氟碳纳米液滴的微流体制备

技术领域

本发明一般地涉及由生物相容的氟化表面活性剂稳定的经校准的(全)氟碳纳米液滴及其通过微流体技术的制备方法。本发明进一步涉及这样的经校准的(全)氟碳纳米液滴用于体外或体内诊断和/或用于治疗的用途。

发明背景

相变造影剂(PCCA)或声学活化的纳米液滴在超声诊断和治疗剂递送中越来越受欢迎。除了通常由液体全氟碳组成的核心外，纳米液滴显示出与市售充气微泡相似的组成。由于声学液滴汽化(ADV)过程，封装的液滴在暴露于超过汽化阈值的超声能量后转化为气泡。实际上，超声充当远程触发器以可控的、非侵入性的和局部化的方式促进液滴的汽化。由于它们与常规微泡相比更小的尺寸，纳米液滴显示出延长的体内循环并通过血管外空间深入渗透到组织中。此外，在汽化阈值以下，它们具有低声学衰减的超声稳定性，并且可以在感兴趣的位置声学汽化。

全氟碳纳米液滴(“PFC-ND”)作为血管外超声造影剂在许多诊断和治疗应用中具有真正的潜力，所述应用包括声致透化、血脑屏障(BBB)破坏、多模态成像模式，并允许被动(由于在肿瘤组织中增强的渗透性和滞留(EPR)效应)或主动靶向(通过掺入靶向配体)以局部递送治疗药物或基因。PFC-ND的另一个潜在有价值的特性是它们可以应用于新的成像策略诸如超声超分辨率成像，因为这些试剂可以通过应用间歇性声脉冲按需活化和失活。

纳米液滴的一个主要限制是它们随着时间的推移相对有限的物理化学稳定性，这可能影响它们在诊断和治疗应用中的使用。

在选择合适的乳化剂时，已经确定了克服这个问题的可能策略。

大多数为成像目的而制备的全氟碳液滴使用脂质、表面活性剂、蛋白或二嵌段聚合物作为乳化剂制备成乳液(Astafyeva等人,2015)。

最近，Astafyeva等人在2015年已经报道了由生物相容的氟化表面活性剂(称为“FTAC”)稳定的全氟碳纳米液滴，他们研究了全氟碳乳液作为治疗诊断剂。在这项工作中，将超声波均质器用于制备全氟碳纳米液滴乳液。

在过去的几年中，已经另外提出了一类称为“DendriTAC”的新型生物相容的支链表面活性剂。

WO2016185425教导了DendriTAC的合成和作为稳定剂在全氟碳纳米乳液的制备中的用途。提出了用于乳液制备的标准制备方法，诸如涡旋、超声波仪和微流态化仪(高压均质器)。

纳米液滴的尺寸和尺寸分布都是决定汽化阈值的重要因素，汽化阈值对应于将液体核心液滴转化为气泡所需的超声压力值。在以不同尺寸的颗粒为特征的多分散悬浮液中，具有较大尺寸的纳米液滴(其需要比较小纳米液滴更少的能量即可汽化)影响纳米液滴悬浮液的汽化。

相反，在含有相对均匀尺寸的颗粒的单分散系统的情况下，其对超声暴露具有相似且均匀的声学响应，可以施加最低的声压即可实现最高的汽化效率。

常规制备程序通常用于纳米液滴的配制和制备，包括声处理、挤出、均质化和微泡冷凝(Sheeran等人.2017)。

最近，微流体(MF)技术(也被称作“芯片上的实验室”)已经发展成用于一致地制备各种尺寸受控的纳米药物的强大且可扩展的替代方法。

Melich等人在2020年报道了快速且受控的微流体混合用于制备PFC-ND的用途。到目前为止，根据申请人的知识，尚未通过微流体技术制备这种由生物相容的氟化表面活性剂稳定的全氟碳乳液。

申请人现在已经开发出一种新的组合物，该组合物包含通过微流体技术获得的由生物相容的氟化表面活性剂稳定的经校准的(全)氟碳纳米液滴。

通常，在现有技术中，术语“经校准的”也表示“尺寸受控的”、“均匀尺寸的液滴”、“单分散(的)”或“单尺寸(的)”。

此外，申请人观察到氟化表面活性剂分子(ND壳)和(全)氟碳分子(ND核)之间的摩尔比可以影响经校准的(全)氟碳纳米液滴的性能，特别是根据微流体技术制备的那些的性能。

事实上，发明人已经惊奇地发现，与常规制品中使用的通常较低的摩尔比相比，当在所述生物相容的氟化表面活性剂和所述(全)氟碳之间使用更高的摩尔比时，可以获得改善的ND的稳定性性能。

发明概述

本发明的一个方面涉及一种包含外层和内核的纳米液滴，所述外层包含生物相容的氟化表面活性剂且所述内核包含氟碳，其特征在于，所述生物相容的氟化表面活性剂与所述氟碳之间的摩尔比高于0.06，其中所述生物相容的氟化表面活性剂选自：

(A)第n代两亲树枝状聚合物(Dendri-TAC)，其包含：

-2或3价的疏水中心核；

-连接至所述中心核的每个相应开放末端并在所述核周围分支的生成链

-在每个生成链的末端处的亲水末端基团；

其中

n是0-12的整数并表示所述亲水末端基团，该基团包含：

-单糖、寡糖或多糖残基，

-环糊精残基，

-肽残基，

-三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，或

-2-氨基-2-甲基丙烷-1,3-二醇；

所述疏水中心核是式(Ia)或(Ib)的基团：

其中：

W是R

R

R

p是0、1、2、3或4；

q是0、1、2、3或4；

L是直链或支链C

Z是C(＝O)NH或NHC(＝O)，

R是C

e在每次出现时独立地选自0、1、2、3或4，

(B)式II的两亲线性低聚物(F-TAC)

其中：

-n是重复Tris单元的数目(n＝DPn是平均聚合度)，其中术语Tris表示三(羟甲基)氨基甲烷单元，且

-i是氟代烷基链中碳原子的数目，

或其混合物。

在一个实施方案中，所述氟碳是全氟碳。

另一个方面涉及一种水性悬浮液，其包含所述纳米液滴。

一个优选实施方案涉及一种水性悬浮液，其包含多个如上定义的纳米液滴，其中所述纳米液滴具有低于0.25、优选地低于0.20、更优选地低于0.15、甚至更优选地低于0.10的多分散性指数(PDI)以及在100nm至1000nm之间、优选地在120至600nm之间、更优选地在150至400nm之间的Z-平均直径。

