品甘氨酸3％质量浓度，羟乙基-β-环糊精3％质量浓度，海藻糖2％质量浓度，冻干评分最高，效果最佳。1-1号次之。

测试方法

1、Westernblot法鉴定

1、实验准备：实验前先将裂解液2～8℃融化混匀后置于冰上；

2、将已获得的外泌体样本与裂解液按体积比1:1混匀后置于冰上裂解10min；

3、于4℃以12,000g离心5min取上清，将实施例中得到的上清加入适量的loadingbuffer，沸水浴加热使蛋白充分变性。配置SDS-PAGE凝胶，将蛋白加样至SDS-PAGE胶的加样孔，电泳分离蛋白样本并进行转膜。转膜完毕后，把蛋白膜放置5％封闭液中封闭。封闭完成后，一抗(CD63、TSG101)4℃孵育过夜，再用酶标二抗室温孵育1h。最后将蛋白膜放置在ECL发光液中，反应2min后，放入化学发光成像系统进行显色成像。

进行Western Blot实验时，取CD63&TSG101阳性对照品10-20μg与实验样品平行上样。实施例1得到的外泌体的CD63、TSG101蛋白Western Blot实验结果如图1所示，外泌体特异性蛋白、CD63、TSG101的条带清晰明亮，与阳性试剂盒阳性条带一致，位置正确，可以证明该系统提取制备的物质为外泌体，且纯度较高。

所用的外泌体裂解试剂盒为宇玫博公司的UR52301。

所用抗体型号为：TSG101(ab83abcam，43-47KD)，CD63(ab192394，abcam)。

2、BCA法蛋白浓度测定

1)蛋白标准品的制备：取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。例如：取20ul 25mg/ml蛋白标准，加入980ul稀释液即可配制成0.5mg/ml蛋白标准溶液。稀释液可以用1％PB溶液稀释标准品，稀释后的0.5mg/ml蛋白标准可以-20℃长期冻存。具体配置的浓度如表4所示。

2)BCA工作液的配制：根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。例如(5ml BCA试剂A加100ul BCA试剂B，混匀，配制成5.1mlBCA工作液，BCA工作液室温24h内稳定)。

3)外泌体含量检测

表4

a)加20ul样品到96孔板的样品孔中；

b)各孔加入200ul BCA工作液，37℃放置20-30min；

注：也可以室温放置2h，或60℃放置30min；

c)用酶标仪测定A562nm波长的吸光度(浓度为横坐标，吸光值为纵坐标)

d)根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的外泌体含量。

BCA蛋白浓度测定试剂盒为碧云天的P0012，碧云天。最终的标准曲线如图2所示。实施例1及对比样5-9的蛋白浓度如表5所示。

表5

3、外泌体粒径检测方法

采用德国ZetaView纳米颗粒追踪分析仪，型号为ZetaView PMX 110。

实验操作：

①以去离子水清洗样本池；②仪器以聚苯乙烯微球(100nm)校准；③以1X PBSbuffer(Biological Industries,Israel)清洗样本池；④样本以1X PBS buffer(BI,Israel)稀释，进样检测。

实施例1样品经过三次重复测试，最终的粒径如表6和图3所示。

表6

4、胎盘外泌体在延缓皮肤衰老方面的作用(CCK-8检测细胞增殖、细胞紫外预防实验)

所用试剂盒为碧云天的CCK-8检测试剂盒C0038。

1.实验方法：人皮肤成纤维细胞增殖活性实验(CCK8法)

人皮肤成纤维细胞(HFF)培养在含10％灭活胎牛血清，1％双抗(青霉素+链霉素)的DMEM高糖培养液中，待细胞铺满后，用胰酶消化轻拍打加入高糖培养液终止消化，小心收集细胞于离心管中，离心，去除上清液，重悬细胞进行计数。调整细胞悬液浓度为2×10

不同浓度羊胎盘外泌体的细胞增值率如图4所示，其中最后两组外泌体1％与外泌体4％所用的外泌体是人源外泌体，作为阳性对照。该实验说明羊胎盘外泌体提取液对细胞预防紫外损伤有一定作用。

5总抗氧化T-AOC能力检测实验

使用南京建成总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒A015-2-1。

实验操作：按下表7添加实施例1的样品及试剂。

表7

标准品建议用蒸馏水稀释成0.1/0.2/0.4/0.8/1.0mM浓度制作标曲，标曲仅做一次。

由于外泌体被脂质体所包裹，外泌体膜结构的完整性是保证外泌体质量的功效评价前提。为了验证冻干的羊胎盘外泌体的囊泡完整。曲线图如图5所示，其中左图为未添加外泌体裂解液的图谱，右图为添加了外泌体裂解液的图谱。图5说明冻干后，大量的羊胎盘外泌体膜结构依旧完好。同时也说明羊胎盘外泌体能显著提高抗氧化能力，且抗氧化能力与羊胎盘外泌体浓度呈线性关系。

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上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护范围。