AFP检测试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及光激化学发光技术领域，特别涉及AFP检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

AFP是单链糖蛋白，分子量大约为70,000道尔顿。1956年Bergstrand和Czar首次把AFP称为胎儿蛋白质。其临床检测意义主要在于对原发性肝癌以及新生儿畸形的诊断。AFP对原发性肝癌的诊断是一项很有价值的测定。同时，AFP增高还常见于部分恶性畸胎瘤、胃肝样腺癌、胆道系肿瘤、结肠癌、胃癌、乳腺癌及曾注射过马血清预防针的正常人。在肝癌，睾丸癌或卵巢癌患者的血清中，AFP可显著性升高。定量测定血清AFP水平，对于怀疑或已诊断的肝癌、睾丸或卵巢生殖细胞肿瘤患者的处置，是非常有价值的。同时，AFP和白蛋白共有相当的同源序列和某些生理功能。胎儿在肝脏、卵黄囊和胃肠道内合成AFP。胎儿产生的AFP分泌到胎儿血清内，在妊娠13周时达到峰值，然后在妊娠过程中含量逐渐降低。在出生后短时间内，新生儿的AFP水平达到正常成人水平。通过对妊娠15～20周妇女的血清和腹水样品的AFP检测，联合超声波扫描术和羊膜造影术，可筛查开放性NTDS(神经管缺陷)。无脑儿、脊柱裂、毛细血管扩张症、酪氨酸血症、Rh因子不合等，羊水中的AFP呈现增高；而先天愚型，羊水中的AFP则降低。此外，AFP，人促性腺绒毛膜激素(HCG)与游离雌三醇的三联检测，则被广泛的应用于与唐氏综合症的风险评估，检出率高达90％。

光激化学发光的基础原理是一种均相免疫反应。它是基于两种微粒表面包被的抗原或抗体，在液相中形成免疫复合物而将两种微粒拉近。在激光的激发下，发生微粒之间的单线态氧的转移，进而产生高能级的红光，通过单光子计数器和数学拟合将光子数换算为分析物的浓度。而当样本不含分析物时，两种微粒间无法形成免疫复合物，两种微粒的间距超出单线态氧传播范围，单线态氧在液相中迅速淬灭，检测时则无高能级红光产生。

光激化学发光是一种典型的均相免疫分析方法，它是以“双球”为基本特征。所述“双球”是指发光系统由“发光微球”和“感光微球”构成，且两种微球在液相中有很好悬浮特性。微球在液相中和抗原或抗体相遇完全符合液态动力学特征。基于两种被包被在纳米微球表面的抗原或抗体在液相中形成免疫复合物，从而将两种纳米微球拉近。在光的激发下，两种纳米微球之间发生单线态氧的转移，进而产生高能级的红光，通过光子计数器和数学拟合将光子数换算为靶分子浓度。当待测样本中不含靶分子时，两种纳米微球间就无法形成免疫复合物，此时两种纳米微球的间距超出单线态氧传播范围(200nm)，单线态氧在液相中迅速淬灭，检测时则没有高能级红光信号产生。该方法具有快速、均相(免冲洗)、高灵敏和操作简单的特点。

其中，感光试剂是商品试剂盒中不可或缺的重要组成成分之一，它的作用在于其试剂中的感光微球受外在激发光的激发后能够产生单线态氧，单线态氧把能量传递至距离感光微球200nm范围内的发光微球，最终才能产生化学发光信号，从而实现对未知物的检测。感光微球中填充的感光染料浓度的选择、感光微球在液相中产生单线态氧的效率及时间、感光试剂的生产成本等，均影响光激化学发光检测试剂盒产品最终的临床应用及化学发光检测结果。目前，现有技术中缺乏高性能、符合临床检验需求的感光试剂。

因此，提供AFP检测试剂盒及其使用方法具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供的试剂盒包括AFP试剂1(AFP抗体包被的发光微粒)、AFP试剂2(生物素标记的AFP)和感光试剂，在均相条件下，采用双抗体夹心免疫光激化学发光法定量检测人血清或血浆样本中甲胎蛋白AFP的浓度。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供了感光微球在制备检测AFP的微球组合物、试剂组合、试剂盒、检测系统和/或检测装置中的应用，

