SPAST的错义突变体及其应用

技术领域

本发明涉及基因技术领域，尤其涉及SPAST的错义突变体及其应用。

背景技术

遗传性痉挛性截瘫(HSP，又称Strümpell-Lorrain综合征)是一种罕见的遗传异质性神经退行性疾病，根据民族人群的不同，患病率为4.3-9.8/10万。临床表现主要为进行性痉挛性步态、双下肢静止肌张力增加、肌腱反射亢进、踝关节阵挛性痉挛、病理体征阳性、重症肌无力。可能伴有膀胱直肠功能异常，踝关节振动丧失，爪足，脊柱侧弯。HSP可以在35岁之前(早期发病)或35岁之后(经典发病)开始，根据1981年和1983年哈丁提出的标准，根据体征和症状可分为单纯(无并发症)和复杂(复杂)。单纯形式局限于进行性痉挛性麻痹，临床表现局限于皮质脊髓系统退行性变，包括下肢无力和痉挛，皮质脊髓束体征，振动感和本体感觉障碍，以及可变高渗尿障碍。复杂HSP伴有额外的神经体征，包括智力迟钝、小脑性共济失调、智力缺陷、癫痫、周围神经病、视神经萎缩、色素性视网膜炎、神经系统功能障碍，以及其他锥体外特征，如神经性耳聋、白质病变(WML)和胼胝体薄(TCC)。

到目前为止，SPAST基因突变是引起HSP最常见的原因。SPAST基因位于2p24-p21上，包含17个外显子，编码616氨基酸蛋白，是AAA atp酶蛋白家族的一员，在轴突转运中发挥重要作用，调节微管组织。在不同人群中，约40％的非复杂常染色体显性HSP病例和10％的散发性HSP病例中发现SPAST突变。迄今为止，已在SPAST基因中鉴定出500多个突变(http://www.hgmd.cf.ac.uk)。由SPAST突变引起的HSP病例通常表现为简单的疾病形式，通常与下肢振动感知下降和泌尿系统问题有关。然而，即使在同一家庭中，发病年龄、症状严重程度和症状进展也有很大差异。

因此，有针对性的对HSP开展遗传学研究，明确致病基因及其致病机制，对HSP患者的遗传咨询和个体化防治具有潜在的临床意义，为HSP早期诊断和有效治疗提供研究方向和新的理论依据，也将在实践上为研发治疗HSP的特效药物提供新的分子靶点。

发明内容

针对上述问题，本发明提供SPAST的错义突变体及其应用，主要为了弥补现有技术中对于SPAST的研究还存在的空白，同时为痉挛性截瘫的治疗提供新的治疗方案。

为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

本发明第一方面

所述目标片段与序列为SEQ ID NO：1的野生型SPAST基因相比，具有c.1225G>C、c.1742G>C突变中至少一种。并不局限于除c.1225G>C或c.1742G>C突变外序列其他位点必须与SEQ ID：NO.1一致。

在前述基础上，所述核酸的类型包括DNA、RNA或cDNA，核酸的类型不做具体的限定，只要其与野生型SPAST基因相比具有指定的突变，则应当认定其为本条范围内的核酸。

本发明第二方面涉及多肽，与序列为SEQ ID NO：2的野生型SPAST编码的多肽相比，所述多肽具有p.A409P、p.R581P突变中至少一种。同样的，并不局限于除p.A409P或p.R581P突变外序列其他位点必须与SEQ ID：NO.2一致。

本发明第三方面

a.核酸，与序列为SEQ ID NO：1的野生型SPAST基因相比，具有c.1225G>C、c.1742G>C、c.1173+1_1173+2dup突变中至少一种；

b.多肽，与序列为SEQ ID NO：2的野生型SPAST编码的多肽相比，具有p.A409P、p.R581P突变中至少一种；

所述生物模型一种形式为细胞模型。该细胞模型的一种应用方式为进行规模化的药物筛选，可以通过药物对细胞模型进行作用，验证该药物是否具有抑制相应突变的作用，并可据此进一步验证该药物是否可以通过抑制突变实现治疗相应的疾病，比如通过该细胞模型即可实现模拟痉挛性截瘫的疾病环境、然后进一步通过该模型实现体外验证部分药物的作用。在本条中，主要考虑的筛选因素是针对相应的突变，暂不具体限定药物的具体治疗对象，该种应用方式主要在药物研发过程中进行使用。其中，所述药物为治疗痉挛性截瘫的药物；痉挛性截瘫主要是由前述突变导致。更具体的，所述药物为治疗痉挛性截瘫4型的药物。由此，通过本生物模型实现了对一些作用效果未知的物质进行筛查，方便进一步研究该物质是否具有用于治疗痉挛性截瘫的预期。

