一种干细胞冻存保护剂

技术领域

本发明涉及干细胞冻存领域，具体涉及一种干细胞冻存保护剂。

背景技术

干细胞功能较多，应用广泛，主要是进行细胞移植治疗，亦可作为一种理想的靶细胞用于基因治疗，同时在生物组织工程和免疫治疗中也有一定的应用。

目前，在干细胞冻存技术上，多采用二甲亚砜(10％)和胎牛血清蛋白(90％)的冻存液冷冻保存干细胞，同时也在开发其他合适的冻存液组分。但是，这些冷冻剂中高浓度组分的细胞毒性作用，如二甲亚砜不利于细胞的恢复，1，2-丙二醇、甘油替换二甲亚砜作为冷冻液，虽然降低了毒性，但是冻存效果比不上二甲亚砜，而且长时间的冻存干细胞的存活率较低。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种干细胞冻存保护剂。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种干细胞冻存保护剂，所述干细胞冻存保护剂包括自组装聚肽、半乳糖、山梨糖醇、1,2-丙二醇、二甲亚砜和胎牛血清蛋白；

所述干细胞冻存保护剂中各组分的比例如下：

所述1,2-丙二醇、二甲亚砜和胎牛血清蛋白的体积比为(2～5)：(0.5～1)：100；

所述自组装聚肽为聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)；所述自组装聚肽的浓度为0.3～1g/L；

所述半乳糖的浓度为0.1～0.3mol/L；

所述山梨糖醇的质量浓度为3w/v％～5w/v％。

发明人在研究干细胞冻存保护剂组分过程中，制备了自组装聚肽胶束，即聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)，自组装聚肽胶束共聚物自组装形成了碗状核壳型粒子，聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)组装体中，较为亲水的聚γ-苄基-L-谷氨酸酯或聚γ-苄基-L-天门冬氨酸酯或聚乙二醇-L-谷氨酸酯、聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯刚性链段形成了外壳，较为疏水的聚苯乙烯链段形成了内核。聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)内部的有机溶剂向外扩散，而水不能进入胶束内核，因此聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)胶束发生塌缩形成纳米碗，在有机溶剂向外扩散时，胶束形貌不易变形。将聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)应用在干细胞冻存保护剂中，避免了水分进入，而且可以使得多余的有机溶剂扩散出来，减少了冻存时有机溶剂、水的结冰而刺破细胞膜，可以更好的提高存活率，半乳糖、山梨糖醇能够调节干细胞内外的渗透压平衡，配合聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)胶束的作用，调节1,2-丙二醇、二甲亚砜的扩散，将干细胞、1,2-丙二醇、二甲亚砜、半乳糖、山梨糖醇保护在聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)胶束内部，并且通过扩散排除多余的1,2-丙二醇、二甲亚砜更好的调节干细胞内外的渗透压平衡，在冻存过程中，使得多余的1,2-丙二醇、二甲亚砜扩散排除，避免了有机溶剂结冰而刺破细胞膜。上述的干细胞冻存保护剂，能够延长干细胞冻存时间和冻存后干细胞的存活率。

优选地，所述聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)的化学结构如式Ⅰ所示：

其中，a为50～80的整数，b为70～120的整数，c为50～100的整数，x为大于零的整数，y为大于零的整数，z

将聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)应用在冻存剂中，聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)内部的有机溶剂向外扩散，而水不能进入胶束内核，因此聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)胶束发生塌缩形成纳米碗，在有机溶剂向外扩散时，胶束形貌不易变形。将聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)应用在干细胞冻存保护剂中，避免了水分进入，而且可以使得多余的有机溶剂扩散出来，减少了冻存时有机溶剂、水的结冰而刺破细胞膜，可以更好的提高存活率。且通过研究发现，a为50～80的整数，b为70～120的整数，c为50～100的整数时，疏水性的聚苯乙烯、亲水性的聚谷氨酸酯、亲水性的聚天门冬氨酸酯的链段比例使得胶束的结构更趋近碗型，在有机溶剂向外扩散时，胶束形貌不易变形，水不能进入胶束内核，搭配半乳糖、山梨糖醇、1,2-丙二醇、二甲亚砜更好的调节干细胞内外的渗透压平衡，延长干细胞冻存时间和冻存后干细胞的存活率。

优选地，30≤x+y≤50。

聚乙二醇酯化亲水性的聚谷氨酸酯、亲水性的聚天门冬氨酸酯的链段，使得碗型胶束的聚谷氨酸酯、聚天门冬氨酸酯的链段延伸，且30≤x+y≤50时，聚乙二醇酯化的比例使得有机溶剂更易向外扩散时，胶束形貌不易变形，水不能进入胶束内核，搭配半乳糖、山梨糖醇、1,2-丙二醇、二甲亚砜更好的调节干细胞内外的渗透压平衡，延长干细胞冻存时间和冻存后干细胞的存活率。

