附子多糖在制备治疗炎症性肠病和肠黏膜炎的药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及附子多糖在制备治疗炎症性肠病和肠黏膜炎的药物中的应用。

背景技术

附子为毛茛科植物乌头(AconitumCarmichaeliDexb)子根的加工品，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛之功，用于亡阳虚脱、肢冷脉微、阳萎、宫冷、心腹冷痛、虚寒吐泻、阴寒水肿等。《汤液本草》中提到：“附子，入手少阳三焦、命门之剂，浮中，无所不至，味辛大热，为阳中之阳”；《本草经读》也提到：“附子，味辛气温，火性迅发，无所不到，故为回阳救逆第一品药”；《本草纲目》记载：“附子性重滞，温脾逐寒”。现代常将附子用于慢性心功能不全、休克、风湿性关节炎、肠炎腹泻等疾病治疗。

附子中主要化学成分有生物碱、多糖、苷类等，国内外对附子的研究主要集中在生物碱类成分，对附子中的多糖的研究则较少。多糖是一类天然具有多种生理活性的高分子化合物，中药多糖已成为当今药物研究和保健品开发的重点方向之一。现有研究表明，附子多糖具有较强的生理活性，且无明显毒性，有调节免疫、抗肿瘤、保护心肌细胞、降血脂等作用，其高效低毒的特性已逐渐受到人们关注。

炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)包括溃疡性结肠炎(UlcerativeColitis,UC)和克罗恩病(Crohn's disease,CD)，是一组不明原因的慢性肠道炎症性疾病，因发病率逐渐升高，已成为我国常见的消化系统疾病，也被WHO列为现代难治病之一。目前临床主流治疗包括氨基水杨酸盐、皮质类固醇、免疫抑制剂和生物制剂等，但仍存在疗效有限、复发率高、治疗周期长、易产生耐药性等多方面问题，还常常伴有严重的副作用。因此，寻找更廉价且更低毒、高效、可口服给药的天然药物仍具有重要的临床价值。中医药具有毒副作用小、成本低、多靶点、多途径等优势，具有巨大的临床应用前景，因此在UC治疗领域进一步发掘高效低毒的中药及其有效成分并充分阐明其作用机制具有重要的社会和经济意义。

肠黏膜炎(Intestinal mucositis,IM)也被定义为消化道内衬黏膜炎症引起的结构、功能和免疫学变化。IM在临床上主要表现为腹泻、腹痛、便血、恶心呕吐等，还可能出现各种严重的并发症。这些症状的发作、发病的周期和临床的表现与患者的年龄、种族和性别等因素相关联，同时IM的症状取决于正在治疗的癌症的类型和病程。肠黏膜炎分为以下五期：起始期、原发性黏膜损伤期、炎症反应信号放大期、溃疡期和启动愈合期。细胞凋亡、炎症细胞因子、肠道菌群、直接细胞毒性和活性氧被认为是关键致病决定因素。

发明内容

为了解决上述炎症性肠病和肠黏膜炎治疗药物开发的技术问题，本发明提供了附子多糖在制备治疗炎症性肠病和肠黏膜炎的药物中的应用。本发明通过对附子多糖进行了一系列研究，发现附子多糖可以对肠道菌群进行调节，提供了附子多糖在制备治疗炎症性肠病和肠黏膜炎的药物中的应用，给出了附子多糖的一种新用途。

本发明的具体技术方案为：

本发明提供了附子多糖的一种新用途：附子多糖在制备治疗炎症性肠病或肠黏膜炎的药物中的应用。

本发明团队研究人员以最常用的哺乳动物模型小鼠模型对附子多糖进行一系列研究中，一方面，发现给溃疡性结肠炎小鼠喂食附子多糖，可显著抑制溃疡性结肠炎小鼠结肠的缩短和体重的减轻，显著改善DAI评分，并使损伤的结肠病理组织明显恢复；另一方面，发现给5-Fu诱导的肠黏膜炎小鼠喂食附子多糖，可减轻5-Fu诱导的肠黏膜炎小鼠的体重下降和结肠长度的缩短，改善肠黏膜炎小鼠的腹泻评分，并显著改善肠黏膜炎小鼠的症状和小肠、结肠的病理损伤。基于此，本发明团队研究人员对附子多糖治疗改善炎症性肠病和肠黏膜炎的机理进行了深入研究，通过对小鼠给食附子多糖，发现附子多糖可显著改善小鼠的肠道微生物多样性，同时，可改善肠道菌群紊乱，并使之趋于正常。

