一种新型睾丸线粒体标记物检测试剂盒的制备方法

技术领域

本发明涉及CG8728蛋白在制备睾丸线粒体标记物检测试剂盒中的制备方法，属于男科学领域。

背景技术

在果蝇的睾丸中，线粒体是重要的细胞器，在精子发生过程中其大小和形状会发生动态变化。线粒体定位于精原细胞和精母细胞的细胞质中，并进一步迁移、聚集、融合，在早期圆形精母细胞的细胞核附近形成Nebenkern结构。精子包含两个线粒体衍生物(即主要线粒体衍生物和次要线粒体衍生物)，沿精子尾部伸长，与轴丝密切相关。主要线粒体衍生物积累副晶体，而次要线粒体衍生物体积逐渐减小。最近的一项研究表明，精子亮氨酸氨基肽酶(S-LAP)家族包含八个密切相关的亚基，均在睾丸组织中特异性表达，并被确定为主要线粒体衍生物中副晶体物质的关键成分。Bb8在减数分裂后的精子中高度表达，并定位于线粒体。研究发现，Bb8突变体睾丸出现了巨型线粒体，且副晶体物质在两种精子线粒体衍生物中分布异常。此外，有研究表明，knon是Nebenkern和长形精子线粒体内部结构所需的。一项研究证明线粒体-微管连接蛋白Milton在线粒体中高度富集，是微管运动所必需的，提示线粒体可以对微管介导的长形精子个体化复合体发挥作用。

睾丸优势表达基因CG8728的编码蛋白在N端和C端分别包含了一个肽酶M16结构域，其序列在人和果蝇等多个物种中均为高度保守。通过分析果蝇睾丸单细胞测序数据发现，CG8728基因在果蝇睾丸干细胞微环境的各类细胞中均有较高表达。基于肽酶M16结构域推测，CG8728蛋白可以通过线粒体转运蛋白调控线粒体的功能。已有研究报道，PMPCA基因(CG8728的人同源基因)的多个突变位点可能与多种严重的线粒体疾病相关，包括小脑共济失调、发育迟缓等。

研究表明，CG8728蛋白可以与RNA结合蛋白Orb2相互作用，形成CG8728/Orb2复合体，从而影响下游靶标的表达。orb2也是睾丸优势表达基因，其编码蛋白包含了两个功能保守的结构域，即RNA recognition motif(RRM)结构域和Cytoplasmic polyadenylationelement-binding protein,ZZ(CEBP_ZZ)结构域。Orb2作为胞质多聚腺苷酸化元件结合蛋白，可以通过核糖体结合下游靶标的mRNA来抑制或激活蛋白翻译过程。已有报道显示，Orb2蛋白在果蝇睾丸生殖细胞和体细胞中广泛表达，且在精子发生的多个阶段均发挥了关键作用，最终导致了雄性生育障碍。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型睾丸线粒体标记物检测试剂盒的制备方法。CG8728蛋白是本课题组前期研究鉴定到的关键蛋白之一，可以通过睾丸线粒体参与调控精子发生过程，因此具有重要的研究意义和应用价值。通过检测CG8728蛋白的表达模式可以有效判断睾丸线粒体的表达分布情况。本发明为解决上述技术问题采用以下技术方案：

CG8728蛋白在制备一种新型睾丸线粒体标记物检测试剂盒中的应用，所述的试剂盒以在睾丸组织中检测CG8728的表达模式作为新型睾丸线粒体的标志物。

进一步的，所述试剂盒利用CG8728蛋白的抗体来检测睾丸样本中CG8728蛋白第312-326位氨基酸的表达模式。

进一步的，睾丸组织中CG8728蛋白第312-326位氨基酸的表达模式与睾丸线粒体标记物的表达模式一致。

进一步的，所述样本组织为果蝇睾丸组织。

进一步的，所述试剂盒采用免疫荧光染色方法分析检测睾丸样本组织中CG8728蛋白第312-326位氨基酸(C-DSGPKQVDTSIAQYT)的表达模式。

有益效果

本发明通过研究发现CG8728为睾丸优势表达蛋白，且在睾丸各级生精细胞中均有较高表达；通过检测睾丸样本组织中的CG8728蛋白的表达模式可以有效的判断睾丸组织线粒体表达分布情况，对睾丸线粒体研究具有重要的应用价值。