优选地，所述聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)的制备方法包括以下步骤：

(1)制备聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯)；

(2)将聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯)与聚乙二醇单甲醚进行酯化反应，得到聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L天门冬氨酸酯)。

优选地，制备聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯)的方法包括以下步骤：

(a)将胺基封端聚苯乙烯、谷氨酸5-苄酯N-羧基环内酸酐、L-天冬氨酸-4-苄酯-N-羧基环内酸酐在二氧六环溶剂中溶解；

(b)在氮气保护下，于15～17℃搅拌反应60～84小时进行阴离子聚合反应，经超纯水透析后冷冻干燥得到聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯)。

优选地，所述谷氨酸5-苄酯N-羧基环内酸酐和L-天冬氨酸-4-苄酯-N-羧基环内酸酐的摩尔比为(70～120)：(50～100)，所述胺基封端聚苯乙烯的质量用量为：谷氨酸5-苄酯N-羧基环内酸酐和L-天冬氨酸-4-苄酯-N-羧基环内酸酐的总质量是胺基封端聚苯乙烯质量的5～15倍；胺基封端聚苯乙烯的平均分子量为5000～12000，步骤(b)中超纯水透析的时间为60～84小时。

优选地，所述步骤(2)中，将聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯)溶解在1,2-二氯乙烷中，浓度为10～15g/L，于50～60℃搅拌，依次加入催化剂对甲苯磺酸和聚乙二醇单甲醚，继续于50～60℃搅拌反应18～30小时，经N，N-二甲基甲酰胺和超纯水透析后冷冻干燥得到所述聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)。

优选地，N，N-二甲基甲酰胺透析的时间为60～84小时，超纯水透析的时间为60～84小时。

优选地，所述聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯)与聚乙二醇单甲醚的质量用量比例为1：(5～20)。

优选地，所述聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯)与聚乙二醇单甲醚的质量用量比例为1：(8～10)。

优选地，所述干细胞冻存保护剂中，所述自组装聚肽的浓度为0.5～0.8g/L。

通过研究发现，干细胞冻存保护剂中，自组装聚肽的浓度为0.5～0.8g/L时，搭配半乳糖、山梨糖醇、1,2-丙二醇、二甲亚砜更好的调节干细胞内外的渗透压平衡，延长干细胞冻存时间和冻存后干细胞的存活率。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种干细胞冻存保护剂，本发明的干细胞冻存保护剂将自组装聚肽与半乳糖、山梨糖醇、1,2-丙二醇、二甲亚砜搭配，自组装聚肽胶束，即聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)，自组装聚肽胶束共聚物自组装形成了碗状核壳型粒子，聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)组装体中，较为亲水的聚γ-苄基-L-谷氨酸酯或聚γ-苄基-L-天门冬氨酸酯或聚乙二醇-L-谷氨酸酯、聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯刚性链段形成了外壳，较为疏水的聚苯乙烯链段形成了内核。聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)内部的有机溶剂向外扩散，而水不能进入胶束内核，因此聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)胶束发生塌缩形成纳米碗，在有机溶剂向外扩散时，胶束形貌不易变形。将聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)应用在干细胞冻存保护剂中，避免了水分进入，而且可以使得多余的有机溶剂扩散出来，减少了冻存时有机溶剂、水的结冰而刺破细胞膜，可以更好的提高存活率，半乳糖、山梨糖醇能够调节干细胞内外的渗透压平衡，配合聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)胶束的作用，调节1,2-丙二醇、二甲亚砜的扩散，将干细胞、1,2-丙二醇、二甲亚砜、半乳糖、山梨糖醇保护在聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)胶束内部，并且通过扩散排除多余的1,2-丙二醇、二甲亚砜更好的调节干细胞内外的渗透压平衡，在冻存过程中，使得多余的1,2-丙二醇、二甲亚砜扩散排除，避免了有机溶剂结冰而刺破细胞膜。上述的干细胞冻存保护剂，能够延长干细胞冻存时间和冻存后干细胞的存活率。

附图说明

图1为本发明实施例的干细胞冻存保护剂中自组装聚肽的合成路径示意图。

图2为本发明实施例的干细胞冻存保护剂冷冻实验效果图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

作为本发明实施例的一种干细胞冻存保护剂，包括自组装聚肽、半乳糖、山梨糖醇、1,2-丙二醇、二甲亚砜和胎牛血清蛋白；

所述干细胞冻存保护剂中各组分的比例如下：

所述1,2-丙二醇、二甲亚砜和胎牛血清蛋白的体积比为3：0.8：100；

自组装聚肽为聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)；自组装聚肽的浓度为0.5g/L；

所述半乳糖的浓度为0.2mol/L；

所述山梨糖醇的质量浓度为4w/v％。

所述聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)的化学结构如式Ⅰ所示：

其中，a为50～80的整数，b为70～120的整数，c为50～100的整数，x为大于零的整数，y为大于零的整数，30≤x+y≤50，z

本实施例的聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)的制备流程如图1所示，制备方法包括以下步骤：