本发明第四方面

所述核酸与野生型SPAST基因相比，具有c.1225G>C、c.1742G>C、

c.1173+1_1173+2dup突变中至少一种；所述多肽与野生型SPAST蛋白相比，具有p.A409P、p.R581P突变中至少一种。针对不同位点的检测试剂进行组合使用，通过对探针引物的合理设计，可以提升筛查效率和准确度，主要的有效探针、引物均可视为包括本文已经公开与相应位点对应的。只要相应的产品应用到了能够检测前述四种SPAST突变体中任一的试剂时，均应当视为应用了本发明的技术。筛查痉挛性截瘫主要是患病风险排查，便于提前干预；诊断则是对于已经患病的人员进行辅助诊断，当然是否已经患病是以患者机体实际变化为准，不以人的主观认知干预。

针对检测核酸和/或多肽的试剂，试剂包括特异性针对所述核酸和所述多肽的至少之一的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一。具体为试剂包括特异性检测核酸的产品，还包括特异性检测多肽的产品，该产品至少可为抗体、探针、引物以及质谱检测试剂中任一，同时还可为其他具有相似功能的试剂。另外，试剂盒的形式可为一些与现有产品类似的试剂盒，设备则可为一些序列检测设备。引物和探针均可选择其中任一，也可根据需要进行组合使用。

更为具体的，所述引物包括序列如下的引物对：

引物对1：正向引物：5'TTCAAGCAATTCTGCCACG3'

反向引物：5'TCTGGTGGCTTGCTGGC3'，

引物对2：正向引物：5'ATTGCCTGGACTCTGTGAACC3'

反向引物：5'CATCGGCTACAGAAACAGCCT3'，

引物对3：正向引物：5'AGCTATGGGCAGCTCTGTTT3'

反向引物：5'AGACTCAAGGACAAGATAAAGTTTC3'；

核酸探针包括序列如下的探针：

探针1：正向探针：5'AATATAAGTGCTCCAAGTTTAACTTC3'

反向探针：5'GAAGTTAAACTTGGAGCACTTATATT3'

探针2：正向探针：5'TGAGAAATATTCCATTATCTGAC3'

反向探针：5'GTCAGATAATGGAATATTTCTCA3'

优选的，当所述痉挛性截瘫为痉挛性截瘫4型。制备所得的相应检测产品不仅可以用于筛查和诊断痉挛性截瘫，同时可以更为精准的筛查易感痉挛性截瘫4型人群，还可对痉挛性截瘫4型患者进行诊断，相应的探针、引物都具有较高的检测精度和准确性，同时前述探针、引物在进行相应检测过程中具有更好的效果。

本发明第五方面

与序列为SEQ ID NO：1的野生型SPAST基因相比，所述SPAST基因突变体具有c.1225G>C、c.1742G>C突变中至少一种，或

与序列为SEQ ID NO：2的野生型SPAST相比，所述SPAST基因突变体具有具有p.A409P、p.R581P突变中至少一种；

在该种情况下，只要相应的产品应用到了能够检测前述四种SPAST突变体中任一的试剂时，均应当视为应用了本发明的技术。

其中，所述试剂为核酸探针或引物。

相应的检测试剂可为引物和探针，所述引物包括序列如下的引物对：

引物对1：正向引物：5'TTCAAGCAATTCTGCCACG3'

反向引物：5'TCTGGTGGCTTGCTGGC3'，

引物对2：正向引物：5'ATTGCCTGGACTCTGTGAACC3'

反向引物：5'CATCGGCTACAGAAACAGCCT3'；

核酸探针包括序列如下的探针：

探针1：正向探针：5'AATATAAGTGCTCCAAGTTTAACTTC3'

反向探针：5'GAAGTTAAACTTGGAGCACTTATATT3'，

探针2：正向探针：5'TGAGAAATATTCCATTATCTGAC3'

