人BUB1基因在制备抗肿瘤药物中的用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及人BUB1基因在制备抗肿瘤药物中的用途。

背景技术

胆管癌(CCA)属于胆管上皮的高浸润癌，死亡率高，因缺乏临床症，CCA在早期阶段不容易诊断。CCA患者占肝胆癌的10-20％，近年来，CCA的发病率和死亡率正在迅速增加。目前，CCA尚无临床治疗方法，切除术是长期生存的唯一可能性。但CCA患者的5年生存率仅为10％，因此迫切需要确定CCA的新疗法。

BUB1属于丝氨酸/苏氨酸激酶，在染色体分离、KT-MT相互作用和SAC功能方面中具有多种功能。

目前，未见关于BUB1基因在制备抗胆管癌药物中的用途的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供人BUB1基因在制备抗肿瘤药物中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：(论述独权及从权技术方案)

抑制人BUB1基因的shRNA在制备抗肿瘤药物中的用途。

抑制人BUB1基因的shRNA在制备抗胆管癌药物中的用途。

以上用途中，所述shRNA序列为：

ShRNA1-F：5’-GATCCGTCCTTCAGATGCTTGAAGCCTTCAAGAGAGGCTTCAAGCATCTGAAGGACTTTTTG-3’；

ShRNA1-R：5’-AATTCAAAAAGTCCTTCAGATGCTTGAAGCCTCTCTTGAAGGCTTCAAGCATCTGAAGGACG-3’；

或

ShRNA2-F：5’-GATCCGATGCTTGAAGCCCACATGCATTCAAGAGATGCATGTGGGCTTCAAGCATCTTTTTG-3’；

ShRNA2-R：5’-AATTCAAAAAGATGCTTGAAGCCCACATGCATCTCTTGAATGCATGTGGGCTTCAAGCATCG-3’；

或

ShRNA3-F：5’-GATCCGCAGAGCTACAAGGGCAATGATTCAAGAGATCATTGCCCTTGTAGCTCTGCTTTTTG-3’；

ShRNA3-R：5’-AATTCAAAAAGCAGAGCTACAAGGGCAATGATCTCTTGAATCATTGCCCTTGTAGCTCTGCG-3’。

本发明还涉及抗胆管癌药物的制备方法，包括以下步骤，从Genbank中调取人BUB1基因序列；预测多个shRNA靶点；

筛选shRNA靶点，在所选shRNA靶点序列中添加环状序列，得到针对BUB1基因的有效的shRNA序列；

根据shRNA序列，设计并合成两端含酶切位点的双链DNA寡核苷酸序列；

慢病毒载体双酶切后与双链DNA双链DNA寡核苷酸序列连接，构建表达BUB1基因shRNA序列的RNAi穿梭质粒；

将RNAi穿梭质粒转化至感受态细胞，进行克隆；

将RNAi穿梭质粒和慢病毒包装需要的辅助载体共转染人胚肾细胞293T，产生重组慢病毒颗粒。

以上抗胆管癌药物的制备方法中，所述慢病毒载体选自pLVX-shRNA2-Puro。

本发明的有益效果在于：本发明通过构建了人BUB1基因小分子干扰RNA、人BUB1基因干扰核酸构建体、人BUB1基因干扰慢病毒并公开了它们在制备抗肿瘤药物的用途。提供shRNA或者包含该shRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。

附图说明

图1为人胆管癌细胞RBE在制得的慢病毒感染下BUB1表达水平变化图；

图2为人胆管癌细胞HuCC-T1在制得的慢病毒感染下BUB1表达水平变化图；

图3为人胆管癌细胞RBE在制得的慢病毒感染下的细胞增殖能力变化图；

图4为人胆管癌细胞HuCC-T1在制得的慢病毒感染下的细胞增殖能力变化图；

图5为人胆管癌细胞RBE在制得的慢病毒感染下的细胞凋亡水平变化图；

图6为人胆管癌细胞HuCC-T1在制得的慢病毒感染下的细胞凋亡水平变化图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