本发明团队研究人员以小鼠模型对附子多糖进行一系列研究，表明附子多糖可在制备治疗炎症性肠病和/或肠黏膜炎的药物中得到有效应用，提供了附子多糖的一种新用途。

本发明还提供了一种用于治疗炎症性肠病或肠黏膜炎的中药组合物，所述中药组合物包括附子多糖。

本发明还提供了包括附子多糖的一种用于治疗炎症性肠病或肠黏膜炎的中药组合物，基于本发明提供的附子多糖在制备治疗炎症性肠病和/或肠黏膜炎的药物中的一种新用途，本领域技术人员在知晓了附子多糖这一新用途后，可在不付出任何创造性劳动的情况下将之添加于中药组合物中，加以臣药，获取用于治疗炎症性肠病或肠黏膜炎的中药组合物。

附子多糖可加入药学可接受的辅料，制成下列之一的剂型：汤剂、茶剂、颗粒剂、普通片剂、分散片、泡腾片、口腔崩解片、含片、咀嚼片、胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、丸剂、散剂、滴丸剂、缓释制剂、控释制剂、口服液体制剂和注射剂。

具体地，本发明还给出了附子多糖的提取方法，包括以下步骤：

(1)按体积份数计，取附子粉末加入6～10倍量乙醇溶液，回流提取1-2小时，抽滤，取滤渣备用；

(2)按体积份数计，取步骤(1)的滤渣加入6～10倍量水，回流提取1～2小时后离心，上清液留用，滤渣重复回流提取、离心的操作2～3次，混合各次得到的上清液后浓缩至投料量的1～3倍，然后边搅拌加入2～5倍量的无水乙醇，静置，过滤，取滤饼干燥，得到附子多糖。

本发明通过醇沉水溶方法提取制备附子多糖，制备流程简单，操作简便。具体而言，步骤(1)通过醇液回流提取对附子粉末的脂类成分进行脱除，然后通过步骤(2)水中的回流，将附子多糖从附子中提取出来。本发明醇沉水溶方法，依次通过醇提和水提，可以在提取附子中的水溶性成分附子多糖的同时，分离醇溶性成分，如大多数脂类，可以获得纯度较高的提取物，有利于进一步的分离和纯化，同时，提取效率较高。

作为上述技术方案的优选，步骤(1)中，所述乙醇溶液的体积浓度为95％。

作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述浓缩的方法为减压浓缩。

作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述静置的时间为10～15小时，温度为0～5℃。

将上清液加入无水乙醇后，在温度为0～5℃下静置10～15小时，有利于提高分离效率和附子多糖的纯度。

同时，本发明还给出了上述附子多糖的纯化方法，包括以下步骤：

取附子多糖，加水溶解，然后加入二氯甲烷与正丁醇的混合溶液，离心，除去下层及中间层，重复操作4～7次，取得到的上层水溶液冷冻干燥，得到纯化附子多糖。

作为上述技术方案的优选，以体积计，所述水的加入量为附子多糖的2～3倍。

作为上述技术方案的优选，所述混合溶液中二氯甲烷与正丁醇的体积比5～4:1。

作为上述技术方案的优选，所述二氯甲烷与正丁醇的混合溶液与水的体积比为1:1～1.5。

与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

本发明以小鼠模型对附子多糖进行一系列研究，发现附子多糖可显著改善小鼠的肠道微生物多样性，同时，可改善肠道菌群紊乱，并使之趋于正常，并给出了附子多糖的一种新用途——在制备治疗炎症性肠病和肠黏膜炎的药物中的应用。比如，附子多糖用于溃疡性结肠炎小鼠模式的药物治疗，可显著抑制溃疡性结肠炎小鼠结肠的缩短和体重的减轻，显著改善DAI评分，并使损伤的结肠病理组织明显恢复；用于5-Fu诱导的肠黏膜炎小鼠模型的治疗，可减轻5-Fu诱导的肠黏膜炎小鼠的体重下降和结肠长度的缩短，改善肠黏膜炎小鼠的腹泻评分，并显著改善肠黏膜炎小鼠的症状和小肠、结肠的病理损伤。

本发明还给出了附子多糖的制备方法，通过醇液回流提取对附子粉末的脂类成分进行脱除，然后通过水中的回流，将附子多糖从附子中提取出来。本发明醇沉水溶方法，依次通过醇提和水提，可以在提取附子中的水溶性成分附子多糖的同时，分离醇溶性成分，如大多数脂类，可以获得纯度较高的提取物，有利于进一步的分离和纯化，同时，提取效率较高。