检测由发光微球-AFP免疫复合物-感光微球形成的发光复合物所产生的化学发光信号；

所述发光微球包括载体和通过所述载体承载的发光物质，其能够与单线态氧反应产生化学发光；

所述感光微球包括载体和通过所述载体承载的感光物质，其能够在光激发下产生单线态氧；所述感光微球的感光量Ps在1.34到16.28之间；所述感光量Ps＝OD

所述OD

所述感光微球的浓度

其中，k是载体浓度-吸光度曲线的线性关系中对应的斜率，b是所述载体浓度-吸光度曲线的线性关系中对应的截距；OD

在本发明的一些具体实施方案中，所述C

在本发明的一些具体实施方案中，所述载体浓度-吸光度曲线的线性关系为y＝kx+b，其中：

x为预设粒径的载体的不同浓度，y为载体在对应的所述浓度下的吸光度值，k为斜率，b为截距。

在本发明的一些具体实施方案中，所述波长λ

其中，OD

在本发明的一些具体实施方案中，所述波长λ

在本发明的一些具体实施方案中，所述感光微球为填充有感光物质的载体，其中，所述波长λ

在本发明的一些具体实施方案中，所述波长λ

在本发明的一些具体实施方案中，所述感光微球按照所述载体与所述感光物质的质量比为10:(0.04～4)制得。

在本发明的一些具体实施方案中，所述载体的粒径为190nm～280nm。

在本发明的一些具体实施方案中，所述感光微球表面没有包被多糖，且所述感光微球表面连接有亲和素，所示亲和素选自卵白亲和素、卵黄亲和素、链霉亲和素、中性亲和素及类亲和素分子，优选为链霉亲和素。

在本发明的一些具体实施方案中，所述感光微球的感光量Ps在4.07到16.28之间。

第二方面，本发明还提供了检测AFP的微球组合物，包括发光微球和所述感光微球。

第三方面，本发明还提供了检测AFP的试剂组合，包括感光试剂、发光试剂和标记试剂；

所述感光试剂包括缓冲溶液和保存于所述缓冲溶液中的所述感光微球；

所述发光试剂包括发光微球和能够与AFP反应的物质；

所述标记试剂包括标记物以及所述能够与AFP反应的物质；

所述感光试剂还包括能够与所述标记物结合的物质；

作为优选，所述能够与AFP反应的物质包括但不限于：AFP抗体；

作为优选，所述标记物包括但不限于：生物素；

作为优选，所述能够与所述标记物结合的物质包括但不限于：链霉亲和素。

在本发明的一些具体实施方案中，每升体积的所述缓冲溶液中的糖含量为1g±0.2g。

第四方面，本发明还提供了检测AFP的试剂盒，

包括以下任意项中的一种或多种，以及能够与AFP反应的物质、可接受的辅料、助剂或承载物；

(I)、所述感光微球；或

(II)、所述微球组合物；或

(III)、所述试剂组合；

所述承载物包括但不限于：试剂瓶、试剂卡、试纸条或芯片；

所述能够与AFP反应的物质包括但不限于：AFP抗体。

在本发明的一些具体实施方案中，，所述试剂组合包括发光试剂、标记试剂和感光试剂；

所述发光试剂包括但不限于：AFP抗体包被的发光微粒；

所述标记试剂包括但不限于：生物素标记的AFP抗体；

所述感光试剂包括但不限于：链霉亲和素包被的感光微球。

第五方面，本发明还提供了检测AFP的系统，

包括如下任意项中的一种或多种，以及可接受的模块或部件；

(I)、所述感光微球；或

(II)、所述微球组合物；或

(III)、所述试剂组合；或

(IV)、所述试剂盒；

所述能够与AFP反应的物质包括但不限于：AFP抗体。

本发明的有益效果包括但不限于：

本申请的技术方案，在确定吸光度值OD

基于感光量ps为1.34

本发明公开了测定人血清或者血浆样品中甲胎蛋白AFP的浓度，同时公开了使用方法，该方法的检测原理为双抗体夹心法，检测甲胎蛋白AFP的浓度，该方法的优点灵敏度高，精密性好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本申请具体实施例示出的粒径仪测出的20ug/ml载体的粒径结果图；