再另一个方面涉及一种用于制备如上定义的水性悬浮液的方法，所述方法包括以下步骤：

a)制备水相；

b)制备有机相，

其中

i)所述水相包含选自Dendri-TAC、F-TAC或其混合物的生物相容的氟化表面活性剂且所述有机相包含氟碳，或

ii)所述有机相包含选自Dendri-TAC、F-TAC或其混合物的生物相容的氟化表面活性剂和氟碳；

c)将所述水相注入微流体筒的第一入口并将所述有机相注入微流体筒的第二入口，由此在微流体设备的混合装置中混合所述水相和所述有机相以得到经校准的氟碳纳米液滴的水性悬浮液，和

d)从微流体设备的出口通道收集所述经校准的氟碳纳米液滴的水性悬浮液。

根据一个优选的实施方案，所述水相包含选自Dendri-TAC、F-TAC或其混合物的生物相容的氟化表面活性剂且所述有机相包含氟碳。

任选地在步骤d)以后，将收集的水性悬浮液稀释。

本发明的另一个方面涉及一种用于制备经校准的氟碳纳米液滴的水性悬浮液的方法，所述方法包括以下步骤：

a)制备包含生物相容的氟化表面活性剂的水相；

b)制备包含氟碳的有机相；

c)将所述水相注入微流体筒的第一入口并将所述有机相注入微流体筒的第二入口，由此在微流体筒的混合装置中混合所述水相和所述有机相以得到经校准的氟碳纳米液滴的水性悬浮液，和

d)从微流体筒的出口通道收集所述经校准的氟碳纳米液滴的水性悬浮液。

再另一个方面涉及用于诊断性和/或治疗性处理中的根据本发明的水性悬浮液。

附图说明

图1是微流体筒的核心部分的示意图。

图2显示了交错人字形混合器(SHM)设计的横截面的示意图。

发明详述

本发明涉及一种新的组合物，其包含由生物相容的氟化表面活性剂稳定的经校准的(全)氟碳纳米液滴，优选地通过微流体技术得到。所述经校准的纳米液滴适合作为在超声成像技术(称为对比增强超声(CEUS)成像)中或在治疗应用(例如热消融或超声介导的药物递送)中的造影剂。

本发明的一个方面涉及一种包含外层和内核的纳米液滴，所述外层包含生物相容的氟化表面活性剂且所述内核包含氟碳，其特征在于，所述生物相容的氟化表面活性剂与所述氟碳之间的摩尔比高于0.06。

生物相容的氟化表面活性剂

在本说明书和权利要求书中，术语“生物相容的”表示由于没有毒性、伤害性或生理反应性并且通常不会引起免疫排斥而与活组织或活系统具有显著相容性的化合物和/或组合物。

在本说明书和权利要求书中，表述“表面活性剂”具有其在化学领域中的常规含义，并表示适合于形成纳米液滴的稳定层的化合物。

表述“氟化表面活性剂”表示适合形成纳米液滴的稳定层的两亲有机化合物，其包含亲水部分和疏水部分，所述疏水部分包含氟原子(即氟碳部分)。

本发明的纳米液滴优选地分散在水性溶剂中并被由生物相容的氟化表面活性剂组成的层稳定，所述表面活性剂有利地表现出对内核和周围水的高亲和力。

在本说明书和权利要求书中，术语Dendri-TAC表示第n代两亲树枝状聚合物，其包含：

-2或3价的疏水中心核；

-连接至所述中心核的每个相应开放末端并在所述核周围分支的生成链

-在每个生成链的末端处的亲水末端基团；

其中

n是0-12的整数并表示所述亲水末端基团，该基团包含：

-单糖、寡糖或多糖残基，

-环糊精残基，

-肽残基，

-三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，或

-2-氨基-2-甲基丙烷-1,3-二醇；

所述疏水中心核是式(Ia)或(Ib)的基团：

其中：

W是R

R

R

p是0、1、2、3或4；

q是0、1、2、3或4；

L是直链或支链C

Z是C(＝O)NH或NHC(＝O)，

R是C

e在每次出现时独立地选自0、1、2、3或4。

在一个实施方案中，R

本文中使用的“中心核的化合价m”表示连接至中心核的生成链的数目，如在下述方案1中所解释的：

如本文中使用的，第n＝0代树枝状聚合物是指，m个生成链通过第一分支点(G

根据优选的实施方案，n是0、1或2，更优选地n是0。

根据本发明的两亲树枝状聚合物的每个生成链以亲水末端基团结束。

在这方面，所述单糖、寡糖或多糖残基可以特别地是葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、核糖、麦芽糖、乳糖、透明质酸。

