基于免疫治疗疗效与毒性关系的免疫调节基因分类方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及一种基于免疫治疗疗效与毒性关系的免疫调节基因分类方法。

背景技术

免疫治疗，尤其是靶向程序性死亡受体(programmed death-1，PD-1)及其配体(programmed death-ligand 1，PD-L1)的免疫检查点阻断(immune checkpoint blockade，ICB)治疗，已成为多种晚期肿瘤的二线、甚至一线治疗模式。然而，随着ICB在临床上的广泛应用，越来越多的免疫相关不良事件(immune-related adverse event，irAE)被报道。ICB治疗在激活抗肿瘤免疫的同时，也常可偶联全身各器官系统的炎症性副作用，诱发结肠炎、肺炎、心肌炎等毒性反应，其中重度irAE将导致患者被迫停药甚至导致患者死亡。

临床实践中PD-L1、微卫星不稳定(microsatellite Instability，MSI)、肿瘤突变负荷(tumor mutation burden，TMB)已先后获批成为免疫治疗的生物标志物并广泛用于肿瘤患者的临床决策中。此外，基因组变异、肿瘤微环境、器官特异性免疫等因素也被证明影响着免疫治疗的疗效。然而，经典生物标志物在预测免疫治疗应答的同时，往往也与免疫相关不良反应的发生呈正相关，既往研究发现TMB、MSI、CD8 T细胞浸润等指标在预测免疫治疗疗效的同时，也与免疫不良反应呈正相关。这意味着利用这些标志物筛选出的免疫治疗优势病人同时也是免疫不良反应的高发及高危人群。在既往报道的免疫治疗相关因素中，哪些因素介导的ICB疗效-毒性作用是偶联的，哪些具备疗效特异性，哪些又是毒性/不良反应特异性的，亟待鉴别。

发明内容

为实现上述目的，本发明提供的一种基于免疫治疗疗效与毒性关系的免疫调节基因分类方法，所述构建方法，包括差异分析筛选免疫治疗调节基因；不相称性分析计算各瘤种免疫相关不良反应比值比、收集各瘤种免疫治疗客观缓解率；计算免疫治疗调节基因在各瘤种中的中位表达量；相关性分析计算各免疫治疗基因的中位表达量与该瘤种的免疫相关不良反应比值比与免疫治疗客观缓解率的相关系数及显著性，并依次分为四类：免疫治疗疗效/毒性偶联基因、免疫治疗毒性特异性基因、免疫治疗疗效特异性基因、免疫治疗疗效/毒性无关基因。

本发明提供的一种基于免疫治疗疗效与毒性关系的免疫调节基因分类方法，包括：

获取若干ICB治疗患者的治疗前转录组二代测序数据和治疗期间组二代测序数据；

对所述治疗前转录组二代测序数据和所述治疗期间组二代测序数据进行差异性分析得到若干免疫治疗调节基因；

获取各瘤种对应的免疫相关不良反应比值比和免疫治疗客观缓解率；

获取癌症基因组图谱中各瘤种的mRNA表达谱数据，基于所述各瘤种的mRNA表达谱数据得到免疫治疗调节基因的中位表达值；

分别对所述免疫治疗调节基因的中位表达值与所述免疫相关不良反应比值比、免疫治疗客观缓解率进行相关性分析，得到相关性关系；

基于所述相关性关系对所述免疫治疗调节基因进行分类。

可选地，进行差异性分析前还包括采用R语言DESeq2包对所述治疗前转录组二代测序数据和所述治疗期间组二代测序数据进行FPKM标准化。

可选地，获得免疫治疗调节基因的过程包括：

基于差异分析得到错误发现率；

基于所述错误发现率进行P值的多重检验校正；

当所述错误发现率小于0.2，所述P值小于0.05时，得到免疫治疗调节基因。

可选地，基于不相称性分析法计算报告获取各瘤种对应的免疫相关不良反应比值比。

可选地，所述免疫治疗调节基因的中位表达值的计算过程包括：

获取泛癌种数据集的RNA测序数据和各瘤种的临床数据；

对所述RNA测序数据进行基因注释得到注释RNA测序数据；

基于R语言合并所述注释RNA测序数据和所述临床数据，得到合并数据；

利用median函数计算各免疫治疗调节基因在所述合并数据的各癌种中的中位表达值。

可选地，所述相关性分析包括计算斯皮尔曼相关系数和显著性水平。

可选地，基于所述相关性关系对所述免疫治疗调节基因进行分类的过程包括：

当所述免疫治疗调节基因的中位表达值分别与所述免疫相关不良反应比值比、免疫治疗客观缓解率均显著相关时，所述免疫治疗调节基因为免疫治疗疗效/毒性偶联基因；

当所述免疫治疗调节基因的中位表达值与所述免疫相关不良反应比值比显著相关且所述免疫治疗调节基因的中位表达值与免疫治疗客观缓解率无关时，所述免疫治疗调节基因为免疫治疗毒性特异性基因；