附图说明

图1为本发明实施例4中附子多糖的结构鉴定结果图；

图2为本发明实施例5中附子多糖对DSS诱导的UC小鼠的治疗作用结果图；

图3为本发明实施例6中附子多糖对5-氟尿嘧啶诱导的肠黏膜炎小鼠的治疗作用结果图；

图4为本发明实施例7中附子多糖对黏膜炎小鼠小肠及结肠病理性损伤的治疗结果图；

图5为本发明实施例8中差异微生物群落多样性分析结果图；

图6为本发明实施例8中菌群分析结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步的描述。

实施例1附子多糖的制备

1.1提取：

按体积份数计，附子粉末于提取瓶中加入8倍量95％乙醇溶液，回流提取1.5小时，抽滤；滤渣再加入8倍量95％乙醇溶液，继续回流提取1.5小时，抽滤，取滤渣备用。

取上述滤渣，加入8倍量水，回流提取1.5小时，离心，取上清液；重复此操作3次，合并3次上清液。

将上清液减压浓缩至投料量的2倍，边搅拌边加入3倍量的无水乙醇，4℃静置12小时，取出，过滤，滤饼干燥，得到附子粗多糖。

1.2纯化：

取步骤1.1得到的附子粗多糖，加水溶解，然后加入二氯甲烷与正丁醇体积比5:1的混合溶液，附子粗多糖、水、混合溶液的体积比为1:2:2，离心，除去下层有机层及中间层，重复操作6次至蛋白除净，得到上层水溶液冷冻干燥，得到附子多糖ACP。

实施例2附子多糖的制备

2.1提取：

按体积份数计，附子粉末于提取瓶中加入6倍量95％乙醇溶液，回流提取1小时，抽滤；滤渣再加入6倍量95％乙醇溶液，继续回流提取1小时，抽滤，取滤渣备用。

取上述滤渣，加入10倍量水，回流提取1小时，离心，取上清液；重复此操作4次，合并4次上清液。

将得到上清液减压浓缩至投料量的3倍，边搅拌边加入3倍量的无水乙醇，并不断搅拌，0℃静置15小时，取出，过滤，滤饼干燥，得到附子粗多糖。

2.2纯化：

取步骤2.1得到的附子粗多糖，加水溶解，然后加入二氯甲烷与正丁醇体积比5:1的混合溶液，附子粗多糖、水、混合溶液的体积比为1:2:3，离心，除去下层有机层及中间层，重复操作4次至蛋白除净，得到上层水溶液冷冻干燥，得到附子多糖ACP。

实施例3附子多糖的制备

3.1提取：

按体积份数计，附子粉末于提取瓶中加入10倍量95％乙醇溶液，回流提取2小时，抽滤，取滤渣备用。

取上述滤渣，加入6倍量水，回流提取2小时，离心，取上清液；重复此操作5次，合并5次上清液。

将得到上清液减压浓缩至投料量的2倍，边搅拌边加入5倍量的无水乙醇，并不断搅拌，5℃静置10小时，取出，过滤，滤饼干燥，得到附子粗多糖。

3.2纯化：

取步骤3.1得到的附子粗多糖，加水溶解，然后加入二氯甲烷与正丁醇体积比4:1的混合溶液，附子粗多糖、水、混合溶液的体积比为1:3:3，离心，除去下层有机层及中间层，重复操作7次至蛋白除净，得到上层水溶液冷冻干燥，得到附子多糖ACP。

实施例4附子多糖的结构鉴定

对实施例1制备得到的附子多糖进行FT-IR光谱、单糖组成图谱、色谱、HPGP谱分析，结果见图1，其中，A为ACP的FT-IR光谱，B为ACP的单糖组成图谱，C为单糖标准品的色谱图，D为ACP的HPGP谱。表1总结了峰的属性。

如图1AFT-IR光谱显示，ACP在3432.67、2929.34和1633.41cm

表1FT-IR吸收光谱中峰的属性

表2 ACP的单糖组成

实施例5 ACP对DSS诱导的UC小鼠体重变化、DAI评分和病理损伤的影响

实验方法：30只(20±2g)雄性C57BL/6SPF小鼠，每组6只，随机分为5组：对照组、模型组、SASP组(SASP给药200mg/kg)、ACP组(ACP给药50mg/kg)和ACP组(ACP给药100mg/kg)。除对照组外，所有小鼠均自由饮用3％DSS溶液7天以诱导UC。同时相应的药物按0.1mL/10g给药量每日灌胃2次，连续给药7天。每日记录小鼠体重、大便及其他异常情况，盲法获得疾病活动指数(DAI)评分。第8天处死小鼠进行颈椎脱位解剖取样。对结肠进行分离、拍照和称重(单位：克)。取出结肠内容物，将结肠一分为二。一部分立即在液氮中冷冻，另一部分用4％多聚甲醛固定，包埋、切片、染色并在显微镜下拍照。观察水肿、粘连、溃疡、坏死等病理改变，评估组织学评分。