研究发现BUB1可磷酸化Cdc20和组蛋白H2A，导致人细胞中的活性转录；BUB1突变可导致小鼠染色体分离错误和非整倍性增加；BUB1过表达可驱动转基因小鼠自发性肿瘤发生并加速Myc诱导的淋巴瘤发展。BUB1的过表达与几种人类癌症的发生和进展密切相关，包括乳腺癌、前列腺癌和肝细胞癌，以及淋巴瘤和卵巢癌，这是因为BUB1过表达导致Aurora-B过度激活可使得染色体错编，从而诱导肿瘤形成。并且BUB1在基底样乳腺癌中表达上调，是维持乳腺癌细胞系中癌症干细胞更新所必需的。BUB1已成为肿瘤治疗靶点，但是关于BUB1在胆管癌中的效果尚不清楚。

慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒的一种，采用慢病毒介导的shRNA能够整合基因组，当发生转录之后，shRNA被输出到细胞质中并被内源性酶Dicer识别，shRNA加工成双链siRNA，然后siRNA与目的基因mRNAs结合，与RNA诱导沉默复合物形成，从而降解目的基因mRNAs发挥RNA干扰效应。与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比，Lentivirus-shRNA一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，shRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。

本发明揭示了人BUB1基因的用途及其相关药物，为人BUB1基因在肿瘤治疗、肿瘤诊断及药物制备中提供新用途。同时通过构建了人BUB1基因小分子干扰RNA、人BUB1基因干扰核酸构建体、人BUB1基因干扰慢病毒并公开了他们的用途。本发明提供的shRNA或者包含该shRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人BUB1基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中BUB1基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。

本发明以RNA干扰为手段，研究了BUB1基因在肿瘤发生和发展中的作用，公开了一种抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法，该方法包括：向肿瘤细胞施用一种能够特异性抑制BUB1基因的转录或翻译，或能够特异性抑制BUB1蛋白的表达或活性的分子，以此来抑制肿瘤细胞的生长、增殖、分化和/或存活。所述肿瘤细胞选自胆管癌之任一。

实施例1

抗胆管癌药物的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：从Genbank中调取人BUB1基因序列；预测多个shRNA靶点；

登录美国国立生物信息中心(NCBI)查询人BUB1(NM_004336.5)的碱基序列，利用BLOCK-iT

表1

步骤2：筛选shRNA靶点，在所选shRNA靶点序列中添加环状序列，TTTTT+酶切位点等，得到针对BUB1基因的有效的shRNA序列；

步骤3：根据shRNA序列，设计并合成两端含酶切位点的双链DNA寡核苷酸序列；

具体的，从表1中筛选3条Rank分值较大(NO.1、NO.2、NO.3)的序列进行shRNA序列设计，添加TTCAAGAGA(环状结构)、TTTTT+酶切位点，并且设计互补的反义寡核苷酸链，退火合成两端含酶切位点的双链DNA寡核苷酸序列，如表2所示：

表2

其中，合成两端含酶切位点的双链DNA寡核苷酸序列包括将单链的shRNA上下游片段进行退火，形成双链DNA片段。

退火反应体系如表3所示：

表3

步骤4：慢病毒载体双酶切后与双链DNA寡核苷酸序列连接，构建表达BUB1基因shRNA序列的RNAi穿梭质粒；

具体的，慢病毒载体选自pLVX-shRNA2-Puro载体，pLVX-shRNA2-Puro载体的酶切体系如表4所示：

表4

pLVX-shRNA2-Puro载体酶切条件：37℃，2-3h；通过琼脂糖凝胶鉴定，切胶回收；

将pLVX-shRNA2-Puro载体与上述双链DNA寡核苷酸序列通过酶切位点相连，由于shRNA片段已带有酶切后的粘性末端，故可直接与酶切后的载体进行连接。

酶切后的载体和基因连接体系如表5所示。

表5

步骤5：将RNAi穿梭质粒转化至感受态细胞，进行克隆；

具体的，将连接的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞Stbl3中。

具体操作如下：

1)将感受态细胞Stbl3(100μL)从-80℃冰箱取出，迅速放入冰上，静置5min融化，分装成2管，各50μL；

2)加入1μL重组质粒(DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％，1ng的cccDNA即可使50μL的感受态细胞达到饱和)，轻轻震荡混匀，再置于冰上冰浴30min；