(1)制备聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯)；(a)将1g胺基封端聚苯乙烯，胺基封端聚苯乙烯购自阿拉丁，平均Mn为10000，PDI≤1.3、0.015mol谷氨酸5-苄酯N-羧基环内酸酐、0.01mol的L-天冬氨酸-4-苄酯-N-羧基环内酸酐在400mL的二氧六环溶剂中溶解；(b)在氮气保护下，于16℃搅拌反应72小时进行阴离子聚合反应，经超纯水透析72小时后冷冻干燥得到聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯)，制备得到的聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯)的产量为4.38g；

(2)将0.6g聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯)溶解在50mL的1,2-二氯乙烷中，于55℃搅拌，依次加入0.5g催化剂对甲苯磺酸和4.8g聚乙二醇550单甲醚，数均分子量(聚合度)分别为550(12)，继续于55℃搅拌反应24小时，经N，N-二甲基甲酰胺透析72小时和超纯水透析72小时后冷冻干燥得到所述聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)。制备过程中透析使用的透析带截留分子量为3500。

经过凝胶渗透色谱(GPC)：美国Varian公司，PL-GPC 50plus型，以含有0.02mol/L溴化锂的DMF为淋洗液，流动速率0.8mL/min，柱压3.8MPs，样品质量浓度1g/L，测定温度50℃，测定步骤(1)得到的聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯)分子量及其分布，平均分子量为71.6×10

实施例2

作为本发明实施例的一种干细胞冻存保护剂，本实施例与实施例1的区别为：聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)与实施例1不同，具体为制备原料胺基封端聚苯乙烯不同，本实施例的胺基封端聚苯乙烯购自阿拉丁，平均Mn为5000，PDI≤1.1。

步骤(1)得到的聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯)平均分子量为70.8×10

实施例3-4

作为本发明实施例的一种干细胞冻存保护剂，实施例3-4与实施例1的区别为：聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)与实施例1不同，具体为制备原料胺基封端聚苯乙烯，谷氨酸5-苄酯N-羧基环内酸酐、L-天冬氨酸-4-苄酯-N-羧基环内酸酐的用量比例不同。如表1所示。

实施例3的步骤(1)得到的聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯)平均分子量为72.3×10

实施例4的步骤(1)得到的聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯)平均分子量为70.2×10

实施例5

作为本发明实施例的一种干细胞冻存保护剂，本实施例与实施例1的区别为：用聚乙二醇750单甲醚替换实施例1的聚乙二醇550单甲醚，聚乙二醇750单甲醚的数均分子量(聚合度)分别为750(16)。

测定步骤(1)得到的聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯)分子量及其分布，平均分子量为71.4×10

实施例6

作为本发明实施例的一种干细胞冻存保护剂，本实施例与实施例1的区别为：自组装聚肽的浓度为0.8g/L。

对照组

配置对照组干细胞冻存保护剂作为实验参照，对照组的干细胞冻存保护剂与实施例1的唯一区别为：1,2-丙二醇、二甲亚砜和胎牛血清蛋白的体积比为10：0.8：100。

对比例1

作为本发明对比例的一种干细胞冻存保护剂，本对比例与实施例1的唯一区别为：干细胞冻存保护剂中，用聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯)替换聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)。

对比例2

作为本发明对比例的一种干细胞冻存保护剂，本对比例与实施例1的唯一区别为：干细胞冻存保护剂中，用聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)替换聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)。

聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)化学结构如Ⅱ所示；其中，a为50～80的整数，b为100～200的整数，x为30～50的整数，z为5～20的整数；

如式Ⅱ所示聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)的制备方法参照实施例1，与实施例1的区别为：步骤(1)中加入0.025mol谷氨酸5-苄酯N-羧基环内酸酐，不加入L-天冬氨酸-4-苄酯-N-羧基环内酸酐，其余条件保持不变。

测定步骤(1)得到的聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)的分子量及分布，平均分子量为72.5×10

对比例3

作为本发明对比例的一种干细胞冻存保护剂，本对比例与实施例1的唯一区别为：干细胞冻存保护剂中，用聚-γ-苄基-L-谷氨酸，摩尔重量为70000～150000，购自阿拉丁，替换聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)。

对比例4

作为本发明对比例的一种干细胞冻存保护剂，本对比例与实施例1的唯一区别为：干细胞冻存保护剂不包含半乳糖。

实验例

一、冷冻保存试验

1、实验材料：

人源脐带间充质干细胞株(HUCMSC)购自于美国Sciencell公司。

(1)细胞复苏：将保存于液氮中的脐带间充质干细胞冻存管取出，37℃恒温水浴解冻，用移液器将其转入含5ml PBS的15ml离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清液，加入8mlMSC专用培养基，接种于10cm培养皿中，转入37℃、5％CO

