与骨关节炎相关的标志物LncRNA-51264及其应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种与骨关节炎相关的标志物LncRNA-51264及其应用。

背景技术

骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是关节软骨随时间逐渐退化的慢性疾病，关节软骨覆盖在骨末端，形成关节的关节面。据报道有许多因素使患者易患骨关节炎，包括遗传易感性、肥胖、意外或运动创伤、手术、药物和重体力需求。骨关节炎是一种关节退行性疾病，会导致关节软骨的不可逆性破坏，从而引起关节疼痛和活动受限，严重影响长期的生活质量。关节损伤后，通常需要手术重新稳定关节以恢复功能和缓解疼痛，但报道显示手术重新稳定关节并不能降低发展成骨关节炎的风险。

作为软骨中唯一细胞，软骨细胞功能紊乱被认为是骨关节炎发生发展的关键。软骨细胞合成和分泌Col2a1和Aggrecan等细胞外基质(ECM)成分，维持关节软骨正常的形态、结构和功能。在病理状态如炎症、异常机械应力等刺激下，软骨细胞外基质代谢失衡在骨关节炎的发生发展中起着至关重要的作用。上述功能紊乱会导致软骨细胞中促进基质分解的MMP13和ADAMTS5表达增加，而促进基质合成的Col2a1和Aggrecan表达下调，使软骨ECM分解大于合成，基质结构进行性损伤，而ECM的破坏又会加重软骨细胞所承受的应力，形成软骨退变的恶性循环。

现有的骨关节炎治疗方法包括运动、药物、休息和关节保健、手术、疼痛缓解技术、替代治疗和体重控制。治疗骨关节炎中常用的药物包括非甾体类抗炎药(如阿司匹林、布洛芬)等；可进行手术以使骨表面重建、骨复位和置换关节。尽管各种药物疗法己被用于治疗骨关节炎疾病，但是它们对长期控制和预防骨关节炎是无效的。此外，由于骨关节炎隐匿式发生并且发展缓慢，因此骨关节炎经常在疾病发展的晚期才得到鉴定，而不是潜在治疗可能更有效的疾病发展早期。因此预防、改变或治疗骨关节炎疾病的进一步发展严重依赖于鉴定疾病的早期诊断标志物，从而使得早期干涉、预防以及治疗骨关节炎得以实现。

随着基因组学的发展，深度测序等新技术已经显示大部分DNA核苷酸序列被转录成RNA。然而，仅有12％的人类基因组编码蛋白质，因此将RNA分为编码RNA和非编码RNA(ncRNA)。过去，ncRNAs被认为是“进化垃圾”，但越来越多的证据表明，ncRNA对细胞的各种生物学行为有重要调控作用。LncRNA在细胞内具有更高的转录比例，并且可折叠成复杂高级别结构，因此其生物学功能更加复杂。随着高通量测序技术的发展，越来越多的LncRNAs被注释。LncRNA通过不同的机制在转录以及转录后水平调控靶基因表达以影响多种病理生理进程。因此，本发明旨在探寻有效的LncRNA作为骨关节炎临床诊断、治疗和预后检测的标记物，从而提高骨关节炎患者的生活质量。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种与骨关节炎相关的LncRNA标志物NONMMUT051264(简称LncRNA-51264)及其应用。本发明发现在骨关节炎病理状态下的关节软骨细胞中LncRNA-51264的表达明显低于正常关节软骨细胞，另外，过表达LncRNA-51264可用于抑制软骨细胞基质代谢失衡和延缓骨关节炎进展。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

首先，本发明提供了长链非编码RNA LncRNA-51264作为生物标志物在制备诊断骨关节炎发生及预后试剂中的应用，其中，LncRNA-51264的序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明发现在骨关节炎病理状态下的关节软骨细胞中LncRNA-51264的表达明显低于正常关节软骨细胞，因此，LncRNA-51264的表达水平降低可以作为诊断骨关节炎发生及预后的生物标志物。可采用qRT-PCR方法检测软骨细胞中LncRNA-51264的表达水平，其中，用于检测LncRNA-51264的引物为：

