gp96-RBD融合蛋白及其相关生物材料在活化长效浆细胞中的应用
文献发布时间：2024-01-17 01:26:37
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及gp96-RBD融合蛋白及其相关生物材料在活化长效浆细胞中的应用。
背景技术
毫无疑问，疫苗免疫依旧是预防病毒感染的最有效手段。但是无论是针对新型冠状病毒的疫苗还是流感病毒疫苗都存在抗体维持时间短，不能对机体建立长效保护的问题。目前大部分疫苗以体液免疫反应为主，抗体的水平及维持时间与抗感染的效果及疫情的控制程度具有直接的相关性。因此，提高疫苗免疫的抗体水平及维持时间，对流行病的防控具有重要的现实意义。
B细胞是机体特异性体液免疫反应中的主要免疫活性细胞，B淋巴细胞到浆细胞的终末分化，是机体能否产生获得性免疫的关键步骤。浆细胞产生的抗体可以帮助清除病原体，依据抗体分泌细胞(ASCs)寿命可分为短寿命浆细胞和长寿命浆细胞。短寿命浆细胞主要在免疫早期时相中产生；长寿命浆细胞，产生于后期时相中的生发中心，此类浆细胞可进入骨髓，并参与全身循环。长寿命浆细胞可持续、长期分泌抗体，并从凋亡途径中逃脱，为“专职长寿抗体分泌细胞”。长寿命浆细胞能产生保护性记忆参与长期免疫，如抗天花疫苗的特异性抗体可存在60年，Gatto等发现，大约有10％长寿命浆细胞在小鼠体内可存活一生。目前尚未有关于可以活化长寿浆细胞方法的报道，因此研究可活化长效浆细胞的方法具有重要的社会和经济意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何活化长寿浆细胞。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种融合蛋白。
本发明提供的融合蛋白的名称为gp96-RBD，所述gp96-RBD融合蛋白为如下(1) 或(2)：
(1)由蛋白质gp96和蛋白质RBD融合得到的融合蛋白：
所述蛋白质gp96为如下a1)或a2)所示的蛋白质：
a1)氨基酸序列是SEQ ID No.3所示的蛋白质；
a2)将a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质；
所述蛋白质RBD为如下b1)或b2)所示的蛋白质：
b1)氨基酸序列是SEQ ID No.5所示的蛋白质；
b2)将b1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的蛋白质；
(2)在(1)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合标签得到的具有相同功能的融合蛋白。
上述融合蛋白中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
进一步的，所述蛋白质gp96和所述蛋白质RBD之间还包括连接肽。在本发明的一个具体实施例中，所述连接肽为柔性(GGGGS)linker，其氨基酸序列如SEQ ID No.1 第231-240位所示。
更进一步的，所述融合蛋白为氨基酸序列是SEQ ID No.1所示的蛋白质。
上述任一所述融合蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。所述融合蛋白的编码基因可通过将SEQ ID No.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。
为了解决上述技术问题，本发明又提供了编码上述gp96-RBD融合蛋白的核酸分子。
所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码上述gp96-RBD融合蛋白的DNA 分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码上述gp96-RBD融合蛋白的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码gp96-RBD融合蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码gp96-RBD融合蛋白的核苷酸序列90％或者更高同一性的核苷酸，只要编码 gp96-RBD融合蛋白且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
所述“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有91％或更高，或92％或更高，或93％或更高，或94％或更高，或95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了下述S1)-S3)中的任一种生物材料：
S1)含有上述核酸分子的表达盒；
S2)含有上述核酸分子或上述表达盒的重组载体；