所述环糊精残基可以选自α、β或γ-环糊精。

所述肽残基可以选自含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的直链或环肽。

在另一个实施方案中，包括树枝状聚合物，其中所述生成链经由以下基团连接至所述中心核：

经由基团(a)：

或经由基团(b)：

其中

Z是C(＝O)NH或NHC(＝O)，并连接至所述中心核，

R是C

e在每次出现时独立地选自0、1、2、3或4。

在另一个实施方案中，包括树枝状聚合物，其中所述中心核是式(Ia)或(Ib)的基团：

其中：

W是R

R

R

p是0、1、2、3或4；

q是0、1、2、3或4；

L是直链或支链C

在再另一个实施方案中，包括树枝状聚合物，其中WL是选自以下的基团：

在又另一个实施方案中，包括树枝状聚合物，其中每个生成链(n)经由如上定义的基团(a)或基团(b)分支n次。

在另一个实施方案中，包括树枝状聚合物，其中所述末端基团包含下述亲水部分：

在一个特定实施方案中，包括树枝状聚合物，其具有下式：

其中：

W是R

R

p是0、1、2、3或4；

q是0、1、2、3或4；

Z是(CO)NH或NH(CO)；

R

前提条件是：

R

或：

R

X是X

X

Y

X

Y

V是：

R

R

R

R

i是0或1；

j是0或1；

e是0、1、2、3或4；

k是1-12、优选1-5的整数；

r是1-10的整数；

u是0、1、2、3或4；

v是1、2或3；

w是1-20、优选1-10的整数；

x、y各自独立地是1-6的整数。

在一个特定实施方案中，包括树枝状聚合物，其具有下式：

其中：

W是R

R

p是0、1、2、3或4；

q是0、1、2、3或4；

Z是(CO)NH或NH(CO)；

R

前提条件是：

R

或：

R

X是X

X

Y

X

Y

V是：

R

R

R

R

i是0或1；

j是0或1；

e是0、1、2、3或4；

k是1-12、优选1-5的整数；

r是1-10的整数；

u是0、1、2、3或4；

v是1、2或3；

w是1-20、优选1-10的整数；

x、y各自独立地是1-6的整数。

在另一个特定实施方案中，R

在一个特定实施方案中，上面定义的表面活性剂的亲水末端基团具有下式：

其中R

在一个特定实施方案中，上面定义的表面活性剂的亲水末端基团具有下式：

其中v和w如上面所定义，v特别地等于3。

两亲树枝状聚合物(Dendri-TAC)的合适实例及其制备描述于WO2016185425，并包括具有下式的F

/>

/>

/>

/>

在本发明的一个优选实施方案中，所述两亲树枝状聚合物Dendri-TAC选自特定集合，该集合包含以下式IA的化合物

和式IB的化合物

其中所述式IA的化合物是F

在一个优选的实施方案中，所述两亲树枝状聚合物Dendri-TAC是DiF

F-TAC包含亲水部分和疏水部分，所述亲水部分包含聚TRIS型的寡聚体，所述疏水部分包含线性氟化烷基链。

在本说明书和权利要求书中，术语F-TAC表示具有式II的线性氟化表面活性剂：

其中：

-n是重复Tris单元的数目(n＝DPn是平均聚合度)，其中术语Tris表示三(羟甲基)氨基甲烷单元，且

-i是氟代烷基链中碳原子的数目。

在本说明书和权利要求书中，所述式II的化合物可以可互换地表示为F

-n是重复Tris单元的数目(n＝DPn是平均聚合度)，且

-i是氟代烷基链中碳原子的数目。

根据一个实施方案，i在4至12之间，优选地在6至10之间。

根据另一个实施方案，当i在6至10之间时，n在1至40之间，优选地在4至30之间。

根据再另一个实施方案，当i是8时，n在1至40之间，例如在4至30之间。

两亲线性低聚物F-TAC的合适实例已经公开在例如Astafyeva,2015，并包括具有下式的F

/>

在本发明的一个实施方案中，所述两亲线性低聚物(F-TAC)选自特定集合，该集合包含以下式IIA的化合物

和式IIB的化合物

其中所述式IIA的化合物是F

申请人现在已经发现，本发明的生物相容的氟化表面活性剂的物理化学性质可以影响所公开的(P)FC-ND的尺寸。

表1显示了优选的生物相容的氟化表面活性剂的选定物理化学性质。具体地，已经报道了表面张力、临界胶束浓度和分子量的值。

表1.生物相容的氟化表面活性剂的物理化学性质

ST：在25℃的表面张力；CMC：临界胶束浓度；MW：分子量

例如，一般地已经观察到，与生物相容的氟化表面活性剂相关的表面张力值越低，ND尺寸越小。

在本说明书和权利要求书中，表述“表面张力”具有其在化学领域中的普通含义并且表示液体表面收缩到可能的最小表面积的趋势。表面活性剂，诸如公开的生物相容的氟化表面活性剂，是降低两种液体之间、气体与液体之间或液体与固体之间的表面张力的化合物。

例如，使用Wilhelmy板技术，例如在空气/水界面，在(25.0±0.5)℃用K100张力计(Kruss，汉堡，德国)，可以测量表面张力。

根据一个实施方案，优选的生物相容的氟化表面活性剂的特征在于低于70mN/m、更优选地低于50mN/m的表面张力值。

(全)氟碳

在本说明书和权利要求书中，术语“氟碳”表示通过用氟原子部分或完全取代氢原子而从烃衍生出的一组含氟化合物，其在室温为液体。优选地，所述氟碳是全氟碳(PFC)，即其中所有氢原子都被氟原子取代的氟化烃。

液体(全)氟碳的特征在于在25℃至160℃之间的沸点。在本发明中，所述(全)氟碳优选地特征在于在25℃至100℃之间、更优选地在27℃至60℃之间的沸点。

氟碳的合适实例是1-氟丁烷、2-氟丁烷、2,2-二氟丁烷、2,2,3,3-四氟丁烷、1,1,1,3,3-五氟丁烷、1,1,1,4,4,4-六氟丁烷、1,1,1,2,4,4,4-七氟丁烷、1,1,2,2,3,3,4,4-八氟丁烷、1,1,1,2,2-五氟戊烷、1,1,1,2,2,3,3,4-八氟戊烷、1,1,1,2,2,3,4,5,5,5-十氟戊烷、1,1,2,2,3,3,4,4,5,5,6,6-十二氟己烷。

全氟碳的合适实例是全氟戊烷、全氟己烷、全氟庚烷、全氟辛烷、全氟壬烷、全氟十氢化萘、全氟辛基溴(PFOB)、全氟-15-冠-5-醚(PFCE)、全氟二氯辛烷(PFDCO)、全氟三丁基胺(PFTBA)、全氟壬烷(PFN)和1,1,1-三(全氟叔丁氧基甲基)乙烷(TPFBME)或其混合物。

在一个实施方案中，所述全氟碳优选地是全氟戊烷(PFP)(沸点29℃)、全氟己烷(PFH)(沸点57℃)或全氟辛基溴(PFOB)(沸点142℃)。

BFS/(全)氟碳摩尔比

在本说明书和权利要求书中，表述“摩尔比”(Nr)表示生物相容的氟化表面活性剂与用于稳定所公开的纳米液滴的内核的(全)氟碳((P)FC)的比率。可能使用以下公式计算摩尔比：

其中：

-表述“生物相容的氟化表面活性剂的总摩尔数”表示在纳米液滴悬浮液中的生物相容的氟化表面活性剂的摩尔量，且

-表述“(P)FC的总摩尔数”表示形成ND的内核的(全)氟碳的摩尔量。

一般而言，在ND悬浮液中的生物相容的氟化表面活性剂的摩尔量表示形成纳米液滴的外层的生物相容的氟化表面活性剂的摩尔量，或没有结合至稳定层的生物相容的氟化表面活性剂的摩尔量(例如在水性悬浮液中以游离或胶束形式)，或二者。

在一个实施方案中，进入水相中的生物相容的氟化表面活性剂的摩尔量的范围是在0.0006至0.006mmol之间，优选地在0.002至0.004mmol之间。

在一个实施方案中，进入有机相中的(P)FC的摩尔量的范围是在0.01至0.04mmol之间，优选地在0.014至0.028mmol之间。

本发明的一个方面涉及一种包含外层和内核的纳米液滴，其中所述外层包含生物相容的氟化表面活性剂且所述内核包含氟碳，其中所述生物相容的氟化表面活性剂与所述氟碳之间的摩尔比高于0.06。

在一个实施方案中，所述生物相容的氟化表面活性剂与所述氟碳之间的摩尔比高于0.060，优选地高于0.068，优选地高于0.070，优选地高于0.080，优选地高于0.090，优选地高于0.100，优选地高于0.140且更优选地高于0.190。