正向引物：5’-TCCTTCAGTCTCCGCTCCATCTTAG-3’，

反向引物：5’-AAGCCAGTGTCTTTCTGCCATTCC-3’。

基于上述内容，可将用于检测LncRNA-51264表达水平的试剂作为诊断骨关节炎发生及预后试剂。

其次，本发明还提供长链非编码RNA LncRNA-51264在制备治疗骨关节炎药物中的应用，所述药物用以提高长链非编码RNA LncRNA-51264的表达量。

在细胞模型中发现，与对照组相比，LncRNA-51264表达水平在OA软骨细胞模型中显著降低，过表达LncRNA-51264后软骨细胞中促进基质分解的MMP13和ADAMTS5表达下调。同时，本发明发现构建的长链非编码RNA LncRNA-51264的基因运载系统可以作为用于抑制软骨细胞基质代谢失衡和延缓骨关节炎进展的治疗新途径。关节腔注射过表达LncRNA51264的基因疗法延缓了内侧半月板失稳(DMM)诱导的小鼠骨关节炎模型软骨损伤和基质降解。

基于上述内容，可将用以提高长链非编码RNA LncRNA-51264的表达量的药物作为治疗骨关节炎的药物，如长链非编码RNA LncRNA-51264的过表达载体。

本发明的有益效果在于：

本发明找到了延缓骨关节炎进展的新靶点：长链非编码RNA LncRNA-51264。

由于长链非编码RNA LncRNA-51264作可以为调控骨关节炎进展的潜在分子，因此通过构建LncRNA-51264的基因运载系统可为抑制软骨细胞基质代谢失衡和延缓骨关节炎进展的治疗提供新途径。

本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：

图1为过表达LncRNA-51264基因疗法在骨关节炎细胞模型中治疗效果的评价。

a、b、c表示在软骨细胞中加入IL-1处理后MMP13、ADAMTS5、LncRNA-51264的表达。d、e、f表示在骨关节炎细胞模型中转染LncRNA-51264过表达慢病毒后MMP13、ADAMTS5、LncRNA-51264的表达。

图2为软骨细胞中LncRNA-51264的表达和定位情况，标尺＝200μm。

图3为GV513的载体图谱。

图4为GV461的载体图谱。

图5为关节腔注射过表达LncRNA-51264的基因疗法的骨关节炎修复效果的评价。

DMM后8周关节病理切片番红O-固绿染色和H&E染色，标尺＝200μm；

关节软骨MMP13和COLII免疫组化染色，标尺＝100μm。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

实施例1

1、小鼠原代软骨细胞的提取、培养及骨关节炎细胞模型的建立

从5-7日龄的C57BL/6J小鼠膝关节软骨中提取小鼠原代软骨细胞。方法如下：将小鼠膝关节软骨组织解剖成块后，用0.25％胰蛋白酶消化30分钟，剔除软骨周围多余的组织成分，将关节软骨剪碎后在0.5mg/mL II型胶原酶中37℃消化6小时。细胞重悬后在含有10％胎牛血清和1％双抗的DMEM/F12培养基中培养，放置在37℃、5％CO