S3)含有上述核酸分子或上述表达盒或上述重组载体的重组细胞。
上述生物材料中，S1)所述的含有上述核酸分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述gp96-RBD融合蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动编码上述gp96-RBD融合蛋白的基因转录的启动子，还可包括终止编码上述gp96-RBD融合蛋白的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。在本发明的一个具体实施例中，所述重组载体将SEQ ID No.2所示的DNA分子插入表达载体 pFastBac
上述生物材料中，所述细胞可为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。在本发明的一个具体实施例中，所述重组细胞为含有上述重组载体的昆虫细胞。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了制备上述gp96-RBD融合蛋白的方法。
本发明提供的制备上述gp96-RBD融合蛋白的方法包括如下步骤：使上述gp96-RBD融合蛋白的编码基因在生物或生物细胞中进行表达，得到所述gp96-RBD融合蛋白。
进一步的，使上述gp96-RBD融合蛋白的编码基因在生物或生物细胞中进行表达的方法包括如下步骤：将上述gp96-RBD融合蛋白的编码基因导入生物或生物细胞中。
所述生物细胞可为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。所述非人动物细胞可为哺乳动物细胞或昆虫细胞。在本发明的一个具体实施例中，所述生物细胞具体可为昆虫细胞(如Sf9细胞)。
所述融合蛋白的编码基因为SEQ ID No.2所示的DNA分子。
再进一步的，所述gp96-RBD融合蛋白的编码基因通过重组昆虫病毒表达载体或重组昆虫病毒导入生物或生物细胞中。
所述重组昆虫病毒表达载体为可在细菌和昆虫细胞之间转移和扩增的病毒穿梭质粒。具体的，所述病毒穿梭质粒为杆状病毒穿梭质粒。在本发明的一个具体实施例中，所述重组昆虫病毒表达载体为将SEQ ID No.2所示的DNA分子插入表达载体 pFastBac
所述重组昆虫病毒是通过所述重组昆虫病毒表达载体在昆虫细胞中表达或传代得到的。
更进一步的，所述方法可包括如下步骤：
1)将上述重组昆虫病毒表达载体转染Sf9细胞，孵育，离心，收集上清液，该上清液即为P1代病毒；
2)完成步骤1)后，向Sf9细胞悬浮培养液中加入所述P1代病毒，孵育，离心，收集上清液，该上清液即为P2代病毒；
3)完成步骤2)后，向Sf9细胞悬浮液中加入所述P2代病毒，培养，离心，收集上清液，该上清液即为P3代病毒，P3代病毒中含有gp96-RBD融合蛋白。
上述步骤1)中，每1×10
上述步骤2)中，所述Sf9细胞悬浮培养液可为将含1×10
上述步骤3)中，所述Sf9细胞悬浮液可含1.6×10
所述步骤3)后还包括纯化的步骤。所述纯化的方法可包括如下步骤：
a、向Sf9细胞悬浮液中加入所述P3代病毒，培养，获得悬浮液；
b、完成步骤a后，取所述悬浮液，离心，获得上清液；
c、完成步骤b后，取所述上清液，经滤膜过滤，获得上样液；
d、完成步骤d后，将所述上样液上样于Ni亲和层析柱，然后用不含咪唑的 Tris-HCl缓冲液冲洗，再用含有咪唑的Tris-HCl缓冲液洗脱，获得洗脱液；
e、完成步骤d后，将所述洗脱液用超滤管进行超滤换液，获得置换液；
f、完成步骤e后，将所述置换液上样于Q离子交换柱，先用pH7.5、200mM的PBS 缓冲液冲洗；然后用pH7.5、300mM的PBS缓冲液冲洗；再用pH7.5、600mM的PBS缓冲液冲洗，最后收集过柱后溶液并采用超滤管进行超滤浓缩，得到浓缩液，该浓缩液即为纯化后的重组融合蛋白gp96-RBD溶液。
所述步骤a中，所述Sf9细胞悬浮液可含4.5×10
所述步骤b中，所述离心的条件可为7000rpm离心20min。
所述步骤c中，所述滤膜可为0.22mm滤膜。
所述步骤d中，所述Ni柱亲和层析可为HisTrap HP亲和层析柱。上样流速控制可为1ml/min。
所述步骤e中，所述超滤管可为截留分子量为50KD的超滤管。
所述步骤f中，所述Q离子交换柱可为HiTrap-Q Sepharose离子交换层析柱。上样流速可为1ml/min。所述超滤管可为截留分子量为50KD的超滤管。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述gp96-RBD融合蛋白或上述核酸分子或上述生物材料的新用途。
本发明提供了上述gp96-RBD融合蛋白或上述核酸分子或上述生物材料在如下T1)-T8)中任一种中的应用：
T1)制备活化长效浆细胞的产品；
T2)制备提高机体长寿浆细胞水平(增加机体长寿浆细胞数量)的产品；
