与番木瓜果肉果糖含量相关的SNP分子标记及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种与番木瓜果肉果糖含量相关的SNP分子标记及应用。

背景技术

番木瓜(Carica papaya L.)又称木瓜、乳瓜、万寿果，是一种热带常绿果蔬，其广泛栽培于全世界的热带和亚热带地区。番木瓜果皮光滑美观，果肉厚实细致、香气浓郁、汁水丰多、甜美可口、营养丰富，有“百益之果”、“水果之皇”、“万寿瓜”之雅称。成熟的番木瓜果肉呈黄色或红色，胡萝卜素、番茄红素含量丰富，具有卓越的保健效果和重要的使用价值以及工业价值。因此，发展番木瓜生产将极大刺激食品加工、医药卫生、美容保健和养殖业等相关产业发展，具有重要的意义。

在传统的番木瓜分子育种中，农民或育种家主要通过选择优良性状的植株个体，通过杂交或回交的方式，将优良性状固定下来。

番木瓜果肉果糖含量高低为评价番木瓜品质优劣的一个重要指标，因而是育种家在繁育优良番木瓜植株所考虑的重要因素，目前针对这一指标的选育需等待植株开花结果后测定果实的果糖含量来进行筛选优良植株，选育时间长、选育成本较高。

发明内容

鉴于上述的分析，本发明实施例旨在提供一种与番木瓜果肉果糖含量相关的SNP分子标记及应用，用以解决现有技术中与果肉果糖含量指标相关的番木瓜选育时间长、选育成本高的问题。

一方面，本发明提供了一种与番木瓜果肉果糖含量相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于Chr02染色体的第36650074位碱基，位于基因CDs区域，命名为Cpa02g023590:1559，所述SNP分子标记位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第411位。

进一步地，所述SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第411位存在A/C多态性。

进一步地，所述SNP分子标记位点为A的番木瓜果肉果糖含量高于所述SNP分子标记位点为C的番木瓜果肉果糖含量。

第二方面，本发明提供了上述SNP分子标记在番木瓜分子标记辅助选择育种中的应用。

第三方面，本发明提供了用于上述SNP分子标记的PCR引物对，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

第四方面，本发明提供了上述PCR引物对在番木瓜分子标记辅助选择育种中的应用。

第五方面，本发明提供了用于鉴定番木瓜果肉果糖含量的试剂盒，所述试剂盒包含上述PCR引物对。

第六方面，本发明提供了一种制备上述SNP分子标记的方法，所述方法包括：以含有SNP标记的核苷酸序列为基础序列，利用上述PCR引物对，以番木瓜基因组DNA为模板进行PCR扩增，使所述SNP标记转化为770bp的分子标记。

进一步地，所述PCR扩增的反应体系为：2×Rapid Taq Master Mix12.5μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，DNA模板1μL，ddH

进一步地，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min。

与现有技术相比，本发明至少可实现如下有益效果之一：

1、本发明获得了与番木瓜果肉果糖含量极显著相关的SNP分子标记，利用该分子标记对番木瓜育种材料进行检测，可在不用种植等待番木瓜植株开花结果的情况下，准确高效的预测其果糖含量的高或低，大大提高了番木瓜育种的选择效率。

2、本发明用于检测与番木瓜果肉果糖含量相关的SNP分子标记的对引物对，特异性强，能准确扩增得到含有本发明SNP分子标记位点的序列，利用该引物对制备试剂盒，可辅助选择育种，高效鉴定出番木瓜的高果糖含量和低果糖含量。

3、本发明可高效地辅助番木瓜的育种选择，具有极高的经济价值。

本发明中，上述各技术方案之间还可以相互组合，以实现更多的优选组合方案。本发明的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分优点可从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过说明书以及附图中所特别指出的内容中来实现和获得。