LncRNA-51264的序列如SEQ ID NO:1所示：

ATCACCATACCAAGCAGGATTGTGTCCAGTTGTTTCTCTTTCTGGTGCCTTGTATGATGCCAAGTAACGCTGAAACTCGGCAAATCAGGGCTGAAGAGAACCATGTTGGAATGTGCAAAGTGCCAAATTAAAGGTCCCAGCCTAAATGCTGTCATTCAGAATGAAGGGAGCAACTAAAAGTTGAGAAGAGTCCAGGAGACTTTCAGAGAATATGTGACATGGCTTGAACTATCAGTTGGCTTTTCCTAGAAGAAGAAAGAAAAGCACCTCTAAGTAGAATAAATACAAGGGAGGCAGGAACAATGAAAATTCCTGTATTTCCCCCAGAGAACAAGTATTCCAAATGAATGGAGCACAAGTGTTCATTCAACAAAATAAAACAAAAACAAAACAAAAACAAAATATCATTCCTTAAGTCAAAATGGTGTCCTAATTTCTGAGTTTGAATTATTGTCCTATGAGTTTCAGTCATATTGTCATCCCTGGCATATATAATTCTATGTCAGGTATTTTTCTTTACTTCCTCCACACATGCCTTAGCTTCCTTCCTTTTTTCTTTTTCCTTTTATTGAAAATAGGTTTTTTTCATCACATAATATATCACCAATTACAGTTTCCCCTTCATCTTCTTCTCCAAGTTTCTCTCCACTTCCCTTATCCCATAGGGATCCACTCCCTTTCTGTCTCTCATTAGAAAACAAACAGACTTCTAATGAATAATAATAAAATTAAATTAAATAAGATAAAACAGAATCTAATGAGTGGATCTCTGTTTCTTGTGCCTTTTGTTTGGATCTTTTTCTTCTGTTTGTTTGTTTGTTTCATCCAACTCTGATGTCTTAATTTACTTAATACTGACCTCATTTAGTCTCCTCTCAGTGGGGGCTGTGTCAATGTACAATGACCCTATAGCCATTCAAAATATTTTTCTGCCAGAATCTTTCCTGTAGTTATTTTTGTAAATTAATTTATTTGTTTACATCCAAATGCAGCATCCCTCCCAGTCCCTTCTCACAGGGTTCCTCTCCCATCCCGCTCGCTCCCCTTCATCTCTGAGAGGGTGTTCCCTTCCTCCTGTATCACCACATCCTGATGCATCAAGTATCTGCAGGATTAGGCATATCCTCTCCAACTGTTGCCAGAGAAGGCAGACCTCTGCTGGATCCTTGGATCAGCCAGTGTATACTCTTTGGCTGGTAGCTCAATCTTTGGAAGCTCCCAAGGGTCCAGGTTAGTTGACACTGTTGGTCTTCCTGTGGAGTTTCCATCATCTTTTCAGGCCTTTAATCCTTCCCCTAGCTCTTCCATAGGGATCCTCAACCTCCATCCAGTGTTTGGTGGTGGTGGTGTCTGCATCTGTCTCAGTCAGCTGCTGAGTAAGAAGAGACTCTTAGAGGACAACTATGCTAGGTTCCTGTCTGCAAGCACACAGCATCACTAACAGTGTCAGGGATTAATGCCTGCCCATGGGATGAATCTCAAGTTGAGCTAGTCACTGGTTGGCCATTCCTTCAGTCTCCGCTCCATCTTAGTCCCTACATTTCTTTTAGCTAGAAACAATTTGAAATTGAAAGTTTTGTAAATGGGTTGGTCACCATGCATCAGCTAGAATTTTTGAGTTCCATGGAGGAATGGCAGAAAGACACTGGCTTCTTTGTTTAACCCCTCTGTGCACTAACTCAGTTCAAATGACAATTGCTATTCTGTTTACCCATCTGTAGTATTGGAAAAATGTGGCCTTAATAACCAGCTTAGCCTTGATAGTTTGCAGTACGGCTACTATAAAAACACCTTTCAAGTATGAAATTTGTATTTGTTCAAAGTCTTTCTGGTGGAGTAACTCATAGCCAAGCAACAGTGCAGGTCAGGCAAGCATATGTGATTAAAGGCAAAGATATATATTTTTAAAAAAATACAAAAAGTAGAAATAAAAGTAAAAGTCTTAGGTTCATTTTGAAATTGTCAACCTCACACTATTACATTAAATTGTCACTATTAATTTCCTAGAACAAAATGTATGTTCTTTTGATCTTTATATGACATGAATAGATATAATGTTTATTTATATAGAACCTAAACAAAAATCCTCATAAATATGTTCAAACCATCACAACATGCGTAATTTTGAAGTTTTACCTCACCCTCTCTTCTCTTTGTAAGCCTCGTTGAGCATTAGACATCAGTAAACATTTTAAACCC。

(1)将小鼠第二代软骨细胞用IL-1β(10ng/mL)处理48小时，收集并提取细胞总RNA样本。采用Trizol法提取细胞RNA，具体的，向5×10

(2)RNA逆转成cDNA：使用TAKARA公司的逆转录试剂盒去基因组DNA，按照试剂盒说明书进行RNA逆转录，逆转录体系如下：

第一步：

将上述混合物混匀，PCR仪反应42℃2min，继续第二步逆转：

混匀后，进行逆转录PCR，条件如下：50℃，15min；85℃，5s，得到的cDNA产物可用于qRT-PCR。

(3)将上一步的cDNA作为模板进行qRT-PCR，使用TAKARA公司的SYBR Green Mix，按照试剂盒说明书进行qRT-PCR。qRT-PCR的10μL体系如下：

