基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及高灵敏度检测氨苄西林技术领域，具体涉及基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器的制备方法及应用。

背景技术

抗生素是一种天然的、合成的和半合成的化合物，可以杀死或抑制细菌、病毒和真菌的生长。自从1928年青霉素进入人类视野以来，更多的抗生素被发现和合成，并且被广泛用于预防或治疗人类和动物中的细菌感染。然而抗生素的利用是一把“双刃剑”，抗生素的发现使许多感染性疾病得到了有效控制，挽救了数百万人的生命。另一方面，因其高效、低毒、价格低、方便购买和临床应用广泛，因此出现了抗生素滥用的现象，其负面效应也开始显现，人类的健康和生命安全又面临新的考验。其中氨苄西林为半合成的广谱青霉素，属氨基青霉素类。其抗菌作用机制与青霉素相同。氨苄西林特点是广谱，不耐青霉素酶。氨苄西林对流感嗜血杆菌、大肠埃希菌、奇异变形杆菌、沙门菌属等革兰阴性细菌有很强的抗菌活性。对某些大肠杆菌、部分志贺菌属也有一定的抗菌活性，氨苄西林的不良反应与青霉素钠相似，以过敏反应较为多见。氨苄西林在生物体内只有一部分能够代谢。并且氨苄西林是水体中主要污染物。近年来氨苄西林在水环境中残留所引起的危害已受到人们的广泛重视，因此为降低氨苄西林的环境危害，对其检测分析仍然需要进一步研究。

电化学分析是依据电化学和分析化学的原理及实验测量技术来获取物质的质和量及状态信息的一门科学。由于不需要繁琐的实验过程，电化学分析方法在检测抗生素的研究和实际应用日益增多，这也引起了广大学者的研究兴趣。电化学分析技术的理论依据和技术层面正在经历不断的完善和优化，目前材料学科的不断发展更是助推了电化学传感器的研究。其中纳米材料泛指尺寸在原子到宏观物质之间(1-100nm)大小的一类材料，将纳米材料通过先进的纳米技术，结合各种各样的基质形成纳米复合薄膜引入到电极上以制备性能优良的修饰电极。在基底电极表面通过物理或化学方法引入复合纳米材料后，修饰电极把测定方法(如脉冲伏安、溶出伏安法等)的灵敏度与修饰材料的化学反应有机结合，不仅能够把复合纳米材料本身的独特性质引入电极界面，能提供传统材料难以实现的独特性质，也能结合复合材料的多功能性，从而达到提高电化学分析性能的目的。

分子印迹技术包括在含有目标分析物(印迹分子)存在下对单体的整体聚合。官能团单体最初与目标分子形成复合物，聚合后，其官能团被高度交联的聚合物结构保持在一定位置，当聚合物中的模板分子被洗脱后，聚合物中会留下与模板分子在形状结构及尺寸大小类似，化学功能互补的三维孔穴结构，这些空穴中具有特定识别位点，可以对目标分子特异性识别。将分子印迹技术与电化学分析相结合，能够显著提高电化学传感器的选择性，从而实现对实际复杂样品的分析检测。

环境中污染物的分析研究一直是我省环境建设与经济建设的重要研究方向之一，也是对科学工作者提出的必然要求。其中一个基本方面是对环境样本的持续筛选和监测，因此，制备用于快速分析检测环境中的痕量抗生素是十分必要的。

专利(CN109254049B)提出一种氨苄西林传感器的制备方法，在一次性可抛电极上制备了镍铁双金属层状氢氧化物纳米片阵列，采用原位生长的方式在其上相继制备了含有电子媒介体的聚多巴胺薄膜何以氨苄西林为模板分子的分子印迹聚合物，其中，镍铁双金属层状氢氧化物纳米片阵列电机的制备须在聚四氟乙烯反应釜里130℃温度下反应9-12h，制备周期长，工艺复杂，且制备分子印迹聚合物采用的原位生长法工艺效率较低。

专利(CN109444230B)提供了一种Au/CeO

专利(CN109254049A)提出一种氨苄西林分子印迹传感器的制备方法及应用，该方法中直接将共聚合单体吡咯、鲁米诺及模板分子氨苄西林共聚合在惰性电极上,该方法须在检测底液中加入电活性探针对鲁米诺结构进行电催化作用，才能获得较低的检测限。