(2)细胞传代：当培养皿中细胞生长至90％融合的状态下，进行扩增传代，PBS润洗细胞，清除漂浮细胞和碎片，0.25％的胰蛋白酶消化处理，显微镜下观察，当细胞间隙增大，皱缩变圆时，用二倍于胰蛋白酶体积的培养基进行终止消化，收集悬浮细胞转移至15ml离心管中，离心处理5min，弃去上清液，培养基重悬细胞，按1：4比例进行传代培养；

(3)传代至第4代的间充质干细胞稳定性及免疫调节性最高，用于后续冷冻实验。

2、冷冻实验

将脐带间充质干细胞分别加入1mL实施例1-6、对照组、对比例1-4的干细胞冻存保护剂中，调整细胞浓度为5×10

3、解冻程序

冷冻储存30天后、或180天后的细胞样品分别以2℃/min的升温速率升温至-20℃，放入0℃冰水混合物中解冻20分钟，在37℃恒温培养箱解冻45分钟。

4、冷冻细胞存活率测试

冷冻保存细胞之前和之后使用流式评估细胞存活率。

流式评估细胞存活率，分析冷冻保存后的细胞存活率使用流式细胞仪。将100μl细胞等分试样重悬于添加100μg/ml培养液(DMSO(10％V)和胎牛血清蛋白(90％))。孵化后在室温下孵育3分钟，样品在流式细胞仪上运行，激光激发波长为488nm。

使用574/526nm带通滤波器收集发射。门控是对PI阴性(未处理)细胞和冷冻的细胞分别在含有150mM NaCl的100μg/ml培养液(DMSO(10％V)和胎牛血清蛋白(90％))中进行高电导率电穿孔。测量结果在获取10000个事件时完成。获得的数据使用Attune NxT软件进行分析，其中冷冻细胞存活率通过荧光强度直方图评估。

5、实验结果如表1所示。

由表1可知，通过对比实施例与对比例的干细胞冻存保护剂的冷冻效果，说明将聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)应用在干细胞冻存保护剂中，避免了水分进入，而且可以使得多余的有机溶剂扩散出来，减少了冻存时有机溶剂、水的结冰而刺破细胞膜，可以更好的提高存活率，半乳糖、山梨糖醇能够调节干细胞内外的渗透压平衡，配合聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)胶束的作用，调节1,2-丙二醇、二甲亚砜的扩散，将干细胞、1,2-丙二醇、二甲亚砜、半乳糖、山梨糖醇保护在聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)胶束内部，并且通过扩散排除多余的1,2-丙二醇、二甲亚砜更好的调节干细胞内外的渗透压平衡，在冻存过程中，使得多余的1,2-丙二醇、二甲亚砜扩散排除，避免了有机溶剂结冰而刺破细胞膜，提高了干细胞冻存后的存活率。通过比较实施例1和对比例1、对比例2，说明聚乙二醇链段的延伸，可以延长聚合物的支链，有利于扩散有机溶剂和防止水分，进而提升了干细胞冻存保护剂的冷冻干细胞的存活率。且聚谷氨酸酯、聚天门冬氨酸酯的链段搭配，由于谷氨酸酯、天门冬氨酸酯链段亲水性的差异，能够更好的作用水分和有机溶剂，应用在干细胞冻存保护剂中时，提升了冷冻干细胞的存活率。

通过对比实施例1与对照组的实验结果，对照组的1,2-丙二醇的含量更高，冻存后干细胞冻存后的存活率基本保持一致，可以说明在聚苯乙烯-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯-co-聚乙二醇-L-谷氨酸酯)-b-聚(γ-苄基-L-天门冬氨酸酯-co-聚乙二醇-L-天门冬氨酸酯)与冻存剂中的有机溶剂1,2-丙二醇、二甲亚砜搭配冻存时，可以使得多余的有机溶剂扩散出来，多余的有机溶剂1,2-丙二醇、二甲亚砜基本不影响干细胞冻存保护剂的冷冻效果。

通过横向对比实施例与对比例的干细胞冻存保护剂冷冻30天、冷冻180天后干细胞的存活率，可以发现，实施例的干细胞冻存保护剂冷冻后，冷冻180天与冷冻30天相比，干细胞的存活率略微下降，但是下降的幅度很小。而对比例的干细胞冻存保护剂冷冻后，冷冻180天与冷冻30天相比，细胞存活率又产生了明显的下降，说明实施例的干细胞冻存保护剂能够延长冷冻保存的时间和周期，同时保持较高的细胞存活率，对比例1、对比例2的下降幅度小于对比例3和对比例4。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。