图2示本申请具体实施例示出的粒径仪测出的20ug/ml感光微球的粒径结果图；

图3示本申请具体实施例示出的感光物质的波长-吸光度曲线；

图4示本申请具体实施例示出的不同浓度的载体的波长-吸光度曲线；

图5示本申请具体实施例示出的不同浓度的感光微球的波长-吸光度曲线；

图6示本申请具体实施例示出的10μg/ml的载体和感光微球的波长-吸光度曲线；

图7示本申请具体实施例示出的波长500nm下的载体的载体浓度-吸光度曲线；

图8示本申请具体实施例示出的感光物质的浓度-感光量曲线；

图9示实施例5中试剂盒的使用方法。

具体实施方式

本发明公开了AFP检测试剂盒及其使用方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本申请使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。

应当理解，尽管在本申请可能采用术语“第一”、“第二”、“第三”等来描述各种信息，但这些信息不应限于这些术语。这些术语仅用来将同一类型的信息彼此区分开。例如，在不脱离本申请范围的情况下，第一信息也可以被称为第二信息，类似地，第二信息也可以被称为第一信息。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本申请的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

发光微球可以是通过功能基团被包被在第一载体上形成填充有发光化合物的高分子微粒，此时可以称为发光微球或发光微粒。所述发光微球表面有亲水性的羧基葡聚糖，内部承载有能够与活性氧(如，单线态氧)发生反应的化学发组合物。在本发明的一些具体实施例中，所述化学组合物，其经历与单线态氧的化学反应以形成不稳定的亚稳态中间体，所述亚稳态中间体可以分解，同时或随后发光。在本发明的一些优选实施例中，所述发光组合物例如有铕配合物等，于此仅举例说明，不作限制。

本申请中，感光微球包括第二载体和通过载体承载的感光物质。第二载体(也可以称为空白微球)可以是高分子微粒，感光物质可以包被于载体的表面和/或填充于第二载体的内部。其中，感光物质可以在光激发下能够产生活性氧(如，单线态氧)，高分子微粒可以为聚苯乙烯微球，当然，也可以为其它可供检测的其他材质的微球，于此不作限制。感光物质例如可以是光敏剂或感光染料，它可以是本领域已知的感光物质，例如亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、酞菁和叶绿素，且不局限于此。感光微球还可以填充其他敏化剂，其非限定性的例子是某些化合物，它们催化过氧化氢转化为单线态氧和水。其他一些敏化剂的例子包括：1,4-二羧基乙基-1,4-萘内过氧化物、9,10-二苯基蒽-9,10-内过氧化物等，加热这些化合物或者这些化合物直接吸收光会释放单线态氧。

本申请所述的免疫复合物是指抗体与抗原结合所得到的一种复合物，如抗原-抗体、抗原-抗体-抗原、抗体-抗原-抗体、抗原-抗体-二抗等复合物均是本申请所述的免疫复合物。发光复合物指的是发光微球和感光微球直接或间接连接所形成的复合物，能够接收特定波长的激光照射后产生化学反应发出可检测的光。

一实施例中的用于光激化学发光检测的感光微球，感光微球的感光量Ps在1.34到16.28之间；感光微球的感光量Ps根据下述公式(1)确定。

Ps＝ OD

其中，OD

本申请中，感光微球包括载体和通过载体承载的感光物质。载体可以是高分子微粒，感光物质可以包被于载体的表面和/或填充于载体的内部。其中，感光物质可以在光激发下能够产生活性氧(如，单线态氧)，高分子微粒可以为聚苯乙烯微球，当然，也可以为其它可供检测的其他材质的微球，于此不作限制。感光物质例如可以是光敏剂或感光染料，它可以是本领域已知的感光物质，例如亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、酞菁和叶绿素，且不局限于此。感光微球还可以填充其他敏化剂，其非限定性的例子是某些化合物，它们催化过氧化氢转化为单线态氧和水。其他一些敏化剂的例子包括：1,4-二羧基乙基-1,4-萘内过氧化物、9,10-二苯基蒽-9,10-内过氧化物等，加热这些化合物或者这些化合物直接吸收光会释放单线态氧。