专利(CN103926286B)提出了一种高灵敏度的纳米氧化钴掺杂的酞氨西林分子印迹电化学传感器及其制备方法，该方法采用N-叔丁基-2α-羟基-5α-雄甾烯-3-酮-17β-甲酰胺、偶氮二异丁腈、纳米氧化钴、马来松香丙烯酸乙二醇酯、酞氨西林为原料，通过热聚合的方式将印迹聚合物薄膜修饰在玻碳电极上，目前只有苯乙烯和甲基丙烯酸甲酯被公认为可热聚合，该方法反应结果不可控。

综上所述，现有的分子印迹电化学传感器的导电性和灵敏度都有待提高。因此有必要研发高灵敏、高特异性检测氨苄西林的电化学传感器。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有的分子印迹电化学传感器的导电性和灵敏度差的问题，而提供基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器的制备方法及应用。

基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器的制备方法，按以下步骤进行：

将Au NPs/g-C

基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器的应用，所述的基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器在选择性检测氨苄西林中的应用，具体检测步骤如下：

步骤一、含不同浓度AMP标准溶液的配制：

将氨苄西林用PH＝7.0的磷酸盐缓冲液配制1.0×10

步骤二、标准曲线的绘制：

将所述的基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极；将由工作电极、辅助电极和参比电极组成的三电极体系分别置于步骤一中制备的浓度范围为1×10

步骤三、样品检测：

利用步骤二中绘制的工作曲线，检测待测样品溶液中的氨苄西林。

本发明的有益效果：

(1)本发明中采用的纳米材料氮化碳(g-C

(2)本发明基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器采用的合成流程简单，并且用于对氨苄西林的特异性识别分析时，检测方法操作简单、快速、检测成本低廉，修饰电极的复合材料制备简单、价格低廉。

本发明可获得基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器的制备方法及应用。

附图说明

图1为实施例1基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器Ppy-MIP/AuNPs/g-C

图2为实施例1基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感Ppy-MIP/AuNPs/g-C

图3为实施例1中采用差分脉冲伏安法(DPV)检测基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器重新结合模板分子后的电信号变化与氨苄西林浓度的关系图；

图4为实施例1中基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器的检测标准曲线，y＝0.0285x+4.759R

图5为本发明实施例中基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器的选择性验证图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器的制备方法，按以下步骤进行：

将Au NPs/g-C

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同点是：所述的Au NPs/g-C

其他步骤与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同点是：所述的Au/g-C

其他步骤与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同点是：所述的Au/g-C

其他步骤与具体实施方式一至三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同点是：将尿素置于马弗炉中，以4～5℃/min的升温速率加热至550～580℃。

其他步骤与具体实施方式一至四相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同点是：所述的玻碳电极在使用前进行以下处理：依次使用粒径为1μm、0.3μm和0.05μm的氧化铝对玻碳电极表面进行抛光，然后再依次使用硝酸、无水乙醇和去离子水进行超声清洗。

其他步骤与具体实施方式一至五相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同点是：所述的含有功能单体和模板分子氨苄西林的PBS缓冲液按以下步骤制备：将功能单体和氨苄西林加入到PH为7的PBS缓冲液中，充分混合后，得到含有功能单体和模板分子氨苄西林的PBS缓冲液，所述的功能单体的体积、氨苄西林的质量与PBS缓冲液的体积的比为(4.0～6.0)μL：(0.4～0.6)mg：(15～25)mL。

其他步骤与具体实施方式一至六相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同点是：所述的功能单体为吡咯。

其他步骤与具体实施方式一至七相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同点是：使用由甲醇和乙酸组成的混合液对复合物氨苄西林薄膜进行洗脱，去除氨苄西林，所述的甲醇与乙酸的体积比为(8.5～9.5)：(0.5～1.5)。

其他步骤与具体实施方式一至八相同。

具体实施方式十：本实施方式基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器的应用，所述的基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器在选择性检测氨苄西林中的应用，具体检测步骤如下：

步骤一、含不同浓度AMP标准溶液的配制：

将氨苄西林用PH＝7.0的磷酸盐缓冲液配制1.0×10

步骤二、标准曲线的绘制：

将所述的基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极；将由工作电极、辅助电极和参比电极组成的三电极体系分别置于步骤一中制备的浓度范围为1×10

步骤三、样品检测：

利用步骤二中绘制的工作曲线，检测待测样品溶液中的氨苄西林。

采用以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例1：如图1所示，基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器的制备方法，按以下步骤进行：

步骤一、Au/g-C

用电子分析天平称取适量尿素加入到带盖的坩埚中，将其置于马弗炉中，以4℃/min的升温速率加热至550℃，并在550℃的温度条件下煅烧4h，煅烧结束后降至室温，研磨后得到g-C

