靶向胶质瘤干细胞中高表达的Sp1在治疗胶质母细胞瘤中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及靶向胶质瘤干细胞(GSC)中高表达的Sp1来抑制胶质瘤干细胞的干性及抗凋亡能力在治疗胶质母细胞瘤中的应用。

背景技术

胶质母细胞瘤(Glioblastoma，GBM)是最常见的恶性原发脑肿瘤，约占所有胶质瘤的57％和所有恶性原发中枢神经系统肿瘤的48％。尽管近年来对GBM的治疗取得了进展，包括手术、放射治疗、全身治疗(化疗、靶向治疗)和支持护理，但患者总体预后仍然很差，中位生存期小于2年，长期存活率很低。因此亟需开发新的疗法来改善GBM患者的预后。

胶质瘤干细胞(Glioma stem cells，GSCs)在功能上由持续的自我更新和肿瘤起始能力所定义，其特点是广泛的表型异质性、状态可塑性和干性与非干性状态之间的相互转换。GSCs侵占颅内空间，逃避免疫监视并且抵抗放化疗，在GBM的发生、发展和耐药中发挥着至关重要的作用。因此靶向GSCs是治疗GBM的一种重要策略。

突变或失调的转录因子是一类独特的药物靶点，它们介导异常基因表达，包括阻断分化和细胞死亡基因表达程序，这些都是癌症的标志性特征。信号通路中的人类致癌基因比致癌转录因子多得多，这也使得有限的转录因子成为了治疗癌症最直接、最有希望的靶点。另一方面，转录因子对于干细胞维持干性状态发挥了关键作用，而关键的转录因子可以在GSCs中重新表达或者激活。因此靶向维持GSCs干性状态的转录因子是一种十分有前景的靶点。

GSCs与神经干细胞(Neural progenitor cells，NPCs)之间的相似性为靶向GSCs的治疗带来了重大挑战。由于GSCs和NPCs都具有干性特征，并使用相似的分子途径来维持。因此，确定区别GSCs与NPCs的不同调控机制对于开发靶向GSCs的疗法至关重要。

然而目前对于GSCs是否存在独立于NPCs和非干性肿瘤细胞(Non-stem tumorcells，NSTCs)的特有的转录网络，以及调控GSCs特有转录网络的关键转录因子是否上调及维持机制尚不清楚。亟需对调控GSCs特有转录网络的转录因子进行深入探究，以期开发靶向胶质母细胞瘤关键转录因子的药物，以应用于临床。

发明内容

本发明首次提出了胶质瘤干细胞中存在独立于神经干细胞和非干性胶质瘤细胞的转录网络，这为寻找特异靶向胶质瘤干细胞的转录因子提供了基础。

本发明还首次提出了胶质瘤干细胞中独特的转录网络是由转录因子Sp1发挥主要调控作用的，因此可以通过靶向Sp1特异性靶向胶质瘤干细胞，而不损伤正常的神经干细胞。

本发明还首次提出了在胶质瘤干细胞中Sp1的蛋白水平相对神经干细胞和非干性胶质瘤细胞是高表达的，因此可以通过检测Sp1的蛋白水平判断胶质瘤干细胞在肿瘤组织中的含量高低。

本发明还提出了Sp1的高表达调控着胶质瘤干细胞的干性和抗凋亡的能力。因此Sp1是治疗胶质母细胞瘤的潜在靶点。

本发明还发现Sp1的小分子抑制剂普卡霉素(Plicamycin)能够降低胶质瘤干细胞中Sp1的蛋白水平，并且抑制其干性及抗凋亡能力。因此普卡霉素可以作为靶向胶质瘤干细胞中高表达的Sp1来治疗胶质母细胞瘤的潜在药物。