附图说明

图1为果蝇睾丸组织中CG8728蛋白的表达模式。图A为果蝇睾丸头部组织CG8728的分布情况。图B为果蝇睾丸中段组织CG8728的分布情况。

图2为CG8728表达水平的分析结果。图A为CG8728在果蝇各组织脏器中的表达情况，原始数据基于modENCODE_mRNA-Seq(Flybase数据库)。图B为果蝇睾丸各细胞类型的分群情况。图C为CG8728在果蝇睾丸各细胞群中的表达情况。图B-C所涉及的果蝇睾丸单细胞测序的原始数据基于FLY CELL ATLAS数据库。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。

本发明为解决上述技术问题采用以下技术方案：

实施例1：CG8728在果蝇睾丸组织中的表达模式。

在正常果蝇睾丸组织中，利用免疫荧光染色结果观察CG8728蛋白在果蝇睾丸各级生精细胞中的表达模式。免疫荧光染色结果显示，CG8728蛋白在果蝇睾丸各级生精细胞中均有较高表达，且其表达模式完全模拟了线粒体蛋白的表达模式。其线粒体特异性表达模式主要表现为：1)睾丸头部组织中，CG8728主要在细胞质中表达，且具有线粒体分裂和融合的情况(图1A)；2)睾丸中段组织中，CG8728可见于Onion stage圆形精子，且聚集成球状；这是典型的Onion stage线粒体表达模式，且其形态随着长形精子延伸过程中被逐步拉伸变成，最终定位在长形精子尾部(图1B)。

(1)果蝇饲养：

果蝇饲养在果蝇专用培养箱内，培养温度为25℃，相对湿度保持在40-60％之间。每隔两周更换一次果蝇食物。培养箱每月用75％酒精进行清洁消毒。本实验所用果蝇为W

(2)睾丸组织免疫荧光染色

1)睾丸组织解剖

雄性果蝇在二氧化碳作用下进行麻醉，在解剖皿内加入1x PBS缓冲液，将麻醉后的雄性果蝇夹到解剖皿内，在显微镜视野内用精细镊子分离睾丸组织。解剖好的睾丸组织用移液枪放置PCR管内。

2)固定

吸取PCR管内多余的PBS，加入50μL 4％ PFA，室温固定30分钟。

3)通透

吸取PCR管内多余的固定液，加入50μL 1％ PBST，通透时间为40分钟。

4)封闭

通透完成后，去除通透液体，加入50μL 5％ BSA，封闭时间为30分钟。

5)一抗孵育

去除封闭液后，加入稀释好的一抗工作液，室温1小时或者4℃过夜孵育。

6)二抗孵育

一抗孵育后，用1％ PBST清洗三次，每次5分钟，加入对应荧光基团的二抗工作液，室温避光孵育1小时。

7)染核

移除二抗后，用1％ PBST清洗三次，每次5分钟。将Hoechst染料按照1:800稀释，室温避光孵育10分钟。

8)封片

用移液枪将睾丸组织移至载玻片上，用精细镊子去除多余杂质，并将睾丸分散摆好方位。吸取15μL的抗淬灭剂，缓慢盖上盖玻片，使用马克笔标记好对应信息。将玻片放置玻片盒内并于4℃保存。

实施例2：CG8728蛋白是睾丸优势表达蛋白。

通过Flybase数据库整合的RNA-seq分析发现，CG8728为睾丸优势表达基因(图2A)。通过FLY CELL ATLAS数据库整合的单细胞测序结果发现，CG8728在睾丸各级生精细胞中均有较高表达(图2B-C)。