引物序列如下：

qRT-PCR实验结果显示，加入IL-1β会促进软骨细胞中软骨基质降解基因MMP13及ADAMTS5的表达，说明IL-1β可以诱导骨关节炎的细胞模型(图1a，1b)。在诱导得到的骨关节炎细胞模型中，LncRNA-51264的表达量显著降低(图1c)。

3、原位杂交观察软骨细胞中LncRNA-51264的定位情况

(1)细胞培养：将细胞爬片置于24孔板孔底，种5×10

(2)细胞固定与通透：PBS清洗细胞5min；4％多聚甲醛室温固定10min；1×PBS清洗细胞5min，共3次；每孔加入1mL预冷的通透液，4℃静置5min；弃去通透液后，加入1×PBS清洗细胞5min，3次。

(3)探针检测：每孔加入200μL预杂交液，37℃封闭30min，同时在37℃中预热杂交液；避光条件下，把2.5μL 20μM lncRNA FISH Probe Mix储存液或内参FISH Probe Mix储存液加入到100μL杂交液中；弃去每孔细胞中的预杂交液，加入100μL含有探针的探针杂交液，避光，37℃杂交过夜；避光，42℃，杂交洗液I清洗每孔细胞3次，每次5min，以降低背景信号；避光，42℃，杂交洗液II清洗细胞1次；避光，42℃，杂交洗液III清洗细胞1次；避光，1×PBS清洗细胞，室温5min。

(4)DNA染色：避光，1×DAPI染色液染色10min，染色液用量以覆盖待杂交区域所有细胞为宜；避光，1×PBS清洗细胞3次，每次5min。

(5)封片：避光条件下，从孔中小心取出细胞爬片，用封片剂将其固定于载玻片上，进行荧光检测。

原位杂交实验结果如图2所示，LncRNA-51264在软骨细胞的细胞核和细胞质中均有表达。

4、过表达LncRNA-51264对软骨细胞外基质代谢平衡的影响

(1)慢病毒转染特异性过表达LncRNA-51264：过表达LncRNA-51264的慢病毒载体从上海吉凯基因科技有限公司订购；所述过表达LncRNA-51264的慢病毒载体是将LncRNA-51264插入载体GV513中，载体GV513的元件顺序：Ubi-MCS-CBh-gcGFP-IRES-puromycin；LncRNA-51264的克隆位点：BamHI/NheI，GV513的载体图谱如图3所示。

在小鼠第二代软骨细胞中用转染表达LncRNA-51264的慢病毒，采用qRT-PCR检测LncRNA-51264过表达是否成功并对软骨细胞外基质代谢平衡进行测定。

转染体系如下：

转染过程如下：在六孔板中种2×10

转染之后使用5μg/mL的嘌呤霉素筛选48h，最后去除嘌呤霉素，加入含10ng/mlIL-1β的新鲜培养基处理48h后收获细胞。

qRT-PCR检测过程：

(2)细胞总RNA提取：Trizol法提取RNA(与“qRT-PCR验证骨关节炎软骨细胞LncRNA-51264的表达情况”中方法相同)。

(3)RNA逆转成cDNA：使用TAKARA公司的逆转录试剂盒去基因组DNA，按照试剂盒说明书进行RNA逆转录，逆转录体系与“qRT-PCR验证骨关节炎软骨细胞LncRNA-51264的表达情况”中相同。逆转录体系混匀后，进行逆转录PCR，条件如下：50℃，15min；85℃，5s，得到的cDNA产物可用于qRT-PCR。

(4)将上一步的cDNA作为模板进行qRT-PCR，使用TAKARA公司的SYBR Green Mix按照试剂盒说明书进行qRT-PCR。10μL体系：

引物序列如下：

qRT-PCR实验结果显示，LncRNA-51264过表达成功。过表达LncRNA-51264后，MMP13和ADAMTS5的表达显著下调(图1d，1e，1f)，说明LncRNA-51264抑制了软骨细胞基质代谢失衡，是调控骨关节炎进展的潜在分子。