3)将上述混合物置42℃水浴锅内水浴90s进行热休克，迅速转移到冰上，开始计时放置3min；

4)加入无抗性LB液体培养基900μL，恒温摇床温度设定37℃，转速200r/min，培养1h；

5)取5块已铺好固体LB-AMP的培养皿，取100μL悬浮的菌液用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀涂布，37℃，恒温培养箱内倒置培养15h，40μl；

6)挑取单个菌落接种于15mL(小提)含氨苄抗性LB液体培养基，恒温摇床温度设定37℃，转速180r/min，培养过夜；

7)菌液测序：测序结果采用DNAMAN进行比对。

8)质粒小抽：将测序正确的菌液转接于10ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用天根无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的质粒进入下游流程。

步骤6：将RNAi穿梭质粒和慢病毒包装需要的辅助载体共转染人胚肾细胞293T，产生重组慢病毒颗粒。

具体的，BUB1-shRNA干扰慢病毒包装程序如下：

293T细胞种于10cm-dish中，种板密度为第二天转染前细胞密度达到80％左右，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养。采用第三代慢病毒包装系统(辅助质粒：MDLg/pRRE，pRSV-Rev，pMD2.G)进行慢病毒包装，按照Lipofectamine3000说明书进行操作将下述质粒混合液加入293T细胞培养皿中，分别于48小时和72小时收集含慢病毒的细胞上清。质粒共转体系如表6所示：

混合两次次收集的细胞上清液于4℃，3000g条件下离心25min，使细胞碎屑沉淀，0.45μm微孔滤膜过滤上清液于超速离心管中，100000g离心120min。倒掉上清液，用1mlPBS溶液充分溶解管底病毒，枪头吹打数次，分装后迅速放置于-80℃冰箱长期保存，以此作为制备抗肿瘤药物的用途，特别是作为制备抗胆管癌药物中的用途。

实验例1

Q-PCR检测人胆管癌细胞BUB1基因干扰效率；

稳定低表达的细胞株建立：RBE和HuCC-T1人胆管癌细胞接种于6孔板中。待细胞密度达到60％时，使用预实验确定的慢病毒感染MOI及最佳感染条件进行正式感染实验，细胞感染3-4天后，使用NucleoZol试剂提取细胞总RNA，使用Promega反转录试剂盒将1μgRNA反转录为cDNA，按GoTaq

以上涉及的反转录体系如下：

第一阶段：将总RNA变性解链；体系如表7所示：

表7

按上面所写添加试剂，微离心10s混匀，70℃水浴5min后立即冰浴5min；

第二阶段：逆转录反应；体系如表8所示；

表8

按上面所写添加试剂，微离心10s混匀，25℃5min，42℃60min；70℃15min。

real-timePCR反应体系如表9所示；

表9

qPCR程序设置如表10所示；

表10

参照图1以及图2，实验结果表明，与阴性干扰组对比，RBE和HuCC-T1人胆管癌细胞中BUB1表达水平分别下调了。

实验例2

CCK-8法检测对照组和sh-BUB1干扰组人胆管癌细胞的增殖情况；

不同组的RBE和HuCC-T1人胆管癌细胞培养24h后经胰酶消化收获细胞，以4*10

,参照图3以及图4，实验结果显示，与对照组相比，干扰组的RBE和HuCC-T1人胆管癌细胞的增殖能力减弱。

实验例3

流式细胞术检测对照组和sh-BUB1干扰组人胆管癌细胞的凋亡情况；

不同组的RBE和HuCC-T1人胆管癌细胞经胰酶消化后收集细胞，用4℃预冷的PBS洗细胞两次，用250μL结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1×10

参照图5至图6，实验结果显示，干扰组的RBE和HuCC-T1人胆管癌细胞的凋亡水平显著高于对照组。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。