实验结果：实验结果如图2所示，其中A为结肠长度变化曲线，B为体重变化曲线，C为DAI变化曲线，D为结肠切片H&E染色的代表性图片，E为结肠切片形态学评分。每个点表示为平均值±标准差(n＝6)。与对照组相比，

由图2A和图2B可知，ACP能显著抑制小鼠结肠的缩短和体重的减轻，尤其是ACP组(ACP给药100mg/kg)；由图2C可知，ACP显著改善了DAI评分；图2D和E表明ACP可使损伤的结肠病理组织显著恢复。综上所述，ACP可显著改善UC小鼠的症状和结肠的病理损伤。

实施例6ACP对5-Fu诱导的肠黏膜炎小鼠的治疗作用实验方法：SPF级C57BL/6小鼠，购自浙江省实验动物中心，雄性，体重：18～22g。24只C57BL/6小鼠，适应性喂养1周后，随机分为4组，每组6只：对照组，模型组，ACP 50mg/kg组和ACP 100mg/kg组。除对照组外，所有小鼠自由饮用5-FU(25mg/mL)溶液4天以诱导IM。在整个4天内，以10μL·g-1体重的体积经胃给药，早晚各一次。首次造模24h后观察并记录小鼠腹泻情况，腹泻的程度可以通过腹泻评分来衡量。第5天处死小鼠后，立即收集回肠和结肠组织，然后用4％缓冲多聚甲醛固定。其中，ACP 50mg/kg组为50mg/kg给药量给药ACP，ACP 100mg/kg组为100mg/kg给药量给药ACP。

实验结果：实验结果如图3所示，其中A为小鼠体重变化曲线，B为结肠形态变化的代表性图片，C为结肠长度变化曲线，D为腹泻指数统计结果。每个点表示为平均值±标准差(n＝6)。与对照组相比，

由图3A可知，ACP(50和100mg/kg)组可减轻5-Fu诱导的肠黏膜炎小鼠的体重下降；由图3B和C可知，ACP(50和100mg/kg)组可抑制结肠长度的缩短；由图3D可知，ACP(50和100mg/kg)组可显著改善了小鼠的腹泻评分。综上所述，ACP(50和100mg/kg)可显著改善肠黏膜炎小鼠的症状和小肠、结肠的病理损伤。

实施例7ACP对5-Fu诱导的肠黏膜炎小鼠回肠和结肠组织的改善作用实验方法：小鼠处理同“实验例6”，颈椎脱位后将所有小鼠的结肠组织分离、测量并尽快拍照，取出结肠内容物，将结肠一分为二。一部分立即在液氮中冷冻，另一部分用4％多聚甲醛固定，包埋石蜡包埋后切成5μm厚切片，用苏木素-伊红(HE)染色。在光学显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)下拍摄各肠段图像(放大20倍)。测量绒毛和隐窝，计算回肠绒毛高度(VH)和结肠隐窝深度(CD)，并分析样本病理损伤情况。评估水肿、粘连、溃疡、坏死等病理改变，评估组织学评分。

实验结果：实验结果如图4所示，其中，A为实施例6中4组小鼠的小肠切片H&E染色的代表性图片，B为小鼠的结肠切片H&E染色的代表性图片，C为回肠绒毛高度，D为回肠隐窝深度，E为结肠隐窝深度。每个点表示为平均值±标准差(n＝6)。与对照组相比，

由图4A和图4B所示，对照组小鼠回肠和结肠未出现任何炎性细胞浸润现象，隐窝结构保持完整且排列有序，未发现炎症细胞的浸润，隐窝结构保持完整，排列规律有序；模型组小鼠的小肠和结肠组织中，上皮细胞坏死，隐窝结构被破坏，大量浸润的炎症细胞浸润到粘膜层中；与模型组相比，ACP(50，100mg/kg)组表现出较少的炎症细胞浸润，组织结构更完整，细胞排列更规则，回肠和结肠上皮细胞和隐窝的形态和分布得到恢复。由图4C所示，模型组小鼠回肠绒毛高度显著降低，ACP组小鼠回肠绒毛高度明显恢复。由图4D和图4E所示，模型组小鼠回肠和结肠隐窝深度显著降低，ACP组小鼠隐窝深度明显恢复。综上所述，ACP可以修复5-FU诱导的肠黏膜损伤，改善了肠黏膜炎的组织病理学评分。