在另一个方面，申请人已经观察到，所述生物相容的氟化表面活性剂与所述氟碳之间的摩尔比应当优选地不高于0.300，更优选地不高于0.250。

经校准的(全)氟碳纳米液滴

另一个方面涉及一种水性悬浮液，其包含如上定义的纳米液滴。

一个优选实施方案涉及一种水性悬浮液，其包含多个如上定义的纳米液滴，其中所述纳米液滴具有在100nm至1000nm之间的z-平均直径和低于0.25的多分散性。

在本说明书和权利要求书中，术语“多个纳米液滴”表示特征在于经校准的分布的纳米液滴群体，这意味着，基本上所有的纳米液滴具有基本上类似的尺寸。

表述“经校准的分布”表示特定纳米液滴群体(例如具有在100至1000nm之间的z-平均直径)的多分散性(PDI)，其具有低于0.25、优选地低于0.2、更优选地低于0.15、甚至更优选地低于0.1的多分散性指数(PDI)。

术语“多分散性”(PDI)表示从累积量分析计算的尺寸分布宽度的无量纲量度，其中所述累积量分析(在动态光散射国际标准ISO13321(1996)和ISO22412(2008)中定义)给出了平均粒径(z-平均值)和分布宽度的估计值(多分散性指数)。

例如，高于0.7的多分散性表示非常宽的颗粒尺寸分布，而低于0.08的值表示以单峰分布为特征的近乎单分散的样品。使用例如Malvern Zetasizer Nano-ZS仪器(MalvernInstruments Ltd.，英国)，用动态光散射技术(DLS)可以测量多分散性。

“z-平均直径(ZD)”被定义为从累积量分析得出的强度加权平均直径。换句话说，它涉及通过动态光散射技术(DLS)测量的分散在水性悬浮液中的经校准的纳米液滴尺寸的平均值。

在本发明中，所述z-平均直径在100nm至1000nm之间，优选地在120至600nm之间，更优选地在150至400nm之间。

用于本发明的水性悬浮液的合适水性载体(其优选地是生理上可接受的)包含水(优选无菌水)、水溶液诸如盐水(其可以有利地被平衡以使得用于注射的最终产品不是低渗的)、或一种或多种张力调节物质的溶液。张力调节物质包含盐类或糖类、糖醇类、二醇类或其它非离子多元醇物质(例如葡萄糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇、甘油、聚乙二醇、丙二醇等)、壳聚糖衍生物诸如羧甲基壳聚糖、三甲基壳聚糖、或凝胶化化合物诸如羧甲基纤维素、羟乙基淀粉或葡聚糖。

在本发明中，优选地使用微流体技术制备经校准的(全)氟碳纳米液滴。

稳定性

申请人现在已经惊奇地发现，通过调节生物相容的氟化表面活性剂与氟碳之间的摩尔比，可以显著提高所公开的经校准的(全)氟碳纳米液滴的稳定性。

在本说明书和权利要求书中，术语“稳定性”表示纳米液滴组合物随时间基本上保持其初始ND尺寸并且优选地还保持其初始单分散分布的性质。

初始ND尺寸和初始单分散分布表示在制备过程结束时经校准的ND组合物的ND尺寸和单分散性的值。

为了清楚起见，制备过程结束表示i)从微流体筒的出口通道收集经校准的ND，或ii)收集所述经校准的ND，然后进行稀释步骤(即步骤e)。

这两个供选择的最终阶段都在经校准的ND的任何储存阶段之前进行。

表述“储存阶段”表示一段时间，例如表示为小时、天或周，在此期间，将微流体制备的经校准的ND的水性悬浮液在制备过程结束以后保持在特定温度条件下。

根据下述等式(等式2)，通过使用ND尺寸演变(Evol％)参数可以计算经校准的(全)氟碳纳米液滴的稳定性：

其中：

-D最终是在制备过程结束后在特定时间以后(例如在制备过程结束后60分钟以后)或在不同条件(不同温度、压力等)下储存一段时间(例如1周)以后，经校准的ND的z-平均直径；且

-D初始是在其制备过程结束时立即(例如，在几分钟内)经校准的ND的z-平均直径。

在本发明中，接近0的Evol％值(正或负)表示经校准的ND悬浮液的更高稳定性，由此悬浮液中的纳米液滴随时间推移基本上保持其初始平均尺寸。

根据本发明，经校准的ND悬浮液的Evol％优选地低于±50％，更优选地低于±30％，且更优选地低于±20％。

申请人已经出乎意料地发现，增加BFS和(全)氟碳之间的摩尔比可以降低Evol％，并从而增加所公开的由BFS稳定的经校准的(全)氟碳ND的稳定性。

申请人发现，Evol％参数与BFS和氟碳之间的摩尔比具有显著相关性。具体地，该效果随着摩尔比值的升高而更明显，所述摩尔比值优选地高于0.08，更优选地高于0.1且更优选地高于0.14。

此外，已经观察到，增加的BFS和氟碳之间的摩尔比也对随时间推移保持PDI值具有显著的积极影响。

微流体筒

优选地使用微流体技术通过自下而上的方法制备本发明的ND。

在本说明书和权利要求书中，表述“微流体技术”表示通过被设计成在微尺度上操纵通道中的流体的微流体筒来制备纳米液滴的技术。

所述微流体技术是一种自下而上的方法，也就是说通过将分子(例如BFS和(全)氟碳)组装为更大的纳米结构(即纳米液滴)而得到纳米液滴。

图1显示了可用于本发明方法中的微流体筒(即，微流体筒)的核心部分100的示意图。该筒包含用于供给水相101’的第一入口101和用于供应有机相102’的第二入口102。所述水相和所述有机相被引向混合装置103，例如图2所示的交错人字形微混合器203，在其中它们被混合(例如，在图2的微混合器的情况下，通过层流混合，实现ND的形成)。

经校准的氟碳ND然后被引导至出口通道104，它们从那里被收集在合适的容器(例如小瓶)中。

可替换地，所述微流体筒可以配备另外的通道，例如放置在混合装置103和出口通道104之间，目的是在经校准的氟碳ND悬浮液被引导至出口通道104之前用合适的溶剂稀释它们(即在线稀释)。

混合装置103通常特征在于能够增强微流体混合性能的合适几何形状。实际上，混合过程发生在混合装置的特殊微通道几何形状中，这导致流体流在离开微流体筒的途中混合在一起。

可得到具有不同的形状或微结构的不同类型的混合装置。混合装置的合适实例可以分类为被动微混合器，例如T形和Y形混合器(例如交错人字形微混合器或环形混合器)，和使用流动聚焦的混合器；和主动微混合器，诸如压力场扰动混合器、电动主动微混合器和超声主动微混合器。