具体来说，本发明提供以下技术方案：

一方面，本发明提供检测Sp1蛋白水平的试剂在制备胶质母细胞瘤特别是胶质瘤干细胞的诊断和/或预后试剂或组合物或试剂盒中的用途。

另一方面，本发明提供胶质母细胞瘤特别是胶质瘤干细胞的诊断和/或预后试剂或组合物或试剂盒，其特征在于，所述试剂或组合物或试剂盒包括检测Sp1蛋白水平的试剂。

在一些实施方案中，检测Sp1蛋白水平的试剂为抗体，优选Sp1兔抗体。

另一方面，本发明提供Sp1的抑制剂在制备抑制胶质母细胞瘤特别是胶质瘤干细胞的干性和抗凋亡能力的药物或药物组合物中的用途。

另一方面，本发明提供抑制胶质母细胞瘤特别是抑制胶质瘤干细胞的干性和抗凋亡能力的药物或药物组合物，其特征在于，所述药物或药物组合物包括Sp1的抑制剂。

在一些实施方案中，所述Sp1的抑制剂为降低Sp1蛋白水平的普卡霉素。

优选地，小分子抑制剂普卡霉素通过抑制胶质瘤干细胞的干性和抗凋亡能力从而杀伤胶质瘤干细胞来治疗癌症。

优选地，小分子抑制剂普卡霉素浓度依赖性地抑制Sp1的蛋白水平且杀伤胶质瘤干细胞。

优选的，所述小分子抑制剂普卡霉素的分子式为C

另一方面，本发明提供治疗胶质母细胞瘤的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的降低Sp1蛋白水平的抑制剂。

另一方面，本发明提供非治疗目的的抑制胶质瘤干细胞的成球数量或成球大小或增殖能力的方法，其特征在于，所述方法包括向胶质瘤干细胞施加有效量的降低Sp1蛋白水平的抑制剂。

另一方面，本发明提供抑制胶质瘤干细胞的成球数量或成球大小或增殖能力的药物或药物组合物，其特征在于，所述药物或药物组合物包括Sp1的抑制剂。

另一方面，本发明提供区分胶质瘤干细胞和神经干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括检测待测细胞的Sp1蛋白水平，并与参照神经干细胞的Sp1蛋白水平进行比较的步骤，如果所述细胞的Sp1蛋白水平高于所述参照神经干细胞，则将所述细胞判定为胶质瘤干细胞。

定义

Sp1：Specificity Protein 1属于含有DNA结合蛋白的C2H2型锌指家族，Sp1可高亲和力地结合富含GC的基序，并调控大量哺乳动物基因的表达。Sp1控制着大约6000个基因的激活，大约占人类基因组的三分之一。

普卡霉素(Plicamycin)：普卡霉素是一种选择性和特异性的Sp1转录因子抑制剂，通过诱导蛋白酶体依赖性降解来降低Sp1蛋白，结构式如下：

CCK-8：用于简便而准确计量细胞存活数目的试剂。

IC

小分子抑制剂：一类能够靶向作用于蛋白，降低蛋白活性或阻碍生化反应的、分子量小于1000道尔顿的有机化合物分子，广泛应用于信号通路的研究。

神经干细胞：指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新并能提供大量脑组织细胞的细胞群。其可以作为胶质瘤干细胞的正常对照，探究其恶性特征的来源及分子机制。

成球数量：指肿瘤干细胞形成干细胞球体的数量，衡量肿瘤细胞干性的金标准之一。

成球大小：指肿瘤干细胞形成干细胞球体的大小，衡量肿瘤细胞干性的金标准之一。

有益效果

本发明首次证明了在胶质母细胞瘤的胶质瘤干细胞中有着高的Sp1蛋白表达，并且Sp1作为一个转录因子，在胶质瘤干细胞中调控着独特的转录网络来维持干性和抗凋亡能力。通过靶向胶质瘤干细胞中Sp1的高蛋白水平可以有效的抑制胶质瘤干细胞，并且不损伤正常的神经干细胞。因此高的Sp1蛋白表达可作为胶质瘤潜在的治疗靶点，具有良好的实际应用价值。

本发明通过对测序数据进行分析发现，胶质瘤干细胞中有着独立于神经干细胞和非干性胶质瘤细胞的转录网络，并且这种网络主要由Sp1调控。进一步验证了Sp1在胶质瘤干细胞中在蛋白水平存在显著高表达。因此可以通过靶向胶质瘤干细胞中高蛋白水平的Sp1，靶向胶质瘤干细胞中特异存在的转录网络，从而避免影响正常细胞导致的副作用。