步骤二、Au NPs/g-C

将2mg Au/g-C

所述的玻碳电极(GCE)在使用前进行以下处理：依次使用粒径为1μm、0.3μm和0.05μm的氧化铝对玻碳电极表面进行抛光，然后再依次使用硝酸、无水乙醇和去离子水进行超声清洗。

步骤三、基于金纳米粒子(Au NPs)/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器的制备：

将Au NPs/g-C

所述的含有功能单体吡咯和模板分子氨苄西林的PBS缓冲液按以下步骤制备：

取20mL PBS缓冲液(PH＝7)，用微量进样器移取5.0μL功能单体吡咯(Py)，准确称取0.5mg氨苄西林；将功能单体吡咯(Py)和氨苄西林加入到PBS缓冲液中，充分混合后，得到含有功能单体吡咯和模板分子氨苄西林的PBS缓冲液。

图2为实施例1基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感Ppy-MIP/AuNPs/g-C

步骤四、所述的基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器在选择性检测氨苄西林中的应用，如图1所示，具体检测步骤如下：

S1、含不同浓度AMP标准溶液的配制：

将氨苄西林用PH＝7.0的磷酸盐缓冲液配制1.0×10

S2、标准曲线的绘制：

将所述的基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极；将由工作电极、辅助电极和参比电极组成的三电极体系分别置于步骤一中制备的浓度范围为1×10

图3为实施例1中采用差分脉冲伏安法(DPV)检测基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器重新结合模板分子后的电信号变化与氨苄西林浓度的关系图，如图3所示，绘制工作曲线浓度分别为10、100、150、250、350、500、650和850μmol/L。

S3、样品检测：

利用步骤二中绘制的工作曲线(如图4所示)，检测待测样品溶液中的氨苄西林。

对比实施例1：基于金纳米粒子/氮化碳非印迹电化学传感器的制备方法；

(1)Au NPs/g-C

S1：用电子分析天平称取适量尿素加入到带盖的坩埚中，将其置于马弗炉中550℃煅烧4h，升温速率为4℃/min。待温度降至室温后取出样品，研磨后得到g-C

S2：将2mg Au NPs/g-C

S3：取20mL已配好的PBS(PH＝7)，用微量进样器移取5.0μL的Py，二者混合后配制成含功能单体和模板分子的磷酸盐缓冲液。

(2)Ppy-NIP/Au NPs/g-C

将裸的玻碳电极分别用1μm、0.3μm和0.05μm的Al

将修饰电极Ppy-NIP/Au NPs/g-C

试验部分：

1、实施例1中基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器的选择性验证：

比较实施例1中基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器在0.lmol/L磷酸缓冲溶液(PH＝7)中，对1×10

2、实施例1中基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器的稳定性验证：

实施例1中基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器在1个月后对氨苄西林的检测中保持了95.0％的初始反应，信号仅降低5％。

相对比于《Electrochemical Determination of Ampicillin Based on anElectropolymerized Poly(oPhenylenediamine)/Gold Nanoparticle/SingleWalledCarbon Nanotube Modified Glassy Carbon Electrode》中改良电极在1个月后对氨苄西林的检测中保持了91.7％的初始反应，表明本发明中的Ppy-MIP/Au NPs/g-C

3、实施例1中基于金纳米粒子/氮化碳印迹氨苄西林的电化学传感器的重现性验证：

采用与实施例1中同样的方法制造5根分子印迹电化学传感器，用于检测同批的含1×10-5mol/L氨苄西林的样品，相对标准偏差(RSD)为4.68％。

相对比于《Aptamer based voltammetric determination of ampicillin usinga single-stranded DNA binding protein and DNA functionalized goldnanoparticles》中改良电极5.09％的相对标准偏差(RSD)，本发明中重现性的相对标准偏差(RSD)更低，表明本发明中的Ppy-MIP/Au NPs/g-C

4、检测方法的回收率验证：

将已知氨苄西林浓度加入至含有未知氨苄西林浓度的牛奶样品中(包括直接使用含有未知AMP浓度的实际样品作对照)，0.l mol/L磷酸缓冲溶液(PH＝7)混合配置成待测液，然后将工作电极、参比电极和对电极浸没在待测溶液中，采用DPV平行测量3次求得平均氧化峰电流值，最后根据本实施例S2中建立的氨苄西林检测标准工作曲线，减去已知氨苄西林浓度得到实际样品中未知AMP浓度(包括直接测定得到未知OTA浓度)，采用标准加入法将检测得到的电流代入标准曲线方程，求出实际检测的浓度，然后用实际浓度除以加入的浓度得到回收率。可见，回收率在98.6％～100.4％之间，表明本实施例中的Ppy-MIP/AuNPs/g-C

表1