在本发明中优选的是交错人字形微混合器(图2)，其中所述两个液相的混合通过层压混合或环形微混合器来控制。

在混合阶段中，形成(全)氟碳纳米液滴并被引导至微流体筒的出口通道，或者可替换地，引导至另外的通道以在纳米液滴被引导至出口通道之前稀释它们。

在本说明书和权利要求书中，表述“出口(exit)(或出口(outlet))通道”表示微流体筒的末端部分，刚刚形成的纳米液滴从混合装置被引向该部分并且从该部分可以将形成的纳米液滴的悬浮液收集在合适的容器(例如小瓶)中。

微流体筒的一个实例是市售的NxGen筒，其具有或没有在线稀释，来自PrecisionNanosystems(加拿大温哥华)。这些微流体筒可以包含交错人字形或环形微混合器，两者都在非湍流条件下运行。关于制备过程，将微流体筒安装在微流体仪器上，所述仪器通常配备有筒适配器(以承载微流体筒)和容器(例如用于连续流注入的注射器或小瓶)，所述容器直接连接到微流体筒的入口并且专门设计成将液相泵入所述入口。微流体仪器的实例是

本发明的一个方面涉及一种用于制备经校准的氟碳纳米液滴的水性悬浮液的方法，所述方法包括以下步骤：

c)制备水相；

d)制备有机相，

其中i)所述水相包含选自Dendri-TAC、F-TAC或其混合物的生物相容的氟化表面活性剂且所述有机相包含氟碳，或

ii)所述有机相包含选自Dendri-TAC、F-TAC或其混合物的生物相容的氟化表面活性剂和氟碳。

c)将所述水相注入微流体筒的第一入口并将所述有机相注入微流体筒的第二入口，由此在微流体筒的混合装置中混合所述水相和所述有机相以得到经校准的氟碳纳米液滴的水性悬浮液，和

d)从微流体筒的出口通道收集所述经校准的氟碳纳米液滴的水性悬浮液。

根据一个优选的实施方案，所述水相包含选自Dendri-TAC、F-TAC或其混合物的生物相容的氟化表面活性剂且所述有机相包含氟碳。

优选地，所述氟碳是全氟碳。

通常，在步骤c)，水相的注入和有机相的注入同时进行。

表述“同时”表示将水相和有机相同时注入(即共注入)微流体筒中，也就是说，同时或基本上同时(例如在几秒钟内)将水相和有机相注入微流体筒的两个单独入口中。

根据公开的方法，通过使液相单次经过双通道微流体系统，可以得到经校准的(全)氟碳纳米液滴的水性悬浮液。

在一个实施方案中，所述用于制备经校准的(全)氟碳纳米液滴的水性悬浮液的方法是微流体技术，其中所述经校准的(全)氟碳纳米液滴(Z-平均直径在100至1000nm之间)具有低于0.25、优选地低于0.20、更优选地低于0.15、甚至更优选地低于0.1的多分散性指数(PDI)。

有利地，当将表面活性剂溶解在水相中时，本发明的新方法可以用于制备由除Dendri-TAC和FTAC之外的任何其它生物相容的表面活性剂、特别是生物相容的氟化表面活性剂稳定的经校准的纳米液滴的水性悬浮液。

如上所述，表述“生物相容的氟化表面活性剂”表示适合用于形成纳米液滴的稳定层的两亲有机化合物，其包含亲水部分和疏水部分。所述两亲有机化合物由于没有毒性、伤害性或生理反应性并且通常不会引起免疫排斥而与活组织或活系统具有显著相容性。

因此，本发明的另一个方面涉及一种用于制备经校准的纳米液滴的水性悬浮液的方法，所述方法包括以下步骤：

a)制备包含生物相容的表面活性剂的水相；

b)制备包含氟碳的有机相；

c)将所述水相注入微流体筒的第一入口并将所述有机相注入微流体筒的第二入口，由此在微流体筒的混合装置中混合所述水相和所述有机相以得到经校准的纳米液滴的水性悬浮液，和

d)从微流体筒的出口通道收集所述经校准的纳米液滴的水性悬浮液。

优选地，所述生物相容的表面活性剂是生物相容的氟化表面活性剂。

优选地，所述氟碳是全氟碳。

水相

表述“水相”表示包含水性液体组分的液体，包括例如水、水性缓冲溶液、水性等渗溶液或其混合物。优选地，所述水相是水。

根据一个优选的实施方案，所述水相包含生物相容的氟化表面活性剂，其选自如上所述的两亲线性低聚物F-TAC和两亲树枝状聚合物Dendri-TAC或其混合物。

例如，通过传统技术(例如搅拌)可以将生物相容的氟化表面活性剂与水性组分混合，以制备要注入微流体筒的第一入口的水相。

在步骤a)，所述水相包含生物相容的氟化表面活性剂，其浓度范围在0.0006mmol/mL至0.006mmol/mL之间，更优选地在0.0001mmol/mL至0.015mmol/mL之间，更优选地在0.001mmol/mL至0.01mmol/mL之间。

有机相

表述“有机相”表示包含可与水混溶的有机溶剂(包括甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈和丙酮)的液体。优选地，所述有机相是乙醇。

根据一个优选的实施方案，所述有机相包含氟碳或不同氟碳的混合物。优选地，所述氟碳是全氟碳。

(全)氟碳的合适实例是上面提到的那些。

例如，通过传统技术(例如搅拌)可以将氟碳与有机溶剂混合，以制备要注入微流体筒的第二入口的有机相。

在另一个实施方案中，在步骤b)，所述有机相包含(全)氟碳，其浓度范围在0.003mmol/mL至0.142mmol/mL之间，更优选地在0.011mmol/mL至0.085mmol/mL之间，更优选地在0.013mmol/mL至0.057mmol/mL之间。

在一个替代实施方案中，所述有机相包含如上定义的生物相容的氟化表面活性剂和氟碳。

例如，所述有机相包含：

i)生物相容的氟化表面活性剂，其浓度范围在0.0006mmol/mL至0.006mmol/mL之间，更优选地在0.0001mmol/mL至0.015mmol/mL之间，更优选地在0.001mmol/mL至0.01mmol/mL之间；和

ii)(全)氟碳，其浓度范围在0.003mmol/mL至0.142mmol/mL之间，更优选地在0.011mmol/mL至0.085mmol/mL之间，更优选地在0.013mmol/mL至0.057mmol/mL之间。