不同于以往Sp1在胶质瘤细胞中相对于癌旁组织高表达的报道，本发明首次发现Sp1在胶质瘤干细胞中相对于胶质瘤细胞是高表达的，而且Sp1在胶质瘤干细胞干性维持以及抗凋亡能力中发挥关键作用，说明Sp1在通过胶质瘤干细胞促进胶质母细胞瘤进展中至关重要，因此高表达的Sp1是用于治疗胶质母细胞瘤的非常有前途的一个靶点。普卡霉素作为可抑制转录过程的干扰素而被用于部分癌症的治疗。本发明明确了普卡霉素的具体机制之一是通过降低Sp1的蛋白水平来实现的，并且在细胞系水平验证了其用于治疗胶质母细胞瘤的潜力。

本发明验证了普卡霉素确实以时间依赖性降低Sp1的蛋白水平并且影响胶质瘤干细胞的干性和抗凋亡能力。

神经干细胞自身的Sp1表达量很低，本发明验证Sp1在胶质瘤干细胞中相对于神经干细胞高表达，所以施加普卡霉素会对胶质瘤干细胞产生较大的影响。

附图说明

图1为利用Homer对胶质瘤干细胞特异开放的染色质进行富集分析，发现SP1是调控胶质瘤独特转录网络的转录因子。其中图1A是3个细胞系中特异开放的染色质富集到的转录因子，数据展示了按照P值排名前15个转录因子。图1B是对3个细胞系富集得到的转录因子取交集寻找到SP1是最保守的转录因子。

图2为通过免疫荧光检测胶质瘤干细胞中Sp1是否与干性标志物SOX2和OLIG2在相同位置是高表达的，验证Sp1与胶质瘤干细胞的干性相关。

图3A、图3B为蛋白质免疫印记检测胶质瘤干细胞(GSC)、非干性胶质瘤(NSTC)和神经干细胞(NPC)的Sp1表达情况。其中图3A为蛋白质免疫印记检测5个配对的GSC-NSTC细胞系的Sp1的表达情况，以α-tubulin作为内参蛋白，SOX2和OLIG2作为干性标记物，GFAP作为分化标记物。图3B为蛋白质免疫印记检测两个GSC细胞系和两个NPC细胞系的Sp1的表达情况。

图4为使用CCK-8试剂获得普卡霉素对GSC1半抑制浓度IC

图5为使用CCK-8试剂探究100nM普卡霉素对胶质瘤干细胞的增殖产生的影响。使用了两个细胞系的生物学重复进行实验。

图6A、图6B为使用100nM普卡霉素对胶质瘤干细胞的成球数量和大小的影响。使用了两个细胞系的生物学重复进行实验。选取了判断胶质瘤干细胞干性的两个指标---成球数量和成球大小进行指征。其中图6A为选取的代表性图片；图6B为对图片进行计数后的统计图，以对照组为1对数据进行了处理。

图7为使用100nM普卡霉素对胶质瘤干细胞进行处理，在不同时间点收取细胞，探究普卡霉素抑制Sp1蛋白水平的时效，以及对于胶质瘤干细胞抗凋亡能力的影响。以DMSO即0h作为对照，在施加普卡霉素6、12和24h后收取蛋白质进行免疫印记实验。使用了两个细胞系的生物学重复进行实验。以α-tubulin作为内参蛋白，Cleaved caspase-3和CleavedPARP(Poly ADP-ribose polymerase)作为凋亡指标。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

本发明所用的主要材料如下：

普卡霉素(Plicamycin)购自MedChemExpress公司；BCA蛋白定量试剂盒购自Solario公司；WB化学发光显色底物(Super Signal West chemiluminescent substrates)购自Biosharp公司；一抗Sp1购自Proteintech公司；一抗SOX2购自Millipore公司；一抗OLIG2购自Abcam公司；一抗GFAP购自Biolegend公司；一抗Cleaved Caspase-3购自CellSignaling Technology公司；一抗Cleaved PARP购自Cell Signaling Technology公司；一抗anti-α-tubulin购自Cell Signaling Technology公司；二抗Anti-mouse IgG,HRP-linked Antibody#7076、二抗Anti-rabbit IgG,HRP-linked Antibody#7074购自CellSignaling Technology公司。