附图说明

附图仅用于示出具体实施例的目的，而并不认为是对本发明的限制，在整个附图中，相同的参考符号表示相同的部件。

图1为本发明中与番木瓜果肉果糖含量极显著相关的SNP标记的曼哈顿图。

图2为本发明中与番木瓜果肉果糖含量极显著相关的SNP标记所在Chr02染色体局部区间的曼哈顿图和连锁不平衡单倍快图。

图3为本发明中与番木瓜果肉果糖含量极显著相关的SNP标记不同基因型亚群之间的果肉果糖差异比较，A等位基因与番木瓜果肉高果糖含量极显著相关。

具体实施方式

下面结合附图来具体描述本发明的优选实施例，其中，附图构成本申请一部分，并与本发明的实施例一起用于阐释本发明的原理，并非用于限定本发明的范围。

随着分子生物学的发展，育种家意识到选择优异性状的本质是选择携带优异基因或基因型的个体。由于确定植株携带性状相关基因难度较大，育种家通过检测与目标基因连锁在一起的遗传标记，来检测植株是否携带优异基因或基因型，无需通过播种和田间性状调查即可预测植株表型性状趋势(标记辅助育种/分子标记育种)。第一代分子标记(RALP、AFLP等)由于各种问题和缺陷逐渐被淘汰，目前SSR和SNP分子标记是最常用的分子标记。

单核苷酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP分子标记具有在个体基因组上分布广泛、数量较多，易于基因分型(SNP的二态性)、适于快速、规模化筛查等优势。

本发明提供了一种与番木瓜果肉果糖含量相关的SNP分子标记，所述SNP分子标记位于Chr02染色体的第36650074位碱基，命名为Cpa02g023590:1559，所述SNP分子标记位于SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第411位。

与现有技术相比，本发明获得了与番木瓜果肉果糖含量极显著相关的SNP分子标记，利用该分子标记对番木瓜育种材料进行检测，可在不用种植等待番木瓜植株开花结果的情况下，准确高效的预测其果糖含量的高或低，大大提高了番木瓜育种的选择效率。

具体来说，所述SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的第411位存在A/C多态性。

进一步地，所述SNP分子标记位点为A的番木瓜果肉果糖含量高于所述SNP分子标记位点为C的番木瓜果肉果糖含量。即所述SNP分子标记位点的A等位基因与番木瓜果肉高果糖含量极显著相关。

第二方面，本发明还提供了上述与番木瓜果肉果糖含量相关的SNP分子标记在番木瓜分子标记辅助选择育种中的应用。

利用该分子标记对番木瓜育种材料进行检测，SNP分子标记位点为A的番木瓜果肉果糖含量高于SNP分子标记位点为C的番木瓜果肉果糖含量。因此，可在不用种植等待番木瓜植株开花结果的情况下，准确高效的预测其果糖含量的高或低，大大提高了番木瓜育种的选择效率，可高效地辅助番木瓜的育种选择，具有极高的经济价值。

第三方面，本发明还提供了用于上述与番木瓜果肉果糖含量相关的SNP分子标记的PCR引物对，包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。该引物对特异性强，能准确扩增得到含有本发明SNP分子标记位点的序列。

第四方面，本发明还提供了上述PCR引物对在番木瓜分子标记辅助选择育种中的应用。

第五方面，本发明还提供了用于鉴定番木瓜果肉果糖含量的试剂盒，所述试剂盒包含上述PCR引物对。利用该引物对制备的试剂盒，可辅助选择育种，高效鉴定出番木瓜的高果糖含量和低果糖含量。

需要说明的是，本发明中的“高果糖含量”和“低果糖含量”是相对而言的，是SNP分子标记位点为A的番木瓜果肉果糖含量与SNP分子标记位点为C的番木瓜果肉果糖含量之间相对而言。

第六方面，本发明还提供了一种制备上述与番木瓜果肉果糖含量相关的SNP分子标记的方法，所述方法包括：以含有SNP标记的核苷酸序列为基础序列，利用上述PCR引物对，以番木瓜基因组DNA为模板进行PCR扩增，使所述SNP标记转化为770bp的分子标记。

值得注意的是，所述PCR扩增的反应体系为：2×Rapid Taq Master Mix 12.5μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，DNA模板1μL，ddH

进一步地，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min。

具体地，与番木瓜果肉果糖含量相关的SNP分子标记的开发过程包括以下步骤：

1、番木瓜全基因组SNP标记开发

对从墨西哥、南非、中国广西、中国海南等地收集到的340份番木瓜，播种于中国热带农业科学院文昌基地，土壤肥力中等、无病虫害，多年多点种植并收集表型性状数据，表型性状数据经Excel2016整理后用于后续分析。