反向探针：5'GTCAGATAATGGAATATTTCTCA3'。

优选的，痉挛性截瘫生物样品为痉挛性截瘫4型样品；该种样品的主要来源为疑似患者，比如患者的外周血、皮肤、皮下组织等。相应的探针、引物都具有较高的检测精度和准确性，可以更快速的“无创”检查。

本发明第六方面

本发明第六方面

构建体，包含前述公开的核酸，核酸与序列为SEQ ID NO：1的野生型SPAST基因相比，具有c.1225G>C、c.1742G>C突变中至少一种。构建体同样可以在制药过程中作为药物作用效果的检验模型。

重组细胞，所述重组蛋白是通过前述构建体转化受体细胞获得。

需要说明的是，上述给出的突变位点以及序列等，均是以Burrows Wheeler测序平台内容作为参考，本领域技术人员应该理解的是，由于数据库的更新或者数据库的不同，所示出的突变位点以及序列可能会稍有不同或者变化，这些不同或者变化均可以给出的该数据库中的内容为标准找到，这些不同或者变化也均包含在本发明的保护范围之内。

本发明的有益效果是：

为现有的基因领域提供了新的突变型基因，并进一步研究了该突变基因的应用。确定了本发明涉及的置换型突变与痉挛性截瘫疾病的联系，并据此为痉挛性截瘫的治疗提供新的治疗方案，尤其是为痉挛性截瘫4型提供了诊断治疗的手段。

附图说明

图1为本发明涉及的实施例1的遗传性痉挛性截瘫患者家系图谱示意图；

图2为本发明涉及的实施例1遗传性痉挛性截瘫先证者及其父母SPAST基因c.1225G>C突变位点的Sanger测序验证峰图；

图3为本发明涉及的实施例2的遗传性痉挛性截瘫患者家系图谱示意图；

图4为本发明涉及的实施例2遗传性痉挛性截瘫先证者及其父母SPAST基因c.1742G>C突变位点的Sanger测序验证峰图；

图5为本发明涉及的实施例3的遗传性痉挛性截瘫患者家系图谱示意图；

图6为本发明涉及的实施例3遗传性痉挛性截瘫先证者及其父母SPAST基因c.1173+1_1173+2dup突变位点的Sanger测序验证峰图。

具体实施方式

下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1：

本实施例涉及一种分离的编码SPAST基因突变体的核酸，与SEQ ID NO.1相比，该核酸具有选自c.1225G>C、c.1742G>C、c.1173+1_1173+2dup中的至少一种突变。所述编码SPAST基因突变体的核酸是指与编码SPAST基因突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受限制，可以是任何包含与SPAST基因突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。

所述核酸，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本技术方案中，虽然只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链，只要覆盖任一就应当视为在本发明范围内。例如，提及SEQ ID NO：1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。

该编码SPAST突变体的核酸，是发明人通过全外显子组测序联合突变验证的方法确定的遗传性痉挛性截瘫的致病基因上的突变。虽然有关于遗传性痉挛性截瘫的基因报道，但发明人首次证实了SPAST基因与遗传性痉挛性截瘫有关的的突变位点，在现有技术中并未被提到。野生型的SPAST基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，共含有1851个碱基。野生型SPAST基因编码的蛋白含有616个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

SPAST基因突变体与SEQ ID NO：1相比，具有选自c.1225G>C、c.1742G>C和c.1173+1_1173+2dup中的至少一种突变，即相对野生型SPAST基因，本发明的SPAST基因突变体的cDNA中第1225位发生G到C的改变和/或第1742位发生G到C的改变和/或第1173位内含子发生两个碱基重复，由此所编码的产物与蛋白(SEQ ID NO：2)相比，具有选自p.A409P、p.R581P和第8号外显子跳跃中的至少一种突变。

本实施例还涉及一种筛选易患遗传性痉挛性截瘫的生物样品的方法。该方法包括以下步骤：

S1、从生物样品提取核酸样本(该步骤中的样本也可由检测方直接提供)。

所述生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品SPAST是否存在突变的核酸样本即可；生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种，优选外周血。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易患遗传性痉挛性截瘫的生物样品的效率；需要说明的是，本部分所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中SPAST是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含SPAST编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易患遗传性痉挛性截瘫的生物样品的效率。另外，针对采用RNA作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本进一步包括：从生物样品提取RNA样本，优选RNA样本为mRNA；以及基于所得到的RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选易患遗传性痉挛性截瘫的生物样品的效率。