综上所述，LncRNA-51264是延缓骨关节炎进展的新靶点。

5、关节腔注射过表达LncRNA-51264载体的基因疗法

(1)小鼠骨关节炎模型构建：

所有小鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物处理和实验程序经中国人民解放军陆军军医大学实验动物福利伦理审查委员会批准。选用10周龄雄性C57BL/6J小鼠进行体内实验。采用内侧半月板失稳(DMM)诱导骨关节炎模型。从右膝关节远端髌骨向上至胫骨平台近端切口，充分暴露右膝关节，用手术刀切断内侧半月板胫骨韧带，以更好地分离内侧半月板。然后使用微血管钳取出半月板，并在切口处缝合多层。假手术组以同样的方式进行，只是没有切断内侧半月板胫骨韧带。

(2)关节注射LncRNA-51264：

过表达LncRNA-51264的腺相关病毒(AAV)载体由上海吉凯基因科技有限公司构建和包装；所述过表达LncRNA-51264的腺相关病毒(AAV)载体是将LncRNA-51264插入GV461载体中，载体GV461的元件顺序：CMV-betaGlobin-MCS-SV40 PolyA；LncRNA-51264的克隆位点：BamHI/HindIII，载体GV461的图谱如图4所示。

初始手术后1周，将小鼠随机分为3组(Sham组(假手术组)、AAV-control组(即OA组；DMM诱导后，注射AAV阴性对照)、AAV-LncRNA组(DMM诱导后，注射AAV-LncRNA-51264))，每组8只。将表达LncRNA-51264的实验病毒或阴性对照病毒(约1*10E13 vg/ml)共10μL溶液缓慢注射至膝关节。8周后处死小鼠。然后对3组膝关节进行组织学分析。

(3)番红O-固绿染色、HE染色、免疫组织化学染色分析：

将3组膝关节组织样品进行解剖，在室温下4％聚甲醛中固定48h。10％EDTA溶液脱钙2周，石蜡包埋，获得5μm厚的组织学切片，进行番红O-固绿染色、H&E染色和免疫组织化学染色。

番红O-固绿染色研究软骨组织：小鼠软骨组织常规石蜡切片脱蜡至水；切片经Weigert’s铁苏木精预处理染色5min后，去除Weigert’s铁苏木精，用1％酸-酒精(v/v)洗涤3次；加入Safranin O染液(2％，w/v)，孵育30min；使用固绿染色液(0.02％，w/v)作为背景消染剂；分别用95％乙醇、无水乙醇脱水。二甲苯透明，光学树脂封片。

H&E染色研究软骨组织损伤情况：小鼠软骨组织常规石蜡切片脱蜡至水，切片经苏木精染液染色5min后，用自来水冲洗。冲洗后，加入盐酸乙醇进行切片分化30s。随后浸泡在PBS中15min。加入伊红溶液染色2min，然后用95％乙醇溶液冲洗组织切片。最后分别用95％乙醇、无水乙醇脱水。二甲苯透明，光学树脂封片。。

MMP13、COL2a(即COLII)免疫组织化学染色：小鼠软骨组织常规石蜡切片脱蜡至水；3％过氧化氢孵育10min，蒸馏水冲洗，1×PBS浸泡5min；抗原修复后正常山羊血清工作液室温孵育15min；滴加适当比例稀释的对应一抗，4℃孵育过夜；滴加生物素标记二抗，37℃孵育30min；滴加辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育30min；DAB显色。

采用番红O-固绿染色和H&E染色检测各组中术后8周小鼠的关节软骨变化如图5所示，结果显示OA组与Sham组相比，关节软骨表面磨损严重，染色缺失。而与OA组相比，AAV-LncRNA组的基质染色和潮线推进有明显的改善。

此外，MMP13、COL2a1(即COLII)免疫组织化学染色显示，与OA组相比，AAV-LncRNA组关节软骨中MMP13的表达显著下降，COLII的表达水平得到显著的恢复(图5)。

上述结果表明关节腔注射过表达LncRNA-51264的基因疗法延缓了DMM诱导的小鼠骨关节炎模型中的软骨损伤和基质降解，通过构建长链非编码RNA LncRNA-51264基因运载系统是用于抑制软骨细胞基质代谢失衡和延缓骨关节炎进展的治疗新途径。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。