T3)制备提高机体抗体分泌水平和/或抗体维持时间的产品；
T4)制备预防和/或治疗新冠病毒感染的产品；
T5)活化长效浆细胞；
T6)提高机体长寿浆细胞水平(增加机体长寿浆细胞数量)；
T7)提高机体抗体分泌水平和/或抗体维持时间；
T8)预防和/或治疗新冠病毒感染。
为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种具有如下X1)-X4)任一所述功能的产品：
X1)活化长效浆细胞；
X2)提高机体长寿浆细胞水平(增加机体长寿浆细胞数量)；
X3)提高机体抗体分泌水平和/或抗体维持时间；
X4)预防和/或治疗新冠病毒感染。
本发明提供的产品的活性成分为上述gp96-RBD融合蛋白或上述核酸分子或上述生物材料。
上述任一所述应用或产品中，所述抗体为新冠病毒RBD抗体。
上述任一所述应用或产品中，所述机体为哺乳动物机体。所述哺乳动物包括人、鼠。
上述任一所述应用或产品中，所述gp96-RBD融合蛋白可通过皮下注射方式进行施用，所述施用对象可为哺乳动物；所述哺乳动物包括人、鼠。所述鼠具体可为雌性 BALB/c小鼠。每只小鼠注射剂量可为10μg-50μg，优选40μg。
上述任一所述应用或产品中，所述产品可为药物。
本发明将人热休克蛋白gp96的编码基因5’端通过柔性Linker与新冠病毒S蛋白RBD的编码基因融合得到gp96-RBD编码基因，并将其导入昆虫细胞中进行高效表达，得到gp96-RBD融合蛋白。本发明通过实验证明，本发明制备的gp96-RBD融合蛋白具有提高机体抗体表达水平和长寿浆细胞水平的功能。本发明的热休克蛋白gp96与病毒蛋白的受体结合区域的gp96-RBD融合蛋白对于预防病毒感染，建立长效保护功能具有重要的应用价值。
附图说明
图1为gp96-RBD融合蛋白SDS-PAGE检测结果。
图2为gp96-RBD融合蛋白免疫小鼠后抗体滴度检测结果。其中，*：P<0.05；**： P<0.01；***：P<0.001。
图3为gp96-RBD融合蛋白免疫小鼠后长寿骨髓浆细胞检测结果。其中，****： P<0.0001。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
Sf9细胞为Invitrogen公司产品，产品目录号为11496-015。
质粒pFastBac
Cellfectin II reagent是Life technologies的产品，产品目录号为10362-100。
gp96单克隆抗体为Santa Cruz公司产品，产品目录号为sc-56399。
Insect-XPRESS
超滤管为Merck Millipore公司产品，产品目录号为UFC905096。
ELISA试剂盒为eBioscience公司产品，产品目录号为BMS614INST。
HiTrap-Q Sepharose离子交换层析柱为GE公司产品，产品目录号为17-5053-01。
Superdex 200 10/300GL分子筛层析柱为GE公司产品，产品目录号为17517501。
大肠杆菌DH10Bac感受态细胞为北京原平皓生物技术有限公司产品，产品目录号为CL108-01。
实施例1、重组融合蛋白gp96/RBD的制备
一、质粒pFastBac
1、目的片段gp96-linker-RBD-6HIS的合成
委托金斯瑞生物科技股份有限公司人工合成SEQ ID No.2所示的目的片段gp96 -RBD，自5’端起依次包括新冠病毒S蛋白的受体结合域(RBD)的编码基因序列(SEQ ID No.2第1-690位)、柔性(GGGGS)linker的编码基因序列(SEQ ID No.2第691-720 位)、热休克蛋白gp96的编码基因序列(SEQ ID No.2第721-3057位)、组氨酸标签的编码基因序列(SEQ IDNo.2第3058-3081位)。
2、质粒pFastBac
将步骤1合成的目的片段gp96-linker-RBD-6HIS插入昆虫细胞表达载体pFastBac
重组质粒PFastBac1-gp96/RBD表达重组融合蛋白gp96-RBD，该重组融合蛋白gp96-RBD的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。其中，SEQ ID No.1第1-230位为新冠病毒S蛋白的受体结合域(RBD)的氨基酸序列，第231-240位为柔性(GGGGS)linker 的氨基酸序列，第241-1019位为热休克蛋白gp96的氨基酸序列，第1020-1027位为组氨酸标签的氨基酸序列。
二、gp96-RBD融合蛋白的表达
1、将步骤一构建的重组质粒PFastBac1-gp96/RBD转染Sf9细胞(每1×10
2、完成步骤1后，将Sf9细胞悬浮液1(含1×10
3、完成步骤2后，向Sf9细胞悬浮液2(含1.6×10
三、gp96-RBD融合蛋白的纯化
1、向300ml的Sf9细胞悬浮液3(含4.5×10