进一步地，通过分光光度计等设备采用300nm～800nm范围的可见光对该溶于缓冲溶液的浓度为C

需要说明的是，在未使用之前，感光微球在保存时的初始状态一般为冻干的固态物质或冷藏的液体。当感光微球为固态物质时，需要加入缓冲溶液进行复溶，复溶后的感光微球溶液的浓度即为初始浓度C

进一步地，为了便于明确感光微球的浓度C

其中，k是载体浓度-吸光度曲线的线性关系中对应的斜率，b是所述载体浓度-吸光度曲线的线性关系中对应的截距，OD

具体地，为了获得满足感光量Ps范围的感光微球的浓度C

y＝kx+b(3)

其中，x为预设粒径的载体的不同浓度，y为载体在对应的浓度下的吸光度值，k为公式(2)中的斜率，b为公式(2)中的截距。也就是说，通过公式(3)的相关计算，可以确定公式(2)中的k和b的数值，进而确定感光微球的浓度C

在确定波长λ

具体地，在已知感光量Ps的范围在1.34到16.28之间，及根据上述计算已知k、b和λ

综上可知，在已知感光微球浓度C

进一步地，为了减少载体及感光物质以外的物质对吸光度值的影响，在一实施方式中，感光微球的表面不包被多糖；或者每克质量的所述感光微球的多糖含量不高于25mg。其中，多糖是指含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物，例如葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖等。通过不添加多糖，或者控制多糖的含量，从而减少对吸光度值的测定结果的干扰，继而使临床应用时的检测结果更准确。

实验原料及设备

表1

表2

本发明提供的AFP检测试剂盒及其使用方法中，所用原料与试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1发光浓溶液的制备

1.原料透析，取1mg抗体1，置于3.5KD透析袋中，在0.05M CB缓冲液(pH9.6)透析3次；

2.浓度测定，将透析回收的蛋白吸出转移至干净离心管中，使用BCA法测浓度，浓度为2.62mg/ml。

3.微粒处理，取10mg/ml FG微粒1ml于离心管中，经过离心30分钟，弃上清，用0.05M CB缓冲液超声重悬，重复操作一次，定容50mg/ml备用。

4.偶联反应，按微粒：蛋白的质量比为10:0.5，将微粒与抗原蛋白混合，使用旋转混匀方式进行偶联反应，旋转反应20小时；使用0.05M CB缓冲液现配8mg/mL的NaBH4溶液，并即刻向每支反应管中添加，反应2小时；

5.定容，清洗及定容：重复两次离心清洗，除去多余蛋白，最终定容至发光试剂缓冲液中10mg/ml。

6.发光试剂配制，使用50ml的发光试剂缓冲液，将以上制备的发光浓溶液稀释至50ug/ml，平衡2h，备用。

实施例2生物素试剂的制备

1.原料透析，分别取1mg抗体2，分别置于3.5KD透析袋中，在0.1MNaHCO3缓冲液(pH8.5)透析3次；

2.浓度测定，将透析回收的蛋白吸出转移至干净离心管中，使用BCA法测浓度，浓度为1.48mg/ml。

3.标记反应，配制20mg/ml的生物素NHS活性酯，按照蛋白：生物素摩尔比为1:30比例进行标记反应，使用旋转混匀方式进行标记反应，反应20小时。

4.标记后产物的透析，产物透析，透析袋规格：3500D，透析缓冲液：0.02MHEPES缓冲液，透析温度：2～8℃，透析时间及次数：每次透析3小时，3次；将透析回收的蛋白吸出转移至干净离心管中，使用BCA法测定蛋白浓度，浓度为1.68mg/ml，备用。

5.生物素试剂配制，使用50ml的生物素试剂缓冲液，将以上制备的生物素浓溶液稀释至1ug/ml，平衡2h，备用。

实施例3感光试剂的制备

一、微球的制备

(一)载体的制备

a)准备100ml的三口烧瓶，向三口烧瓶中分别加入40mmol苯乙烯、5mmol丙烯醛、10ml水，搅拌10min后，向三口烧瓶通入N

b)称取0.11g过硫酸铵和0.2g氯化钠并分别溶于40ml水中配置成水溶液。将该水溶液加入到步骤a)的三口烧瓶的反应体系中，并继续通N

c)将反应体系升温至70℃，反应15小时，获得乳液。

d)将反应完成后的乳液冷却至室温，再用合适的滤布对乳液进行过滤。将过滤后得到的乳液用去离子水通过离心沉降清洗，直至离心出的上清液的电导率接近去离子水，然后用水稀释，以乳液形式保存。