S2、在得到核酸样本之后，对核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列；确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。

可以通过测序的方法，确定核酸样本的核酸序列。用于进行测序的方法和设备并不受特别限制，可以采用第二代测序技术，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术；利用选自HISEQ2000、SOLID、454、ABI3730和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序；由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因此能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率，从而能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度；由此，确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括：首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；以及所得到的核酸序列文库进行测序，以便获得多个测序数据构成的数据结果；需要说明的是，本部分所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据(reads)作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应SPAST的编码序列即可。

S3、在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸样本的核酸序列与SEQ IDNO：1的序列相比对，如果在所得到的核酸序列中具有选自c.1225G>C、c.1742G>C和c.1173+1_1173+2dup中的至少一种突变，则指示生物样品易患遗传性痉挛性截瘫(同时还可判定该方法也使用了“筛选痉挛性截瘫生物样品的试剂盒”、“检测核酸和/或多肽的试剂在制备试剂盒或设备中应用”)。

由此，通过根据本发明实施例的筛选易患遗传性痉挛性截瘫的生物样品的方法，可以有效地筛选易患遗传性痉挛性截瘫的生物样品；其中，对核酸序列与SEQ ID NO：1进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作。若未特别说明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟悉的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。

实施例2：确定遗传性痉挛性截瘫致病基因及突变位点

1、样本收集：

发明人收集到3个遗传性痉挛性截瘫家系，如图1所示，□表示正常男性，○表示正常女性，●表示患病女性，▇表示患病男性，↗表示先证者。参与本发明研究的共10人(先证者及其父母)，所有参与本发明研究的家系成员均签署了知情同意书。发明人采集获得上述遗传性痉挛性截瘫患者家系中患者及家系内正常人的外周血样本。

2、全基因组测序

发明人用【MGI】DNB-T7 App-AFCLPE150结合MGI-DNB-T7测序平台，对该家系中的先证者患者及父母进行全外显子组测序。目标区域覆盖度>99.8％，平均测序深度>160×,目标区深度大于20×位点所占比例>99.3％。

2.1样品制备

分别取上述家系先证者及其父母的外周血，使用AllPrep DNA/RNA/miRNA通用试剂盒提取外周血DNA。使用Qubit进行定量，保证每个DNA样本至少2μg进行全基因组测序

2.2文库构建及测序

使用E220 Covaris仪器将DNA样本随机打断成150-200bp的片段，随后按照制造商使用说明书，用AMpure XP Beads选择DNA片段大小，然后进行末端修复、磷酸化和a尾反应。将BGISEQ-500平台特异性接头连接到a-尾片段上，纯化连接片段，用PCR扩增。最后，进行循环化，生成单链DNA环。定量鉴定后，对文库进行测序。

3、变异检测、注释及数据库比较

对先证者及其父母进行全基因组测序，测序数据使用Burrows-Wheeler比对工具与SPAST基因组参考匹配，并使用snpEff3和dbSNP数据库进行注释。首先通过dbSNP数据库、ExAC、HapMap数据库、1000genomes、100个中国健康成人本地数据库筛选所有已识别的变异体，并删除健康人群MAF＞0.01的变异体，然后将所有过滤后的变异与OMIM和CGD数据库进行比较，以确定与疾病表型相关的基因变异。

家系1先证者为2岁女性患儿，不能独自站立，下肢肌张力高，膝腱反射亢进，巴氏征阳性，踝阵挛阳性。对先证者进行全外显子组测序分析，结果显示先证者SPAST基因的第9号外显子内存在一个杂合变异c.1225G>C，该变异为错义突变，导致第409位氨基酸由丙氨酸变为脯氨酸(p.A409P)；该变异在正常参考人群基因数据库中未见报道(PM2-PP)；多种统计方法预测该变异为致病性变异(Polyphen-2：有害，SIFT：有害，MutationTaster：有害，revel＝0.853)(PP3)；先证者的临床表型符合常染色体显性痉挛性截瘫4型，且对先证者家系行Sanger测序验证显示，先证者所携带的该变异为新发(PS2)；依据美国ACMG(TheAmerican College ofMedical Genetics and Genomics,美国医学遗传学与基因组学学会)的变异分类指南，该变异为可能致病性变异(ACMG:PS+2PP)。