2、完成步骤1后，取所述悬浮液，7000rpm离心20min，获得上清液。
3、完成步骤2后，取所述上清液，经0.22mm滤膜过滤，获得上样液。
4、完成步骤3后，将所述上样液上样于Ni亲和层析柱。上样流速控制在1ml/min，然后用不含咪唑的Tris-HCl缓冲液冲洗，再用含有咪唑的Tris-HCl缓冲液洗脱，获得洗脱液。
5、完成步骤4后，将所述洗脱液用截留分子量为50KD的超滤管进行超滤换液，获得置换液。
6、完成步骤5后，将所述置换液上样于HiTrap-Q Sepharose离子交换层析柱(流速为1ml/min)，先用5ml的pH7.5、200mM的PBS缓冲液冲洗(流速为1ml/min)；然后用10ml的pH7.5、300mM的PBS缓冲液冲洗(流速为1ml/min)；再用3ml的pH7.5、 600mM的PBS缓冲液冲洗(流速为1ml/min)，最后收集过柱后溶液并采用截留分子量为50KD的超滤管进行超滤浓缩，得到1ml左右的浓缩液。该浓缩液含有重组融合蛋白 gp96-RBD，即为重组融合蛋白gp96-RBD溶液。采用BCA法测定重组融合蛋白gp96-RBD 溶液中的蛋白浓度，最后分装，贮存于-80℃。
7、完成步骤6后，将所述重组融合蛋白gp96-RBD溶液进行SDS-PAGE电泳分析，实验结果见图1(泳道1为高分子量标准蛋白质，泳道2为gp96-RBD蛋白)。结果表明，重组融合蛋白gp96-RBD溶液显示单一分子量条带，对应的分子量为262kDa，为二聚体蛋白。
按照上述方法，将SEQ ID No.2所示的目的片段gp96-linker-RBD-6HIS替换为gp96-6HIS，制备得到gp96蛋白。gp96-6HIS序列依次由SEQ ID No.4所示的DNA分子和 6HIS编码序列组成。
按照上述方法，将SEQ ID No.2所示的目的片段gp96-linker-RBD-6HIS替换为RBD-6HIS，制备得到RBD蛋白。RBD-6HIS序列依次由SEQ ID No.6所示的DNA分子和6HIS 编码序列组成。
实施例2、融合gp96-RBD蛋白的免疫学功能
1、小鼠免疫
将6周龄的雌性BALB/c(H-2d)小鼠随机分成PBS对照组、RBD蛋白与氢氧化铝佐剂(RBD+AL)处理组、gp96蛋白与RBD蛋白混合物(gp96+RBD)处理组和gp96-RBD融合蛋白处理组，每组10只，每组免疫三次，分别于第0天、第14天和第28天进行免疫，免疫方式均为皮下免疫。
第一组(PBS)：每只小鼠每次免疫200微升PBS。
第二组(RBD+AL)：每只小鼠每次免疫200微升RBD+AL溶液，所述RBD+AL溶液由PBS、10微克RBD蛋白(实施例1中制备得到)和10微克氢氧化铝佐剂组成。
第三组(gp96+RBD)：每只小鼠每次免疫200微升gp96+RBD溶液，所述gp96+RBD溶液由PBS、10微克RBD蛋白(实施例1中制备得到)、30微克gp96蛋白(实施例1中制备得到)组成。
第四组(gp96-RBD)：每只小鼠每次免疫200微升gp96-RBD融合蛋白溶液，所述gp96-RBD融合蛋白溶液由PBS和40微克gp96-RBD融合蛋白(实施例1中制备得到)组成。
2、抗体水平检测
分别取免疫后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月和6个月小鼠血清进行ELISA 检测，具体操作如下：每孔包被10ug RBD，4℃孵育过夜，然后用PBS-T清洗3遍，每遍清洗5min。将血清稀释，每孔加入100ul，共加3孔，检测IgG。37℃孵育2h，再用PBS-T清洗3遍，每遍清洗5min。每孔加入HRP标记的IgG抗体，37℃孵育1h。再用PBS-T清洗3遍，每遍清洗5min。每孔加入100ul的TMB显色液，37℃放置15min 后加入50ul的2M硫酸终止反应，最后在酶标仪上以波长450nm检测。
结果如图2所示，在小鼠免疫1-6个月内，相对于RBD+AL处理组和gp96+RBD处理组，gp96-RBD处理组的IgG表达量显著升高(P<0.01或0.001)。说明gp96-RBD处理组可诱导更强的抗体应答。
3、长效浆细胞水平检测
分别取免疫后3个月和6个月小鼠两侧大腿骨骨髓细胞进行长效浆细胞检测，具体操作如下：使用MSIPS4W10板，每孔包被0.5ug RBD，4℃孵育过夜，杀鼠取两侧大腿骨骨髓细胞，计数，加入完全培养基(10％FBS+DMEM)，每孔接入50万细胞，37℃培养16-24小时。用PBST洗板三次，加入100微升1：4000稀释的山羊抗小鼠IgG，室温孵育两小时。再用PBST洗板三次，配置AEC显色液，每孔加入100微升显色液显色 10分钟。最后用去离子水冲洗干净后进行斑点技术。