从番木瓜植株上取新鲜幼嫩叶片1～2g，液氮研磨后按照选用天根植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)提取番木瓜材料DNA。利用超微量分光光度计及1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品质量和浓度，选择电泳条带清晰、胶孔内无明显蛋白质残留，OD260/OD280介于1.8～2.0，浓度大于>100ng/μL的DNA样品进行建库测序。

采用超声波破碎(或酶切)的方法，将DNA随机打断成300bp左右的片段，DNA片段经末端修复、3'端加A、加测序接头偶、纯化、PCR扩增完成测序文库的构建。文库经质检合格后通过illumina平台进行测序。测序数据下机后需要按一定的标准对原始数据(Raw reads)进行质控，过滤标准如下：(1)去除带接头(adapter)的序列，(2)去除单端序列含氮量>10％的一对序列，(3)去除低质量碱基数超过50％的一对序列。去除低质量序列、接头序列、不准确序列后的Clean reads进行下一步序列比对。参考基因组选择发明人番木瓜果用材料“kamiya”基因组，使用BWA-mem软件将Clean reads与参考基因组序列比对，使用samtools软件对比对结果排序，GATK4.0软件去除PCR重复序列后进行变异检测，以QD>2.0，QUAL>30.0，FS<60.0，MQ>40.0的硬标准过滤变异合集，保留具有统计学意义的变异位点数据集。按MAF(次等位基因频率)>＝0.05，miss(缺失率)<＝0.2为标准再次过滤变异位点，获得高质量的变异位点合集。

2、GWAS分析番木瓜果肉果糖含量相关SNP位点

全基因组关联分析(GWAS)是基于高通量SNP分子标记与性状间关系，挖掘性状相关候选基因的方法，其基本原理是群体中基因间连锁不平衡(LD)现象。

利用基因组DNA区间特征描述文件对变异位点进行注释，分别统计落于基因编码区、非编码区、基因间区、非同义突变等变异位点的数量。通过群体结构分析获得群体亲缘关系矩阵后，结合表型性状数据进行全基因组关联分析，检测到与番木瓜果肉果糖含量QTL位点，确定了番木瓜果肉果糖含量相关的候选基因Cpa02g023590。

3、筛选候选标记

基于GWAS分析中关联到的区域内的SNP标记，比较等位基因频率、性状差异、基因表达量差异，结果见图3。在Cpa02g023590基因promoter区域筛选到与番木瓜果肉果糖含量相关的SNP位点(Cpa02g023590:1559(A/C))。

4、标记开发和检测

利用引物序列SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3通过普通PCR扩增得到770bp的DNA片段，扩增体系如下：2×Rapid Taq Master Mix 12.5μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，DNA模板1μL，ddH

表1.群体中不同基因型个体数和果肉果糖含量平均值(mg/g)

下面，通过具体实施例进一步说明本发明的与番木瓜果肉果糖含量相关的SNP分子标记及其应用。

实施例1

在中国热带农业科学院生物技术所文昌基地番木瓜种植区随机挑选50株番木瓜(不包括用于SNP标记开发的340份番木瓜)，经测序后基因分型和番木瓜果肉果糖含量调查；测序所用引物为序列SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，扩增体系如下：2×Rapid TaqMaster Mix 12.5μL，10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，DNA模板1μL，ddH

测序结果如表2-3所示。

表2. 50株番木瓜在Cpa02g023590:1559不同基因型和果肉果糖含量(mg/g)

表3. 50株番木瓜在Cpa02g023590:1559不同基因型和果肉果糖含量(mg/g)

由表2和表3可知本发明的SNP分子标记对高果糖含量和低果糖含量番木瓜的鉴定准确率较高，AA基因型的番木瓜果肉果糖含量高于GG基因型的番木瓜。即Cpa02g023590:1559位点的A等位基因与番木瓜果肉高果糖含量极显著相关。

综上，本发明的SNP分子标记能够准确对番木瓜果肉果糖含量进行较精确预期，不仅快速有效，而且不用等待植株开花结果在苗期即可进行鉴定，大大缩短了育种的周期，可以在生产中大规模应用。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。