e)由纳米粒度仪测得该乳液中的乳胶微球粒径的高斯分布平均粒径为190nm。

(二)感光微球的制备

a)准备25ml的圆底烧瓶，加入0.11g酞菁铜(即感光物质)，10ml N,N-二甲基甲酰胺，通过磁力搅拌均匀，将圆底烧瓶进行水浴升温至75℃，获得感光物质溶液。

b)准备100ml的三口烧瓶，加入10ml 95％乙醇、10ml水和10ml浓度为10％的上述1.e)制备的载体，通过磁力搅拌均匀，将三口烧瓶水浴升温至70℃。

c)将步骤a)中的感光物质溶液缓慢滴加至步骤b)中的三口烧瓶中，70℃反应2小时后停止搅拌，自然冷却，获得乳液。可以理解，上述步骤b)载体和步骤a)感光物质溶液的质量比例可以根据后续实验需求进行调整。

d)将上述步骤c)获得的乳液按照30000G离心力离心1小时，离心后弃去上清液，再用50％乙醇重新悬浮。重复离心清洗三次后用pH值＝10的50mmol/L CB缓冲液将微球重新悬浮至后续实验中所需浓度。

二、确定感光微球浓度C

本实验采用预设粒径建立载体浓度与吸光度值的线性关系，从而根据上述公式(2)中的吸光度值OD

为了确保实验所使用的微球的粒径的一致性，预先进行粒径检测。其中，实验涉及的主要原料及设备如表3所示。

表3

实验过程具体如下：

1.1微球粒径的选择

本实验中，为了确保数据的一致性，可以统一利用粒径相同，例如粒径为190nm的感光微球和载体进行后续实验。

1.2配制不同浓度的载体和感光微球

将上述制得的感光微球和空白微球使用去离子水分别稀释，配制不同浓度的载体和感光微球，各自制得的浓度分别为10ug/ml，20ug/ml，30ug/ml，40ug/ml，50ug/ml，60ug/ml，70ug/ml，80ug/ml，90ug/ml，100ug/ml等共计10个浓度。即分别配置10个浓度的载体和10个浓度的感光微球；另外配制5ug/ml的感光物质溶液。

2.微球粒径检测

打开粒径仪，以20ug/ml的载体和感光微球的粒径为例进行检测。

其中，实验数据如图1和图2所示。载体的平均粒径为187.1nm，感光微球的平均粒径为190.9nm。

从粒径仪的检测结果可以看出，载体和感光微球的粒径均为190nm左右，且波峰较窄，微球粒径较均一，可以作为后续实验所需的微球。

3.选择波长

打开紫外分光光度计，预热30min，调节紫外分光光度计，设置波长为300nm～800nm，步长为1nm，使用去离子水校零，依次检测步骤1.2配置的各个浓度的感光微球、载体和感光物质溶液。需要理解的是，当扫描的波长小于300nm时易受其他物质的吸光度值的干扰，从而影响检测结果的准确性和精密性，因此波长设置需要大于300nm。

4.实验数据

4.1感光物质

如图3所示，图3为感光物质在300nm～800nm扫描后的波长-吸光度曲线。由图3可以看出，感光染料分别在360nm、610nm、650nm、680nm处出现明显的波峰，其中680nm处为主峰，即为感光物质的最大特征峰。

4.2载体

图4为10个不同浓度的载体在300nm～800nm扫描后的波长-吸光度曲线。由图4可以看出，不同浓度的载体在经300nm～800nm可见光扫描后，曲线图中并没有特征峰。同时，由图4可知，不同浓度的载体，扫描后对应的吸光度值不一样，载体的微球浓度与吸光度值呈正相关。

4.3感光微球

图5为10个不同浓度的感光微球在300nm～800nm扫描的波长吸光度曲线，由图5可以看出，不同浓度的感光微球在经300nm～800nm可见光扫描后，感光微球分别在360nm、610nm、650nm、680nm处出现明显的波峰，其中680nm处为主峰，即感光微球的最大特征峰与感光物质的最大特征峰相同。即感光微球填充的感光物质将直接影响最大特征峰所对应的波长值。另外，由图5可知，不同浓度的感光微球，扫描后对应的吸光度值不一样，感光微球的微球浓度与吸光度值呈正相关。因此，不同浓度的感光微球会影响感光量Ps的数值。