当所述免疫治疗调节基因的中位表达值与所述免疫相关不良反应比值比无关且所述免疫治疗调节基因的中位表达值与免疫治疗客观缓解率显著相关时，所述免疫治疗调节基因为免疫治疗疗效特异性基因；

当所述免疫治疗调节基因的中位表达值分别与所述免疫相关不良反应比值比、免疫治疗客观缓解率均无关时，所述免疫治疗调节基因为免疫治疗疗效/毒性无关基因。

本发明具有如下技术效果：

现有技术未聚焦于免疫治疗调节基因，且在计算基因与疗效相关性时未综合考虑其对毒性的影响，无法实现疗效与毒性的“解偶联”。本发明提供了一种基于免疫治疗疗效与毒性关系的免疫调节基因分类方法，该方法完成了免疫治疗调节基因的分类，基于分类结果实现了疗效与毒性的“解偶联”。

本发明通过分别对免疫治疗调节基因中位表达值与免疫相关不良反应比值比、免疫治疗客观缓解率进行相关性分析，可以解析免疫调节基因对免疫治疗的综合影响，解偶联了各免疫治疗调节基因对免疫治疗疗效与毒性各自的贡献度，为筛选免疫治疗的潜在获益人群以及免疫相关不良反应高危人群提供了分子依据及潜在的治疗靶点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例中构建免疫治疗调节基因的疗效-毒性模型示意图，其中，(A)表示获得基因为免疫治疗调节基因示意图，(B)表示免疫治疗调节基因分类示意图；

图2为本发明实施例中免疫治疗调节基因的疗效-毒性关系及代表性基因示意图，其中，(A)表示免疫治疗调节基因各类占比示意图，(B)表示疗效-毒性偶联基因代表性基因示意图，(C)表示代表性的毒性特异性基因示意图，(D)表示代表性的疗效特异性基因示意图；

图3为本发明实施例中基于泛癌分析的IFNG与免疫治疗疗效和毒性的相关性示意图；

图4为本发明实施例中基于泛癌分析的ABCB1与免疫治疗疗效和毒性的相关性示意图；

图5为本发明实施例中基于泛癌分析的HLA-F与免疫治疗疗效和毒性的相关性示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一

本实施例提供了一种基于免疫治疗疗效与毒性关系的免疫调节基因分类方法，包括以下步骤：

S1.基于若干ICB治疗患者获取治疗前转录组二代测序数据和治疗期间组二代测序数据。

收集68位ICB治疗患者的治疗前(pre-ICB)与治疗期间(on-ICB)的转录组二代测序数据(RNA-seq)。

基于治疗前转录组二代测序数据和治疗期间组二代测序数据进行差异性分析得到免疫治疗调节基因。

运用R语言DESeq2包对测序数据进行FPKM标准化，行差异分析，计算错误发现率(false discovery rate，FDR)以对多重检验P值进行矫正。FDR q值<0.2且P<0.05的基因视为免疫治疗调节基因。

S2.基于现有报告获取各瘤种对应的免疫相关不良反应比值比和免疫治疗客观缓解率。

利用美国FDA药物不良事件报告系统数据(FDA adverse events reportingsystem，FARES)，通过比较抗PD-(L)1药物发生irAE的几率与FARES数据库中所有其他药物发生irAE的几率，不相称性分析计算每种癌症类型的免疫相关不良反应比值比(immue-related objected response rate，irROR)。具体包括计算过程如下：

(1)下载美国FDA不良事件报告系统(FDA Adverse Event Reporting System,FAERS)不良事件记录；

(2)统计：使用PD-1抑制剂或者PD-L1抑制剂发生免疫相关不良反应事件的人数(a)、使用PD-1抑制剂或者PD-L1抑制剂的癌症患者发生所有非免疫相关不良反应事件的人数(b)，未使用PD-1抑制剂或者PD-L1抑制剂的所有患者发生免疫相关不良反应事件的人数(c)，未使用PD-1抑制剂或者PD-L1抑制剂的所有患者发生所有非免疫相关不良反应事件的人数(d)；

(3)计算免疫相关不良反应报告比值比ROR＝(a/b)/(c/d)。

收集既往已发表的临床研究的免疫治疗客观缓解率(immunotherapy-relatedreporting odds ratio，irROR)数据。

S3.收集癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)各瘤种的mRNA表达谱数据，计算免疫治疗调节基因在各种瘤种的中位表达值。具体过程包括：

(1)从Xena(https://xenabrowser.net/datapages/)网站下载TCGA泛癌种数据集(TCGA Pan-Cancer)的RNA测序数据及临床数据(记录各样本所属癌种)；

(2)下载基因注释数据文件(https://toil-xena-hub.s3.us-east-1.amazonaws.com/download/tcga_RSE M_gene_tpm.gz)，对RNA测序数据进行基因注释；