实施例8ACP调节5-Fu诱导的肠黏膜炎小鼠肠道微生物群紊乱

实验方法：

①DNA提取：使用E.Z.N.A.粪便DNA试剂盒提取实施例6的4组小鼠DNA，使用50μL洗脱缓冲液洗脱总DNA进行PCR检测。

②PCR扩增和16srdna测序：使用引物341F(5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3')和805R(5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3')(其中，N、W、H和V是兼并碱基，分别代表N:A/T/C/G；W:A/T；H:A/T/C；V:G/A/C)扩增16S rRNA基因的V4区域。使用25ng模板DNA、12.5μLPCR预混料和2.5μL每个引物进行PCR扩增。

③数据分析：样本在Illumina HiSeq平台上测序。使用FLASH(版本1.2.8)分配、截断和合并成对的结束读取。筛选嵌合序列，并使用Vsearch软件(v2.3.4)将97％的相似性分配给相同的操作分类单元(OTU)。为每个OTU选择代表性序列，并使用核糖体数据库项目(RDP)分类器将分类数据分配给每个代表性序列。使用mafft软件(V7.310)确定不同类群中优势种的差异。

实验结果：实验结果如图5～6及表3～5所示。图5为差异微生物群落多样性分析的结果，其中A为Plelou_e曲线图，B为Observed_otus曲线图，C为Shannon曲线图，D为Chao1曲线图，E为Simpson曲线图，F为Goods_coverage曲线图。图6为菌群分析结果，其中A为维恩图，B为主成分分析图，C为主坐标分析图，D为非度量多维标度图，E为肠道菌群在门水平的变化聚类分析，F为肠道菌群在属水平的聚类分析。

(1)由图5A和表3可知，与对照组相比，5-Fu抑制了微生物丰富度。由图5B可知，观察到的物种指数结果显示，对照组和模型组之间的α多样性降低，ACP(50mg/kg)可以在一定程度上改善肠道菌群的多样性。由图5C、(图5D、图5E可知，ACP(50mg/kg)可以在一定程度上改善肠道菌群的多样性，Goods_coverage亦达到了平台。这些结果表明，ACP(50mg/kg)能显著改善5-Fu诱导的肠黏膜炎小鼠的肠道微生物多样性。

表3α-多样性分析结果

(2)由图6A维恩图显示，所有组中有537个OTU重叠，而对照组和模型组中有711个OTU重叠，对照组和ACP组中有729个OTU重叠；另外，对照组、模型组和ACP组单独的OTU数目分别为1666，722和786个，提示ACP可在一定程度上改善菌群多样性。由主成分分析(图6B)、主坐标分析(图6C)和非度量多维标度(NMDS)(图6D)的结果均表明，对照组和模型组之间的孤立簇分离较为明显，表明OTU的差异很大。然而，ACP组倾向于对照组，提示ACP可在一定程度上改善肠道菌群紊乱趋于正常。由图6E可知，另外，模型组和对照组在门水平上和属水平上均出现显著的变化，而ACP逆转了上述变化。表4及表5显示出ACP可在门和属水平显著改善5-FU导致的多种菌群的变化，表明ACP显著改善了IM小鼠的肠道菌群紊乱。

表4在门(p_)水平上的聚类分析结果

表5在属(g_)水平上的聚类分析结果

本发明以小鼠模型对附子多糖进行一系列研究，发现附子多糖可显著改善小鼠的肠道微生物多样性，同时，可改善肠道菌群紊乱，并使之趋于正常，并给出了附子多糖的一种新用途——在制备治疗炎症性肠病和肠黏膜炎的药物中的应用。比如，附子多糖用于溃疡性结肠炎小鼠模式的药物治疗，可显著抑制溃疡性结肠炎小鼠结肠的缩短和体重的减轻，显著改善DAI评分，并使损伤的结肠病理组织明显恢复；用于5-Fu诱导的肠黏膜炎小鼠模型的治疗，可减轻5-Fu诱导的肠黏膜炎小鼠的体重下降和结肠长度的缩短，改善肠黏膜炎小鼠的腹泻评分，并显著改善肠黏膜炎小鼠的症状和小肠、结肠的病理损伤。

基于本发明提供的附子多糖在制备治疗炎症性肠病和/或肠黏膜炎的药物中的一种新用途，本领域技术人员在知晓了附子多糖这一新用途后，可在不付出任何创造性劳动的情况下将之添加于中药组合物中，加以臣药，获取用于治疗炎症性肠病或肠黏膜炎的中药组合物。

本发明所用95％乙醇溶液为体积分数为95％的乙醇溶液。

本发明实施例5～8所用附子多糖是本发明提取、纯化后经过结构确证的附子多糖。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。