4.4波长λ

将相同浓度的感光微球和载体的波长-吸光度曲线进行对比。如图6所示，以浓度均为10μg/ml的感光微球和载体为例，相同浓度的载体和感光微球在扫描300nm～800nm波长后，感光微球出现的680nm特征峰为感光物质的最大特征峰。因此，通过读取680nm的吸光度值最能反应感光微球中的感光物质的含量，即可选择最大特征峰对应的波长作为λ

对于波长λ

进一步地，为了精准确定波长λ

为了降低感光物质对测定的微球浓度的影响，所选的波长λ

表4

/>

5.载体浓度-吸光度曲线的建立

本实施例中，通过选用同一种粒径的载体在波长λ

在上述步骤4.4确定波长λ

具体的，为了获得不同浓度的载体，首先通过传统的干燥法得出载体的质量，向已知质量的载体中加入去离子水，配制成10mg/ml的载体，再进一步用去离子水稀释10mg/ml载体，分别配制成浓度为10ug/ml，20ug/ml，30ug/ml，40ug/ml，50ug/ml，60ug/ml，70ug/ml，80ug/ml，90ug/ml，100ug/ml等共计10种浓度的载体。接着对每一浓度的载体通过波长500nm扫描，获得每一种浓度对应的吸光度值OD

由于上述实验仅采用粒径为190nm的载体进行不同浓度的吸光度值的测量而获得k和b的数值，为了验证上述载体浓度x的计算结果的准确度，申请人采用不同粒径的载体进行验证。先分别配制不同粒径的载体，各载体的粒径包括190nm，200nm，220nm，240nm，260nm，280nm，300nm等共计7种粒径。再按照干燥法计算的载体质量，将每一种粒径的载体分别配制成40ug/ml，50ug/ml，60ug/ml的理论浓度值。在已知理论浓度值的前提下，按照波长500nm对每一粒径的每一浓度的载体的吸光度值OD

表5

由表5数据可以看出，当载体的粒径小于或等于280nm时，浓度的回收偏差在10％以内，即根据(OD

从图7可知，本实验中，当C

三、比较不同质量比例的感光微球对感光量的影响

1.制备不同质量比例的感光微球

先按照上述步骤一、2中的感光微球的制备方法，采用不同的载体与感光物质的质量比制备对应的感光微球，即先制备载体与感光物质的质量比例为10:4、10:2、10:1、10:0.2、10:0.04、10:0的6种感光微球，即表4和表5中的微球1至微球6。其中，10:0表示感光微球中不含感光物质，仅为空的载体。接着将制备好的不同质量比例的感光微球分别用去离子水分别稀释，即将制备好的六种质量比例所对应的感光微球各按照500倍、1000倍及2000倍进行稀释，每种质量比例的感光微球均获得3种稀释后的不同浓度的感光微球。将各稀释所得的感光微球经紫外分光度计扫描，获得波长λ

表6

进一步地，根据表6中的每一种质量比例在不同稀释倍数的感光物质的感光量计算对应的感光量均值和变异系数CV值，其中，CV值即标准偏差与均值的比率，具体计算结果可参考表7中的相关数据。

从表6可知，当稀释倍数为500X时，感光微球6的浓度值C

表7

由表6可知，同一质量比例的感光物质在采用不同倍数稀释后计算获得的感光量较为一致；由表7可知，不同质量比例的感光物质的感光量的CV值均在10％以内，说明根据公式(1)和(2)确定感光量的计算结果波动较小，计算较为准确。且说明针对同一质量比例的感光物质，其感光量与对应的稀释倍数即感光微球的浓度有关。