在本发明的再另一个实施方案中，优选地将水相和有机相在低于室温的温度(例如约4℃至20℃)注入微流体筒，以避免具有接近室温的沸点的氟碳的汽化。

另一个方面涉及一种水性悬浮液，其包含多个通过以下制备方法可得到的经校准的氟碳纳米液滴，所述制备方法包括以下步骤：

a)制备水相；

b)制备有机相，

其中i)所述水相包含选自Dendri-TAC、F-TAC或其混合物的生物相容的氟化表面活性剂，且所述有机相包含氟碳，或

ii)所述有机相包含选自Dendri-TAC、F-TAC或其混合物的生物相容的氟化表面活性剂和氟碳。

c)将所述水相注入微流体筒的第一入口并将所述有机相注入微流体筒的第二入口，由此在微流体筒的混合装置中混合所述水相和所述有机相以得到经校准的氟碳纳米液滴的水性悬浮液，和

d)从微流体筒的出口通道收集所述经校准的氟碳纳米液滴的水性悬浮液。

在一个优选的实施方案中，所述水相包含选自Dendri-TAC、F-TAC或其混合物的生物相容的氟化表面活性剂，且所述有机相包含氟碳，优选为全氟碳。

在另一个实施方案中，所述经校准的(全)氟碳纳米液滴具有在100至1000nm之间的Z-平均直径和低于0.25、优选地低于0.20、更优选地低于0.15、甚至更优选地低于0.1的多分散性指数(PDI)。

总流量(Total Flow Rate，TFR)和流量比(FlowRateRatio，FRR)

本发明的方法允许通过改变两个工艺参数来控制(全)氟碳纳米液滴性能：总流量和流量比。

表述“

根据一个实施方案，TFR优选地在2mL/min至18mL/min之间，更优选地在5mL/min至16mL/min之间，更优选地，所述TFR是10mL/min。

表述“

水相和有机相的体积可以表示为例如mL。

在一个优选的实施方案中，所述FRR(水相体积/有机相体积)在1:1至5:1之间，优选地在1:1至3:1之间，更优选地，所述FRR是1:1。

在本发明中，可以有目的地调节生物相容的氟化表面活性剂和氟碳二者各自的浓度以及FRR以获得高于0.060、优选地高于0.068、优选地高于0.070、优选地高于0.080、优选地高于0.090、优选地高于0.100、优选地高于0.140且更优选地高于0.190的所述生物相容的氟化表面活性剂与所述氟碳之间的摩尔比。

所述生物相容的氟化表面活性剂与所述氟碳之间的摩尔比应当优选地不高于0.300，更优选地不高于0.250。

任选的步骤e)稀释

根据本发明，所述制备方法进一步包含任选的步骤e)，其包含稀释收集的经校准的氟碳纳米液滴的水性悬浮液。

申请人已经出乎意料地观察到，在使用微流体筒的ND制备之后的稀释步骤对初始ND尺寸和初始单分散性具有有利影响。实际上，在没有稀释的情况下，ND尺寸比有稀释的情况更大。

如上面指出的，表述“初始单分散分布”和“初始ND尺寸”表示经校准的ND组合物在其制备过程结束时的单分散性和ND尺寸的值，其中所述制备过程结束表示：i)从微流体筒的出口通道收集经校准的ND，或ii)收集所述经校准的ND，然后进行稀释步骤(即步骤e)。

在本说明书和权利要求书中，术语“稀释”表示通过添加合适量的水性液体(包括水或水溶液)来降低悬浮液中经校准的纳米液滴的浓度的过程。

水性液体的合适量对应于将水性悬浮液中经校准的纳米液滴的浓度降低2至10倍所需的水性液体的量。

在一个优选的实施方案中，本方法的所述任选步骤e)包括将收集的经校准的氟碳纳米液滴的水性悬浮液稀释1至20倍，优选3至8倍，更优选地将收集的水性悬浮液稀释5倍。

稀释的另一个作用是减少悬浮液中有机溶剂的相对量。

在进一步优选的实施方案中，本方法的步骤e)包含用水稀释收集的经校准的氟碳的悬浮液。

如上所述，由于有一个另外通道(例如，放置在图1中的混合装置103和出口通道104之间)，稀释步骤可以供选择地在微流体筒内部进行，目的是在经校准的氟碳ND悬浮液被引导至出口通道之前稀释它们。

在这种情况下，本方法的步骤e)包括将经校准的氟碳纳米液滴的悬浮液稀释1至20倍，优选3至8倍，更优选地将收集的水性悬浮液稀释5倍，然后从微流体筒收集它们。

任选的步骤f):冷冻

本发明的再另一个实施方案涉及一种用于制备经校准的氟碳纳米液滴的水性悬浮液的方法，所述方法在步骤e)之后包括任选的步骤f)，该步骤包括冷冻经校准的(全)氟碳纳米液滴的悬浮液。

在一个实施方案中，所述步骤f)包括在-60℃至0℃之间、优选地在-40℃至-10℃之间的温度冷冻经校准的(全)氟碳纳米液滴的悬浮液，更优选地所述温度是-30℃。

然后可以将冷冻的悬浮液在-30℃至-10℃之间、优选在-20℃的温度下储存。

申请人观察到，冷冻经校准的ND悬浮液允许进一步降低Evol％，与使用的摩尔比无关。

在另一个实施方案中，所述步骤f)包括将经校准的(全)氟碳纳米液滴冷冻在1至60分钟之间、优选地在5至30分钟之间的时间，更优选地，所述时间是15分钟。

在另一个实施方案中，在任选的步骤f)之前，如上所述使用水溶液进行在步骤e)的稀释，所述水溶液至少包含冷冻保护剂。

表述“冷冻保护剂”表示能够提高冷冻效率以保持初始ND尺寸并随时间推移基本上维持其初始单分散分布及其初始ND尺寸的任何化合物。适用于稳定经校准的纳米液滴的组分的实例是聚乙二醇(PEG)、多元醇、糖、表面活性剂、缓冲液、氨基酸、螯合复合物和无机盐。优选地，适合于稳定经校准的纳米液滴的组分是糖。

优选地，所述糖选自二糖、三糖和多糖，更优选地是二糖。二糖的实例包括：海藻糖、麦芽糖、乳糖和蔗糖。在二糖中特别优选的是海藻糖。

在一个优选的实施方案中，在步骤d)的所述水溶液包含海藻糖。

在另一个优选的实施方案中，所述水溶液具有在1-10％之间、优选3-7％的海藻糖浓度，更优选地是5％。

本发明的一个方面涉及一种水性悬浮液，其包含如上定义的纳米液滴和海藻糖。

本发明的另一个方面涉及一种包含多个如上定义的纳米液滴和海藻糖的水性悬浮液，其中所述纳米液滴具有低于0.25、优选地低于0.20、更优选地低于0.15、甚至更优选地低于0.10的多分散性指数(PDI)和在100nm至1000nm之间、优选地在120至600nm之间、更优选地在150至400nm之间的Z-平均直径。