Lysis配方如下：

20mM beat-GPA(梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，G0097)；200mM PMSF(Sangon Biotech，A610425-0005)；50mM Tris(Sangon Biotech，A501492-0005)-HCL(国药集团化学试剂有限公司，I04328)pH7.4；150mM NaCl(Biosharp，BS112-1kg)；2mM EDTApH8.0(Biosharp，BL518A)；1％NP-40(Sangon Biotech，A600385-0100)；0.1％SDS(BioFROXX，3250GR500)；500mM Na

本发明涉及到的统计分析采用GraphPad Prism统计学软件进行，两组均数比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析，P<0.05被认为具有统计学差异。

实施例1：Sp1在GSC独特的转录网络中发挥着主要的调控作用

从高通量基因表达数据库GEO(Gene Expression Omnibus data base)中下载GSE211724的数据，数据包含3个配对的GSC-NSTC细胞系(GSC1，GSC2和GSC3)和一个NPC细胞系的ATAC-seq(Assay for Transposase-Accessible Chromatin-sequencing)数据。具体的实验步骤如下：

(1)对7个数据下载原始的Fastq文件，使用Fastqc进行数据质控报告的生成，根据报告使用Fastp进行数据质控，使用TrimGalore去除接头，再次使用Fastqc查看数据指标是否符合标准；

(2)使用BWA将Fastq文件回帖到GRCh38(GenomeReference Consorium humangenome(build 38))，得到bam文件；

(3)使用Sambamba去除PCR重复以解决数据质控报告中Sequence DuplicationLevels的问题；

(4)使用Genrich进行Peak calling定量染色质开放区域；

(5)使用Intervene寻找仅在胶质瘤干细胞中开放的peaks；

(6)使用Homer寻找调控胶质瘤干细胞独特转录网络的上游转录因子。

如图1A所示，在排除了神经干细胞和非干性胶质瘤细胞开放的染色质之后，三个胶质瘤干细胞细胞系的生物学重复都能够富集到上游转录因子。这里展示了按照P值排序的前15个转录因子。先前的研究多是从转录水平即使用转录组进行差异分析来寻找可以靶向的分子，但这样找到的分子多是偏下游的分子。本发明从基因组数据出发，直接寻找上游调控转录的分子，从而寻找能够发挥关键且广泛作用的靶向分子。

如图1B所示，为了得到更加普遍的调控机制，对三个细胞系富集得到15个转录因子取交集(本发明将三个细胞系作为三个生物学重复，只有在三个细胞系中重复出现的转录因子才具有普适的关键调控作用)，发现SP1非常保守地调控了胶质瘤干细胞特异开放的染色质。因此可以通过靶向SP1特异地靶向胶质瘤干细胞特异开放的染色质，从而不损伤正常的神经干细胞。

实施例2：胶质瘤干细胞中Sp1与干性指标SOX2和OLIG2在相同位置是高表达的使用GSC1细胞系进行胶质瘤干细胞成球实验：

(1)将2皿10cm直径培养皿中使用NBM培养基(Gibco，12349-015)培养的适度成球的GSC1置于15mL离心管中，静置30min，使干细胞球自然下沉；

(2)小心弃去上清，加入2mL 4％多聚甲醛固定15min；

(3)小心弃去上清，使用5mL PBS清洗3次；

(4)小心弃去上清，加入5mL 30％蔗糖脱水，静置过夜；

(5)小心弃去上清，置于含有包埋剂(Optimal cutting temperature compound，OCT)(购自美国SAKURA公司，货号为4583)的包埋盒中；