进一步地，根据表7可以绘制获得图8所示的感光物质的不同质量占比与计算所得的感光量的曲线示意图。从图8可知，根据吸光度值检测单位浓度的感光微球的感光量与感光物质的质量占比的相关性一致，即感光物质的质量占比越大，感光物质浓度越高，则感光量越大。于此同时，当载体与感光物质质量比例小于10:1时，感光量与感光浓度的线性关系较优；当载体与感光物质质量比例为10:(2～4)之间时，感光量的增幅明显变小，说明感光物质的占比，即感光物质填充于载体的量逐渐增大至趋于饱和。这样的趋势变化，符合感光微球的真实感光量的变化。另外，当载体与感光物质质量比例10:4时，所获得的感光微球的感光量达到峰值20.12，即使继续提高感光物质的质量占比，也不会进一步增大感光微球的感光量，因此通过控制载体和感光物质的质量比，从而节约材料成本。

实施例4比较不同感光量的感光微球在临床应用中的性能

1.根据不同感光量的感光微球制备不同感光量的感光试剂

a)感光微球混悬液处理：吸取一定量实施例3中步骤一、2制备的感光微球于高速冷冻离心机中离心，弃去上清液后，加入一定量MES缓冲液，超声细胞破碎仪上通过超声波震荡至微球重新悬浮，加入MES缓冲液调节感光微球浓度至100mg/ml。

b)亲和素溶液配制：称量一定量链霉亲和素，加MES缓冲液溶解至8mg/ml。

c)混合：将处理好的100mg/ml感光微球混悬液、8mg/ml的亲和素以及MES缓冲液，以2:5:1的体积比进行混合，迅速混匀，得到反应液。

d)反应：采用MES缓冲液配制25mg/ml的NaBH

e)封闭：采用MES缓冲液配制75mg/ml的Gly甘氨酸溶液以及25mg/ml的NaBH

f)清洗：向步骤e中反应好的溶液中加入MES缓冲液，高速冷冻离心机离心，弃除上清液后，加入新鲜的MES缓冲液，并采用超声法重新悬浮，再次离心，如此反复清洗3次，最后用少量的MES缓冲液进行悬浮，测定固含量为10mg/ml。

g)感光试剂配制：使用感光试剂的通用缓冲液配制出包被有链霉亲和素的采用上述6种质量比例的不同感光量的感光微球，从而配置获得6种不同感光量的感光试剂。6种感光试剂的感光量如表8所示。

表8

2.评估6种不同感光量的感光试剂的性能

将上述6种具有不同感光量的感光试剂应用于临床样本的检测，从而评估不同的感光量的感光试剂在临床应用于检测样本的基本性能。

实验原料及设备：

表9

2.1测试6种不同感光量的感光试剂的灵敏度

采用6种已知不同靶分子浓度的乙肝表面抗原HBsAg的试剂盒样本call至cal6，及采用6种上述制得的不同感光量的感光试剂1至6。首先将每一种样本分别加入各自对应的反应容器中，再各反应容器中分别依序加入发光试剂和生物素试剂，每一反应容器在37℃中温育结合，形成第一复合物发光微球-抗体-抗原-抗体-生物素。再向各反应容器中分别加入对应的感光试剂，利用LiCA检测仪进行光激化学发光检测，获得对应的化学发光信号值。各感光试剂对应检测到的化学发光信号值的数据如表10的第三列至第八列所示。其中样本call的靶分子浓度为0，即不含乙肝表面抗原，样本call为阴性样本，对应测得的数值可以作为各感光试剂的信号值的测值基准。

表10

其中，表10中的第一列的理论值为根据6种样本中的对应已知的靶分子浓度。表10中的第三列至第八列则为各个包含感光试剂和发光试剂的试剂盒在LiCA检测仪中针对各种靶分子浓度的样本测得的化学发光信号值。根据表中数据可知，针对同一个靶分子浓度的样本，感光试剂的感光量在1.34-16.28之间，感光量越大，测得的信号值的数据越大；当感光试剂感光量达到20.12时，反而出现信号下降现象。因此，选择1.34-16.28为感光量Ps的取值范围。

进一步地，如表11所示，针对同一个感光试剂，从不同的靶分子浓度的样本对应的信号值的比值可知，当感光试剂的感光量低于1.34时，感光试剂1对应的各个信号值之间的数值区别度极低，即检测灵敏度低，根据信号值无法区分不同浓度靶分子的样本。而感光试剂2对应的信号值虽然低于感光试剂3至6，但是可以针对不同浓度的靶分子呈现一定的区分。感光试剂3至6对应的信号值，在针对低浓度的靶分子和更高浓度的靶分子均体现明确的信号值；同时，同一感光试剂针对不同大小的靶分子浓度之间对应的信号值数值差距明显，体现出良好的区分度，从而还可以根据信号值判断靶分子的浓度区间。