家系2先证者SPAST基因的第17号外显子内存在一个杂合变异c.1742G>C，该变异为错义突变，导致581位氨基酸由精氨酸变为脯氨酸(p.R581P)。该变异在正常人群基因数据库中未报道(PM2)；该家系中先症者该变异为新发突变，且先证者症状高度符合该基因突变所致综合征4型(PS2)。依据美国ACMG(The American College ofMedical Genetics andGenomics,美国医学遗传学与基因组学学会)变异分类指南，该变异为可能致病性变异(ACMG:PS+PM)。

家系3结果显示先证者及其父亲SPAST基因第8号内含子内存在一个杂合变异c.1173+1_1173+2dup。该变异为剪接位点突变，导致第8号外显子可能在跳跃剪接中丢失(PVS1-Strong)；该变异在正常人群基因数据库中未报道(等位基因频率(％)：gnomeAD:.；1000Genome:.；ExAC:.)(PM2-PP)；先证者及其父亲临床表型与常染色体显性痉挛性截瘫4型相符(PP4)。依据美国ACMG(The American College ofMedical Genetics andGenomics,美国医学遗传学与基因组学学会)的变异分类指南，该变异为可能致病性变异(ACMG:PS+2PP)。

4、Sanger法测序验证

分别对实施例2中所述遗传性痉挛性截患者家系中的患者及其父母(正常人)的SPAST基因进行测序；根据确定序列测定结果属于突变型还是野生型，验证SPAST基因的c.1225G>C、c.1742G>C和c.1173+1_1173+2dup杂合突变与遗传性痉挛性截瘫之间的相关性。具体方法步骤如下：

1)DNA提取

按照实施例1中所述方法，分别提取上述遗传性痉挛性截瘫患者及其父母的外周血基因组DNA，备用。

2)引物设计及PCR反应

参考人类基因组序列数据库GRCh37.1/SPAST，设计得到具有SEQ IDNO:7-8所示的核苷酸序列的针对c.1225G>C、c.1742G>C和

c.1173+1_1173+2dup突变位点的特异性引物，具体见下表。

按照本领域常规方法以所提取的DNA为模板与上述特异性引物进行PCR反应，并将纯化的PCR产物进行测序。

测序将步骤2中获得的患者及其父母的PCR扩增产物进行DNA测序。基于测序结果，对上述各样本进行SPAST基因编码序列比对。结果发现，家系1中先证者携带c.1225G>C杂合突变，而表现正常的先证者父母不携带该突变。家系2中先证者携带c.1742G>C杂合突变，而表现正常的先证者父母不携带该突变。家系3中先证者及家族中受影响的患者携带c.1173+1_1173+2dup杂合突变，而表现正常个体不携带该突变，即序列与表型在家系内表现为共分离。进一步我们以正常体检者为对照，按照上述方法提取外周血DNA并进行PCR扩增，PCR扩增产物DNA测序结果发现正常体检者均无上述两种突变位点。因此，初步判断该突变是遗传性痉挛性截瘫的致病位点。

实施例3：检测试剂盒

制备一检测试剂盒，其包含适于SPAST基因突变体的引物(与SEQ ID NO.1相比，所述SPAST基因突变体具有c.1225G>C、c.1742G>C和c.1173+1_1173+2dup中的一种)，用于筛选易感遗传性痉挛性截瘫的生物样品，其中这些引物包括SEQ ID NO.7-10所示的SPAST基因特异性引物。

利用上述试剂盒筛选易感遗传性痉挛性截瘫的生物样品的具体步骤为：按照实施例2中步骤1所述方法提取待测者DNA，以所提取的DNA为模板与上述特异性引物进行PCR反应，并按照本领域常规方法对PCR产物进行纯化，将纯化的产物进行测序，然后通过观察测序所得到的的序列是否具有c.1225G>C、c.1742G>C和c.1173+1_1173+2dup中的一种突变，从而有效地检测待测者是否易患遗传性痉挛性截瘫。

本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。