(6)提前将放有酒精的方盒放置于干冰中进行预冷，将包埋盒置于酒精中约10min，直至包埋剂彻底凝固；

(7)冰切，将切片置于-80℃的冰箱中保存。

免疫荧光步骤为：

(1)将冰冻切片置于PBS中洗去包埋剂；

(2)使用4％多聚甲醛固定30min，固定结束PBS洗3次，每次5min；

(3)使用破膜封闭液(0.3％Triton X-100+PBS溶液+1％BSA)60min，封闭结束PBS洗3次，每次5min；

(4)使用1％BSA溶液分别混合Sp1和SOX2和OLIG2的抗体，4℃孵育过夜，孵育结束PBS洗3次，每次5min；

(5)室温孵育荧光二抗(二抗是和一抗结合的抗体，上面带有可用激光激发的荧光基团)1h，注意避光，孵育结束PBS洗3次，每次5min；

(6)室温孵育Hoechst(一种荧光染料，Invitrogen，H3570)20min，孵育结束PBS洗3次，每次5min；

(7)使用封片剂(Sigma，F4680)进行封片，防止荧光淬灭；

(8)使用荧光显微镜进行观察。

图2结果表明在胶质瘤干细胞球中Sp1的蛋白水平与干性标志物SOX2和OLIG2在相同位置是高表达的，表明Sp1的表达与胶质瘤干细胞的干性相关。

实施例3：胶质瘤干细胞中Sp1的蛋白水平相比于神经干细胞和非干性胶质瘤细胞是高表达的

为了比较胶质瘤干细胞(GSC)和非干性胶质瘤细胞(NSTC)的Sp1的表达情况，取5个不同的胶质瘤干细胞细胞系(GSC1，GSC2，GSC3，GSC4和GSC5)和配对的非干性胶质瘤细胞系(细胞系制备方法参见：Zhou K,Yao YL,He ZC,et al.VDAC2 interacts with PFKP toregulate glucose metabolism and phenotypic reprogramming of glioma stemcells.Cell Death Dis.2018；9(10):988.Published 2018Sep 24.doi:10.1038/s41419-018-1015-x)，分别用NBM培养基(Gibco，12349-015)和1640培养基(BI，C3010-0500)进行培养。为了比较胶质瘤干细胞(GSC)和神经干细胞(NPC)的Sp1的表达情况，取2个不同的胶质瘤干细胞细胞系(GSC1和GSC2)和2个不同的神经干细胞细胞系(NPC1和NPC2)，均使用NBM培养基进行培养，其中神经干细胞需要培养在铺有基质胶的培养皿中。收取胶质瘤干细胞和非干性胶质瘤细胞，通过蛋白免疫印迹来检测胶质瘤干细胞的干性特征和非干性胶质瘤细胞的分化特征，以及胶质瘤干细胞和非干性胶质瘤细胞的Sp1表达情况。收取胶质瘤干细胞和神经干细胞，通过蛋白免疫印迹来检测胶质瘤干细胞和神经干细胞的Sp1表达情况。蛋白免疫印迹步骤如下：

准备工作：4℃离心机预冷；从-20℃冰箱取出Lysis裂解液置于冰上融化；分光光度计测量杯准备：先酒精后ddH

(1)对含有胶质瘤干细胞、非干性胶质瘤细胞和神经干细胞的培养基进行离心，1000rpm，3min；

(2)弃上清，根据细胞沉淀加入合适体积(<100万细胞，60μL；200万-300万细胞，90-120μL；300万细胞，120μL)的蛋白裂解液Lysis，冰上裂解5min；

(2)4℃，13000rpm高速离心，15min，完成后将上清置于新的EP管中；

(3)用BCA法定量蛋白浓度；

(4)以低浓度为参照，利用Lysis裂解液稀释高浓度样品；

(5)加4倍浓度loading buffer(Tris-Cl 200mM(pH6.8)，SDS 8％，Glycerol40％，Mercapitalethanol 4％，Bromophenol blue 0.40％)，100℃金属浴10min，-20℃保存。

准备工作：电泳液体系(Tris base 250mM，Glycine 1.92mM，SDS 35mM)；转膜液体系(Glycine 1.92M，Tris base 250mM，20％体积的甲醇)，加HCl调节pH到7.6，可重复使用3-4次；TBST体系(NaCl 2.74M，KCl 54mM，Tris base 380mM，1/1000体积的吐温20)；5％脱脂奶粉(40mL TBST，2g奶粉)；抗体稀释(一抗1:1000，二抗1:10000，使用一抗稀释液或1％BSA)。

(1)配置10％的分离胶(按照说明书配置即可)，在上样前吸出孔内残胶；

(2)上3μL marker蛋白，样品上10μg，根据蛋白浓度计算相应体积，使用loadingbuffer补足最高体积；

(3)电泳：80mV，30min；110-120mV，80min；

(4)转膜：裁剪4cm*8cm的PVDF膜，放入甲醇中提前激活，按照黑色夹-海绵-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵-白色夹的顺序安装电转夹，可以在左上标记正反面；320mA，50mV(参考值)，2h；两块胶，340mA，60-70mA(参考值)，150min；