表11

2.2测试5种不同感光量的感光试剂的检测结果的准确度

实验样品的准备：

选取具有已知相同质量的靶分子并稀释为三种已知不同浓度的质控样本sp1、sp2和sp3；选取靶分子浓度按照线性递减的10个样本S1至S10，所有样本的靶分子均为HBsAg；选取4个不含靶分子的阴性样本N1、N2、N3、N4。

将上述共计17个不同的样本分别与5个不同感光量的感光试剂2至6进行靶分子浓度的测试。根据LiCA检测仪测得的化学发光信号转换得到对应的第三至第七列的浓度数据，如表12所示，将第一列为各样本中的真实浓度数值即理论值作为参照。

表12

由于感光试剂1的感光量过低，因此本次实验无需继续采用感光试剂1参与准确度的性能测试。由表12的测试数据可知，感光试剂的感光量越高，测试数据越接近理论值，即准确度越高。其中感光试剂2的感光量最低，针对低浓度靶分子的样本所测得的浓度数值与理论值波动较大，而针对高浓度靶分子的样本所测得的浓度数值与理论值较为接近，因此感光试剂2的感光量可以视为感光量的下限。也就是说，当感光微球的感光量低于1.34后，将会出现无法准确测得各种浓度的靶分子的情形，不利于满足临床检测需求。

2.3测试5种不同感光量的感光试剂的检测结果的精密性

继续选取上述2.2中的具有已知相同质量的靶分子的、稀释为三种已知不同浓度的样本sp1、sp2和sp3，将每种浓度的样本分为10份，分别与5种感光试剂进行测试，测试获得对应的浓度值，及10份样本的浓度均值Mean、标准差STDEV及变异系数CV。具体数值如表13所示。

表13

从表13的数据可知，感光试剂2针对最低浓度的同一样本sp1的CV值大于10％，说明测试结果的波动较大，精密性一般，因此感光试剂2的感光量1.34可以作为临床检测中的感光微球所需具备的感光量的下限。

实施例5试剂盒的制备

表14

按照表14所示组分，制备试剂盒。

实施例6试剂盒的使用方法

定标：使用配套的AFP校准品进行定标，定标通过进行罗氏赋值样本检测和质控品；

仪器：lica 500；

检测过程如图9所示：

第一步：取样本25ul至反应孔中；

第二步：按照顺序加发光试剂和生物素试剂至加入反应孔中，目的让发光试剂和生物素试剂与样本混合；

第三步：温育，免疫反应需要在37℃温度下抗原抗体结合最为充分，更易形成发光微球-抗体-抗原-抗体-生物素的复合物；

第四步：加入通用液(实施例4制得的感光试剂2～5)，重要的是感光量需达到为1.34

第五步：温育，生物素亲和素结合亦在37℃温度下抗原抗体结合最为充分，更易形成发光微球-抗体-抗原-抗体-生物素-亲和素-感光微球的复合物；从而将感光球与发光球的距离拉近；

第六步：读数，使用680nm的光照射反应孔，使得反应孔中的感光微球发出单线态氧，当感光球与发光球距离小于200nm时，发光球能够吸收单线态氧，从而发出610nm的光，通过PMT放大信号，收集610nm的光信号值；通过校准曲线进行浓度计算，得到浓度值。

实施例7

通过使用实施例5制得的AFP检测试剂盒以及制得的4种通用液(分别为实施例4制得的感光试剂2～5)，检测罗氏赋值样本。

1.定标结果为：

表15

2.区分度：

表16

区分度显示通用液1偏低，通用液2-4区分度基本保持一致。

3.罗氏赋值样本：

表17

感光量的大小对临床样本的测值影响较小。

4.质控品精密性：

表18

/>

精密性结果显示，通用液1的精密性不如通用液2～4；通用液2-4重测性CV在10％以内，精密性良好；

结论：感光量1.34-16.28之间的感光试剂均可适用于光激化学发光AFP试剂盒检测，并且感光试剂的感光量在4.07-16.28之间的光激化学发光AFP试剂盒性能更优。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。