(3)利用R语言合并注释后的RNA测序数据和临床数据，选取TCGA泛癌种的免疫调节基因子集，利用median函数计算各个免疫调节基因在各癌种中的中位表达值。

S4.分别对所述免疫治疗调节基因中位表达值与所述免疫相关不良反应比值比、免疫治疗客观缓解率进行相关性分析，得到相关性关系。

泛癌分析分别计算各免疫治疗基因的中位表达量与该瘤种的免疫相关不良反应比值比与免疫治疗客观缓解率的斯皮尔曼相关系数及显著性水平。

S5.基于所述相关性关系对所述免疫治疗调节基因进行分类。

依据各基因与免疫相关不良反应比值比与免疫治疗客观缓解率的相关性关系，将免疫治疗调节基因分为四类：疗效-毒性偶联基因(基因表达量与免疫相关不良反应比值比与免疫治疗客观缓解率均显著相关)、疗效特异性基因(基因表达量与免疫治疗客观缓解率显著相关，与免疫相关不良反应比值比无关)、毒性特异性基因(基因表达量与免疫相关不良反应比值比显著相关，与免疫治疗客观缓解率无关)及无关基因(基因表达量与免疫治疗客观缓解率及免疫相关不良反应比值比均无显著相关)。P<0.05视为具有显著性。

实施例二

本实施例提供了一种基于免疫治疗疗效与毒性关系的免疫调节基因分类方法，技术方案具体包括以下内容：

基于免疫治疗疗效与毒性关系的免疫调节基因分类方法的构建：收集抗PD-1联合抗CTLA-4免疫治疗患者样本基线及治疗早期肿瘤RNA-seq数据，运用R语言DESeq2包行差异分析，FDR q值<0.2且P<0.05的基因视为免疫治疗调节基因，如图1中的(A)所示。下载TCGA泛癌mRNA表达谱数据，计算各瘤种各基因平均表达值；下载FARES真实世界不良反应数据库，计算各瘤种抗PD-1及抗PD-L1报告比例比；汇总既往报道各瘤种免疫治疗客观缓解率。泛癌分析分别计算各基因与irORR及irROR的相关性。依据各基因与irROR、irORR的相关性关系，将免疫治疗调节基因分为四类：疗效-毒性偶联基因(基因表达量与irORR、irROR均显著相关)、疗效特异性基因(基因表达量与irORR显著相关，与irROR无关)、毒性特异性基因(基因表达量与irROR显著相关，与irORR无关)及无关基因(基因表达量与irORR及irROR均无显著相关)，如图1中的(B)所示。

如图2所示，免疫治疗调节基因各类占比分别为：疗效-毒性偶联基因26.20％、疗效特异性基因9.17％、毒性特异性基因7.86％及无关基因56.77％。其中，疗效-毒性偶联基因代表性基因有IFNG、PRF1、CD8B、CXCL9等基因；代表性的毒性特异性基因有CRTAM、LCP1、ABCB1等基因；而疗效特异性基因包括TIMM8A、HLA-C、HLA-F等基因。

实例1：疗效-毒性偶联基因代表性基因有IFNG。计算该基因表达量与免疫相关不良反应比值比及免疫治疗客观缓解率的相关性，可见IFNG与免疫治疗的疗效(rho＝0.6690；P＝0.0012)与毒性(rho＝0.6287，P＝0.0029)均呈正相关，如图3所示。

实例2：代表性的毒性特异性基因有ABCB1等基因。计算该基因表达量与免疫相关不良反应比值比及免疫治疗客观缓解率的相关性，可见ABCB1仅与免疫治疗毒性均呈负相关(rho＝-0.4947，P＝0.0281)，而与疗效无关(rho＝-0.1679，P＝0.4793)，如图4所示。

实例3：代表性的疗效特异性基因有HLA-F。计算该基因表达量与免疫相关不良反应比值比及免疫治疗客观缓解率的相关性，可见HLA-F仅与免疫治疗的疗效正相关(rho＝0.5848，P＝0.0067)，而与毒性无关(rho＝0.3007，P＝0.1971)，如图5所示。

本发明解偶联了各免疫治疗调节基因对免疫治疗疗效与毒性各自的贡献度，为筛选免疫治疗的潜在获益人群以及免疫相关不良反应高危人群提供了分子依据及潜在的治疗靶点。

其中，所筛选出的免疫治疗毒性特异性基因在预测免疫相关不良反应的应用。

所筛选出的免疫治疗疗效特异性基因在预测免疫治疗客观缓解率或总生存、无进展生存的应用。

所筛选出的免疫治疗毒性特异性基因作为阻断免疫不良反应治疗靶点的应用。

所筛选出的免疫治疗疗效特异性基因作为增敏免疫治疗反应或逆转免疫治疗耐药的治疗靶点的应用。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。