(5)封闭：5％脱脂牛奶封闭1h，TBST(常规洗膜液)洗三次，每次5min；

(6)裁膜：根据目标蛋白的位置裁剪PVDF膜，α-tubulin 55kD，SOX234kD，OLIG232kD，GFAP 50kD，SP1 95kD；

(7)孵育一抗：分别4℃过夜孵育一抗α-tubulin(内参蛋白)，SOX2和OLIG2(干性标志物)，GFAP(分化标记物)和Sp1，TBST洗三次，每次5min；

(8)孵育二抗(二抗是和一抗结合的抗体，上面带有可与发光液中底物反应的酶)60min，TBST洗三次，每次5min；

(9)加入发光液，进行显影曝光。

如图3A所示，在5个细胞系(GSC1，GSC2，GSC3，GSC4和GSC5)中，胶质瘤干细胞的干性标志物SOX2和OLIG2的表达高于非干性胶质瘤细胞，说明胶质瘤干细胞具有干细胞特征；非干性胶质瘤细胞的分化标志物GFAP的表达高于胶质瘤干细胞，说明非干性胶质瘤细胞具有分化特征。进一步对蛋白质印记的定量结果显示，在考虑内参一致性的情况下，以归一化的胶质瘤干细胞为对照，非干性胶质瘤细胞的Sp1表达量均值仅为胶质瘤干细胞的18.4％。因此，胶质瘤干细胞中Sp1的表达显著高于非干性胶质瘤细胞。

如图3B所示，胶质瘤干细胞中Sp1的表达显著高于神经干细胞。进一步对蛋白质印记的定量结果显示，在考虑内参一致性的情况下，以归一化的胶质瘤干细胞为对照，神经干细胞的Sp1表达量均值为胶质瘤干细胞的42.5％。

实施例4：Sp1的小分子抑制剂普卡霉素Plicamycin的IC

使用CCK-8(Cell Counting Kit-8)可进行简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。其检测快速灵敏，毒性小，产生的甲瓒产物可溶优于MTT。具体步骤如下：

(1)制备细胞悬液：根据培养时间计算所需细胞数，以GSC1为例，每孔200μL培养基，每孔3,000细胞。注意在接种前保证悬液均匀，每孔细胞数一致；

(2)实验设计：空白组(培养基)；对照组(培养基+药物溶剂+细胞)；实验组(培养基+药物+细胞)；留取周围上下左右各一行不用，可添加PBS，即每组六个重复；药物浓度梯度设置为10,20,40,80,160,240和480nmol/mL；

(3)以第一天的接种时间为0h，后续每次都要在此时间加入CCK-8试剂进行孵育；

(4)注意0h的处理，要在接种后2-4h待细胞状态稳定后，加入CCK-8试剂进行孵育，作为0h的数据；

(5)使用CCK-8时，注意避光；加入20μL CCK-8后，左右稍微震荡混匀，注意不要产生气泡，用锡纸覆盖孔板避光，于37℃培养箱孵育1h；

(6)CCK-8孵育1h后，左右稍微震荡混匀，注意不要产生气泡；

(7)450nm酶标仪测定吸光度；把OD值控制在1左右；

(8)若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCL溶液或者1％w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下；24小时内测定，吸光度不会发生变化；

(9)数据处理：细胞存活率(％)＝[(实验孔吸光度-空白孔吸光度)/(实验孔吸光度-对照孔吸光度)]×100

如图4所示，Sp1的小分子抑制剂普卡霉素Plicamycin的IC

实施例5：Sp1的小分子抑制剂普卡霉素Plicamycin能够显著抑制胶质瘤干细胞的增殖

使用CCK-8试剂检测细胞活性，以溶剂DMSO为对照，判断普卡霉素的施加是否影响细胞的增殖能力。这里使用两个胶质瘤干细胞细胞系(GSC1和GSC2)，具体步骤大致同实施例4，改动为设置处理时间为1,2,3,4,5天，处理浓度为100nmol/L。