结果如图3所示，在小鼠免疫后3个月、6个月时，相对于RBD+AL处理组和 gp96+RBD处理组，gp96-RBD处理组RBD抗体特异性浆细胞显著增多(P<0.0001)，且维持时间较长。说明gp96-RBD处理组可诱导产生更强的长效浆细胞水平。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> gp96-RBD融合蛋白及其相关生物材料在活化长效浆细胞中的应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1027
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Ala Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
1 5 10 15
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser
20 25 30
Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
35 40 45
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
50 55 60
Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
85 90 95
Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
100 105 110
Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val
115 120 125
Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu
130 135 140
Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
145 150 155 160
Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln
165 170 175
Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg
180 185 190
Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys
195 200 205
Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
Asn Phe Asn Gly Glu Phe Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Met Asp Asp Glu Val Asp Val Asp Gly Thr Val Glu Glu Asp Leu Gly
245 250 255
Lys Ser Arg Glu Gly Ser Arg Thr Asp Asp Glu Val Val Gln Arg Glu
260 265 270
Glu Glu Ala Ile Gln Leu Asp Gly Leu Asn Ala Ser Gln Ile Arg Glu
275 280 285
Leu Arg Glu Lys Ser Glu Lys Phe Ala Phe Gln Ala Glu Val Asn Arg
290 295 300
Met Met Lys Leu Ile Ile Asn Ser Leu Tyr Lys Asn Lys Glu Ile Phe
305 310 315 320
Leu Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ala Ser Asp Ala Leu Asp Lys Ile Arg
325 330 335
Leu Ile Ser Leu Thr Asp Glu Asn Ala Leu Ser Gly Asn Glu Glu Leu
340 345 350
Thr Val Lys Ile Lys Cys Asp Lys Glu Lys Asn Leu Leu His Val Thr
355 360 365
Asp Thr Gly Val Gly Met Thr Arg Glu Glu Leu Val Lys Asn Leu Gly
370 375 380
Thr Ile Ala Lys Ser Gly Thr Ser Glu Phe Leu Asn Lys Met Thr Glu
385 390 395 400
Ala Gln Glu Asp Gly Gln Ser Thr Ser Glu Leu Ile Gly Gln Phe Gly
405 410 415
Val Gly Phe Tyr Ser Ala Phe Leu Val Ala Asp Lys Val Ile Val Thr
420 425 430
Ser Lys His Asn Asn Asp Thr Gln His Ile Trp Glu Ser Asp Ser Asn