声学液滴汽化

表述“声学液滴汽化(ADV)”表示由于施加的超声能量超过汽化阈值，(全)氟碳纳米液滴的内核从液态到气态的相移。

所述超声充当外部刺激从而以可控的、非侵入的和局部化的方式促进液滴的汽化。

在汽化阈值以下，纳米液滴是超声稳定的，具有低声学衰减，并且可以在感兴趣的位置声学汽化。由于纳米液滴与常规微泡相比的更小尺寸和体积，纳米液滴显示出更长的体内循环，通过血管外空间深入渗透到组织中(Helfield等人.2020)。

用途

经校准的BFS-PFC纳米液滴可以代表对用于医疗超声应用的气态微泡的替代方案。在施加超声能量后，液滴可以在感兴趣的区域中选择性地汽化以形成微泡。在活化后，经校准的BFS-PFC纳米液滴可以基本上以与常规对比增强超声(CEUS)相同的方式使用。

一个方面涉及用于诊断性和/或治疗性处理中的根据如上所定义的方法获得的水性悬浮液。

另一个方面涉及用于诊断性和/或治疗性处理中的包含如上定义的纳米液滴或多个纳米液滴和海藻糖的水性悬浮液。

诊断性处理包括其中充气微泡的使用允许增强动物(包括人类)身体的部分或器官的可视化的任何方法，包括用于临床前和临床研究的成像。诊断应用的合适实例是分子和灌注成像、肿瘤成像(EPR效应)、多模式成像(MR引导的肿瘤消融、荧光、声-光声活化)、US像差校正和超分辨率超声成像。

治疗性处理包括治疗患者的任何方法。在优选的实施方案中，所述治疗包括超声和(全)氟碳纳米液滴的联合使用，单独地(例如在超声介导的溶栓、高强度聚焦超声消融、血脑屏障透化、免疫调节、神经调节、辐射致敏中)或与治疗剂(即超声介导的递送，例如用于将药物或生物活性化合物递送至选定的部位或组织，诸如在肿瘤治疗、基因治疗、感染性疾病治疗、代谢疾病治疗、慢性疾病治疗、变性疾病治疗、炎性疾病治疗、免疫学或自身免疫性疾病治疗中或在作为疫苗的应用中)联合，由此所述纳米液滴的存在本身可以提供治疗效果或能够增强所应用的超声的治疗效果，例如通过在体外和/或在体内发挥生物学效应或引起发挥生物学效应，通过自身或在特异性活化后通过各种物理方法(包括例如超声介导的递送)实现。

下述实施例将帮助进一步举例说明本发明。

实施例

材料和方法

在随后的实施例中采用下述材料：

实施例1

使用微流体平台制备PFC纳米液滴

用来自Precision Nanosystems(温哥华，加拿大)的NanoAssemblr

可替换地(参见实施例5)，将收集的ND悬浮液用超纯水或海藻糖溶液(5％终浓度)稀释。

实施例2

BFS/PFC摩尔比的影响

研究了BFS/PFC摩尔比对经校准的全氟碳纳米液滴的稳定性的影响。

为此目的，使用Malvern Zetasizer Nano-ZS仪器(Malvern Instruments Ltd.，英国)对两种不同的PFC-ND组合物进行了表征，在不同阶段随时间测量尺寸(Z-平均值)和多分散性(PDI)：

-在从微流体筒收集它们后立即进行稀释(水，5倍)以后；

-在4℃储存1周以后，和

-在-20℃储存1周以后。

在室温(即25℃)进行每次测量。

测试两种不同的组合物：

●

●

如实施例1所述制备两种组合物，并设置工艺参数以获得每种组合物的BFS和PFC之间的不同摩尔比(从低到高)，如表2所示。测试了三种不同的FRR：3:1、2:1和1:1。

BFS/PFC摩尔比和相应的FRR显示在表2的前两列中。

结果

表2.在4℃或-20℃储存1周后，BFS/PFC摩尔比对组合物1和组合物2的尺寸和PDI的影响.

BFS/PFC摩尔比对经校准的PFC-ND的影响的研究的总体结果显示在表2中，该表显示了两种不同的经校准的ND组合物的尺寸和PDI表征之间的对比，所述ND组合物在从微流体筒收集它们后立即进行稀释(水；5倍)以后并在4℃或在-20℃储存1周后得到。

具体地，将ND尺寸随时间的变化表示为Evol％，按照等式2计算，如在说明书部分中所述。

接近0的Evol％的值表示经校准的ND悬浮液的更高稳定性，因此在悬浮液中的纳米液滴随着时间推移基本上保持其初始平均尺寸。

结果表明，在每个预定的FRR下使用较高的BFS/PFC摩尔比会实现随着时间推移改善的ND稳定性(即低Evol％)。

具体地，观察到，Evol％参数对BFS和PFC之间的摩尔比具有显著依赖性。这种效果在最高摩尔比值(即0.097、0.146和0.196)下特别明显。

实施例3

稀释步骤的影响

研究了在其制备后稀释收集的经校准的全氟碳纳米液滴悬浮液的影响。

为此目的，在从微流体筒出口收集后，立即使用水以不同稀释系数稀释经校准的PFC-ND悬浮液。

将PFC-ND悬浮液使用Malvern Zetasizer Nano-ZS仪器(Malvern InstrumentsLtd.，英国)进行表征，在不同阶段随时间推移测量尺寸(Z平均值)和多分散性(PDI)，即：

-紧接着从微流体筒出口收集经校准的PFC-ND悬浮液的步骤以后；

-将经校准的PFC-ND悬浮液用水稀释2倍以后，和

-将经校准的PFC-ND悬浮液用水稀释5倍以后。

在室温(即25℃)进行每次测量。

测试了两种不同的组合物：

●

●

如实施例1所述制备两种组合物，并设置工艺参数以获得每种组合物的BFS和PFC之间的不同摩尔比(从低到高)。测试了三种不同的FRR:3:1、2:1和1:1。

BFS/PFC摩尔比和相应的FRR显示在表3和4的前两列中。

结果

经校准的PFC-ND表征的总体结果显示在下表3和4中。

表3.稀释因子对组合物1的初始尺寸和PDI的影响

表4.稀释因子对组合物3的初始尺寸和PDI的影响

表3和4显示了紧接着在从微流体筒出口收集经校准的PFC-ND悬浮液的步骤以后和在其收集后立即进行的稀释以后，两种不同的经校准的PFC纳米液滴组合物的尺寸和PDI表征。