如图5所示，普卡霉素能够显著抑制胶质瘤干细胞的增殖能力。在GSC1中，对照组从第二天开始与普卡霉素处理组出现明显的差异，此时对照组的增殖倍数均值为4.400，而处理组的增殖倍数均值为2.530，抑制率为42.5％；在GSC2中，对照组从第二天开始与普卡霉素处理组出现明显的差异，此时对照组的增殖倍数均值为2.891，而处理组的增殖倍数均值为1.972，抑制率为31.8％。抑制率随着时间的增加逐渐增加，在第五天达到最大值。此时对照组的增殖倍数均值分别为9.069(GSC1)和11.420(GSC2)，处理组的增殖倍数均值分别为3.632(GSC1)和4.460(GSC2)，抑制率分别为60.0％和60.9％。综上可知，普卡霉素对胶质瘤干细胞的增殖能力有着显著的抑制作用，并且随着时间的增加抑制效果越来越好。

实施例6：Sp1的小分子抑制剂普卡霉素Plicamycin能够显著抑制胶质瘤干细胞的成球大小和数量

对培养在NBM培养基中的GSC1和GSC2施加DMSO和100nmol/L的普卡霉素，使用显微镜采图，对成球大小和成球数量进行统计和差异分析。

如图6A，是选取的代表性图片，可以看到普卡霉素可以显著抑制GSC的成球大小和数量。

如图6B，是对随机选取的视野进行成球大小和数量的统计，可以看到普卡霉素可以显著抑制GSC的成球大小和数量。左图是对成球数量的统计，这里将对照组归一化为1即100％，处理组的成球率分别为36.7％(GSC1)和23.6％(GSC2)，抑制率在60％以上；相比之下，如右图对成球大小的统计所示，普卡霉素的处理对成球大小有着更高的抑制作用，将对照组归一化为1即100％后，处理组的成球大小仅为9.8％(GSC1)和16.4％(GSC2)，抑制率在80％以上。综上可知，普卡霉素对GSC的成球数量，尤其是成球大小有着显著的抑制作用。

实施例7：Sp1的小分子抑制剂普卡霉素Plicamycin能够显著促进胶质瘤干细胞的凋亡

对培养在NBM培养基中的GSC1和GSC2施加DMSO和100nmol/L的普卡霉素，在不同的时间点(0,6,12,24h)收取相应的蛋白质样品，样品制备参考实例3。蛋白质印记步骤参考实例3，改动为裁膜位置与孵育一抗(α-tubulin 55kD，Cleaved caspase-3 30kD，CleavedPARP 90kD，SP1 95kD)。其中Cleaved caspase-3和Cleaved PARP为凋亡指标。

如图7，随着施加普卡霉素的时间的增加，Sp1的蛋白水平出现下降，并且随着时间的延长，其下降趋势呈现时间依赖性(GSC1：100％-83.2％-44.4％-6.1％；GSC2：100％-62.4％-57.8％-70.0％)，尤其是在24h时，Sp1的蛋白接近完全消失。进一步考察其对于胶质瘤干细胞凋亡的影响，发现两个凋亡指标Cleaved caspase-3(GSC1：1-1.914-6.224-19.683；GSC2：1-2.620-1.832-120.954)和Cleaved PARP(GSC1：1-0.700-2.970-5.039；GSC2：1-0.806-1.206-2.457)表达水平随着施加普卡霉素的时间的增加，均呈现出上升的趋势，呈现时间依赖性的凋亡水平增加。因此Sp1的小分子抑制剂普卡霉素Plicamycin能够显著促进胶质瘤干细胞的凋亡。

综上所述，本发明首次提出了Sp1是非常保守地调控胶质瘤干细胞特异转录网络的转录因子，因此可以通过靶向Sp1进而特异靶向胶质瘤干细胞，而不损伤正常细胞。并且本发明首次提出来胶质母细胞瘤中的胶质瘤干细胞有高的Sp1蛋白水平，靶向胶质瘤干细胞中高的Sp1蛋白是治疗胶质母细胞瘤的潜在治疗靶点。

本发明还首次提出来小分子抑制剂普卡霉素通过抑制胶质瘤干细胞Sp1蛋白水平进而抑制胶质瘤干细胞干性和抗凋亡能力的理论。普卡霉素是通过靶向胶质瘤干细胞Sp1蛋白，从而治疗胶质母细胞瘤的潜在治疗药物。总之，本发明为治愈胶质母细胞瘤及提高胶质母细胞瘤的生存率提供新的方向。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。