435 440 445
Glu Phe Ser Val Ile Ala Asp Pro Arg Gly Asn Thr Leu Gly Arg Gly
450 455 460
Thr Thr Ile Thr Leu Val Leu Lys Glu Glu Ala Ser Asp Tyr Leu Glu
465 470 475 480
Leu Asp Thr Ile Lys Asn Leu Val Lys Lys Tyr Ser Gln Phe Ile Asn
485 490 495
Phe Pro Ile Tyr Val Trp Ser Ser Lys Thr Glu Thr Val Glu Glu Pro
500 505 510
Met Glu Glu Glu Glu Ala Ala Lys Glu Glu Lys Glu Glu Ser Asp Asp
515 520 525
Glu Ala Ala Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Lys Pro Lys Thr Lys
530 535 540
Lys Val Glu Lys Thr Val Trp Asp Trp Glu Leu Met Asn Asp Ile Lys
545 550 555 560
Pro Ile Trp Gln Arg Pro Ser Lys Glu Val Glu Glu Asp Glu Tyr Lys
565 570 575
Ala Phe Tyr Lys Ser Phe Ser Lys Glu Ser Asp Asp Pro Met Ala Tyr
580 585 590
Ile His Phe Thr Ala Glu Gly Glu Val Thr Phe Lys Ser Ile Leu Phe
595 600 605
Val Pro Thr Ser Ala Pro Arg Gly Leu Phe Asp Glu Tyr Gly Ser Lys
610 615 620
Lys Ser Asp Tyr Ile Lys Leu Tyr Val Arg Arg Val Phe Ile Thr Asp
625 630 635 640
Asp Phe His Asp Met Met Pro Lys Tyr Leu Asn Phe Val Lys Gly Val
645 650 655
Val Asp Ser Asp Asp Leu Pro Leu Asn Val Ser Arg Glu Thr Leu Gln
660 665 670
Gln His Lys Leu Leu Lys Val Ile Arg Lys Lys Leu Val Arg Lys Thr
675 680 685
Leu Asp Met Ile Lys Lys Ile Ala Asp Asp Lys Tyr Asn Asp Thr Phe
690 695 700
Trp Lys Glu Phe Gly Thr Asn Ile Lys Leu Gly Val Ile Glu Asp His
705 710 715 720
Ser Asn Arg Thr Arg Leu Ala Lys Leu Leu Arg Phe Gln Ser Ser His
725 730 735
His Pro Thr Asp Ile Thr Ser Leu Asp Gln Tyr Val Glu Arg Met Lys
740 745 750
Glu Lys Gln Asp Lys Ile Tyr Phe Met Ala Gly Ser Ser Arg Lys Glu
755 760 765
Ala Glu Ser Ser Pro Phe Val Glu Arg Leu Leu Lys Lys Gly Tyr Glu
770 775 780
Val Ile Tyr Leu Thr Glu Pro Val Asp Glu Tyr Cys Ile Gln Ala Leu
785 790 795 800
Pro Glu Phe Asp Gly Lys Arg Phe Gln Asn Val Ala Lys Glu Gly Val
805 810 815
Lys Phe Asp Glu Ser Glu Lys Thr Lys Glu Ser Arg Glu Ala Val Glu
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Lys Glu Phe Glu Pro Leu Leu Asn Trp Met Lys Asp Lys Ala Leu Lys
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- 由壳聚糖酶和几丁质酶融合而成的抗真菌融合蛋白及其相关生物材料与应用
- AMHR2重组蛋白或融合蛋白在制备AMH信号轴异常活化相关疾病治疗药物中的用途