具体地，报告了未经稀释获得的尺寸和PDI值与以两种不同稀释度稀释样品获得的尺寸和PDI值之间的对比。

结果表明，对于每种BFS/PFC摩尔比的两种研究的组合物，稀释步骤允许减小ND初始尺寸(即从微流体筒的出口通道收集的经校准的ND组合物的ND尺寸)。

此外，将稀释系数从2倍增加到5倍，允许进一步减小两种研究的组合物在每种BFS/PFC摩尔比下的ND初始尺寸。

例如，通过用水对组合物3进行5倍稀释，可使具有0.146的BFS/PFC摩尔比的样品的尺寸减小约2倍，并且对于最高的BFS/PFC摩尔比，即0.196，使尺寸减小约5倍。

实施例4

使用5％海藻糖溶液稀释的影响

研究了在任选的冷冻步骤之前用包含海藻糖的水溶液稀释收集的经校准的ND的悬浮液的影响。

为此目的，在从微流体筒收集它们后，立即使用5％w/w的海藻糖水溶液稀释经校准的PFC-ND悬浮液。研究的稀释系数为5。

在稀释步骤后，将经校准的ND在-20℃冷冻并储存1周。

将PFC-ND悬浮液使用Malvern Zetasizer Nano-ZS仪器(Malvern InstrumentsLtd.，英国)进行表征，在不同阶段随时间推移测量尺寸(Z平均值)和多分散性(PDI)，即：

-使用5％w/w海藻糖水溶液将经校准的PFC-ND悬浮液稀释5倍以后，和

-在-20℃储存1周的时间段以后。

在室温(即25℃)进行每次测量。

为此目的，测试了组合物1(F

如实施例1所述制备两种组合物，并设置工艺参数以获得每种组合物的BFS和PFC之间的不同摩尔比(从低到高)。测试了三种不同的FRR:3:1、2:1和1:1。

BFS/PFC摩尔比和相应的FRR显示在表5的前两列中。

结果

在任选的冷冻步骤之前用包含海藻糖的水溶液稀释的影响的总体结果显示在表5中。

表5.用海藻糖溶液(5％w/w)稀释的影响

结果表明，当用5％的海藻糖水溶液稀释ND悬浮液时，在-20℃储存1周后，初始ND尺寸基本不变。

实施例5

全氟碳性质对ND尺寸和尺寸分布的影响

为了研究全氟碳对ND尺寸和尺寸分布的影响，测试了包含不同PFC的不同组合物，即：

-组合物4：包含由Dendri-TAC表面活性剂DiF

-组合物5：包含由Dendri-TAC表面活性剂F

如实施例1所述制备组合物4，并设置工艺参数以获得每种组合物的BFS和PFC之间的不同摩尔比(从低到高)。测试了三种不同的FRR:3:1、2:1和1:1。在从微流体筒收集后立即进行稀释(水，5倍)。随着所选FRR而变化的评价的BFS/PFC摩尔比的范围显示在表6的前两列中。

如实施例1所述制备组合物5，并将工艺参数设置为得到BFS与PFC的摩尔比为0.1：即FRR为1:1，且TFR为15ml/min。测试了在有机相中的两种PFOB浓度：2.5μL/mL和10μL/mL。

此外，研究了组合物5的稳定性，在不同阶段测量尺寸(Z-平均值)和多分散性(PDI)：

-在从微流体筒收集后立即进行稀释(水，4倍)以后，和

-在4℃储存1周以后。

在室温(即25℃)进行每次测量。

将得到的PFC-ND悬浮液(组合物4和组合物5)使用Malvern Zetasizer Nano-ZS仪器(Malvern Instruments Ltd.，英国)进行表征，将从微流体出口收集的ND悬浮液稀释(4倍)以后测量尺寸(z-平均值)和多分散性(PDI)。

结果

表6报告了从微流体制备的组合物4的表征得到的结果。

观察到在ND内核中使用全氟己烷作为PFC允许获得单分散ND悬浮液，其特征在于在约200-250nm尺寸范围内的均匀纳米液滴。

表6.用组合物4制备的纳米液滴

表7报告了从微流体制备的组合物5的表征得到的结果。

表7.用组合物5制备的纳米液滴

组合物5的表征进一步表明，在ND内核中使用全氟辛基溴作为PFC在ND尺寸方面产生了良好结果。此外，测定的PDI值证实了ND悬浮液的单分散性。

结果表明，使用全氟辛基溴(PFOB)作为PFC提供随着时间的良好ND稳定性(即低Evol％)。

实施例6

微流体方法的可重复性

为了评估所公开的微流体方法的可重复性，如实施例1中所述制备经校准的全氟碳纳米液滴的多种制剂并随后表征。

术语“可重复性”表示，对于相同样品的多次制备，微流体方法产生相似结果的能力的量度。

为此目的，制备了五个具有相同组成的PFC-ND样品，即摩尔比为0.196的组合物2(DiF

从微流体筒出口收集后，立即将样品用水将样品稀释5倍，并使用MalvernZetasizer Nano-ZS仪器进行表征以确定ND尺寸(Z-平均值)和多分散性(PDI)。

结果

表8.微流体制备的组合物2的多个制剂的表征

具有相同组成的微流体制备的多种制剂的表征(表8)表明，包括PFC-ND的重复样品具有相似的尺寸和PDI值。将可重复性系数(即重复测量之间可能发生的最大差异)计算为低于5％的变异系数。以百分比表示的变异系数是标准偏差与重复测量的总体平均值之比。

这些结果证实了所公开的微流体方法的高重复性。

实施例7

BFS混合物对ND尺寸和尺寸分布的影响

为了研究BFS混合物作为稳定剂对ND尺寸和尺寸分布的影响，将两种不同BFS(即两亲线性低聚物FTAC和树枝状聚合物DendriTAC)的混合物添加到水相中。

为此目的，制备了以下组合物：

-组合物6：由F-TAC表面活性剂(即F

测试了F

从微流体筒出口收集后，立即将经校准的PFC-ND悬浮液用水稀释5倍，并使用Malvern Zetasizer Nano-ZS仪器进行表征以确定ND尺寸(Z-平均值)和多分散性(PDI)。

结果

表9.BFS混合物(F

结果表明，在微流体制备的PFC-ND中使用BFS混合物作为稳定剂允许获得良好的PDI值，从而证实了纳米液滴在悬浮液中的良好单分散性。

使用F

实施例8

声学液滴汽化测定

根据使用B模式成像方法的常规方法，可以确定根据前面的实施例制备的ND的声学液滴汽化(ADV)阈值。

例如，ND的悬浮液可以在穿过换能器的焦区时被汽化，并且声压每10秒增加约0.2MPa(从约3.0MPa开始)，直到观察到ND汽化。使用6.0MHz的单元件换能器，根据前面的实施例制备的ND悬浮液显示出约4.2至4.6MPa的声学汽化值。以突发模式发射脉冲，每个脉冲200个周期，脉冲重复频率(PRF)为10Hz。

参考文献

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