抗ALPP/ALPPL2抗体和抗体-药物缀合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年3月18日提交的美国临时申请号63/162,635和2022年1月21日提交的美国临时申请号63/301,574的权益，出于所有目的将这两个临时申请中的每一个通过引用整体并入。

序列表的引用

本申请包括2022年3月4日创建的名为5620-00112PC_ST25并包含106Kb的文件中的电子序列表，该电子序列表据此通过引用并入。

技术领域

本发明涉及新型抗ALPP/ALPPL2抗体和抗体-药物缀合物及使用此类抗ALPP/ALPPL2抗体和抗体-药物缀合物治疗癌症的方法。

背景技术

ALPP(也称为胎盘碱性磷酸酶)和ALPPL2(也称为胎盘样碱性磷酸酶2)是主要在胎盘中表达的旁系同源基因。ALPP和ALPPL2是参与ATP自细胞外空间再循环的膜结合蛋白。ALPP在多种癌症中上调，这些癌症包括卵巢癌、肺癌、子宫内膜癌、膀胱癌和胃癌。ALPPL2也在多种癌症中上调，这些癌症包括卵巢癌、肺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、胃癌和睾丸癌。卵巢癌是第五大常见的妇科恶性肿瘤，并且需要对这种疾病的改进的治疗。

本文引用的所有参考文献，包括专利申请、专利公布和科学文献，均通过引用整体并入本文，如同每个单独的参考文献具体地且单独地被指明通过引用并入一般。

发明内容

本文提供了抗ALPP抗体和针对ALPP的抗体-药物缀合物(ADC)，及抗ALPPL2抗体和针对ALPPL2的ADC。本文还提供了可结合ALPP和ALPPL2两者的抗体(抗ALPP/ALPPL2抗体)及针对ALPP和ALPPL2两者的ADC(针对ALPP/ALPPL2的ADC)。本文还提供了使用针对抗ALPP/ALPPL2的抗体和ADC治疗表达ALPP和/或ALPPL2的病症(包括癌症)的方法。在一些实施方案中，抗ALPP/ALPPL2抗体包含SEQ ID NO:56、57和58的重链CDR序列和SEQ ID NO:63、64和65的轻链CDR序列，如通过Kabat编号所确定的。在一些实施方案中，抗ALPP/ALPPL2抗体包含SEQ ID NO:60、61和62的重链CDR序列和SEQ ID NO:66、67和68的轻链CDR序列，如通过IMGT编号所确定的。

附图说明

图1示出了使用对COV644和NCI-H1651肿瘤细胞具有和不具有旁观者活性的有效负载对作为ADC的ALPP/ALPPL2特异性抗体的细胞毒性评估。

图2A至图2C示出了在使用不具有旁观者活性的有效负载对作为ADC的顶级ALPP/ALPPL2特异性抗体进行细胞毒性评估后，细胞系CAOV3、COV644和NCI-H1651的剩余活力。

图3示出了ALPP/ALPPL2特异性抗体的结合亲和力。

图4示出了通过流式细胞术测得的抗体1F7和12F3与表达ALPP和ALPPL2的HEK293细胞的完整结合概况。

图5示出了h12F3可变重链变体与人重链受体序列IGHV3-49/HJ4的序列比对。

图6示出了h12F3可变重链变体的可变结构域比对。

图7示出了h12F3可变轻链变体与人κ受体序列IGKV1-33/KJ2的序列比对。

图8示出了h12F3轻链变体的可变结构域比对。

图9示出了存活的CAOV3细胞的百分比。该图的左侧示出了含有人源化F轻链变体和不同重链的ADC的剂量-反应曲线的活力百分比。该图的右侧示出了含有人源化D重链和不同轻链变体的ADC的活力。

图10示出了具有mp-dLAE-MMAE(4)药物接头的人源化变体之间的体外效力相关性。

图11示出了h12F3 HGLF ADC在体外对3D球状体的细胞毒性概况。示出了h12F3HGLF和HFLD变体与ALPP和ALPPL2 Fc融合体的动力学结合曲线和值。

图12示出了h12F3 HGLF在不同抗体浓度下的内化动力学。

图13示出了h12F3 HGLF和HFLD变体与ALPP和ALPPL2 Fc融合体的动力学结合曲线和值。

图14示出了h12F3 HGLF和HFLD与ALPP和ALPPL2 fc融合体在pH 7.4和pH 6下的动力学结合曲线和值。

图15示出了h12F3 HGLF-dLAE-MMAE和HFLD-dLAE-MMAE在CAOV3小鼠模型中的体内抗肿瘤活性。

图16示出了h12F3 HGLF-dLAE-MMAE和HFLD-dLAE-MMAE在NCI-N87小鼠模型中的体内抗肿瘤活性。

图17示出了h12F3 HFLD-dLAE-MMAE和HFLD-vc-MMAE在NCI-N87小鼠模型中的体内抗肿瘤活性。

图18示出了h12F3 HFLD-dLAE-MMAE和HFLD-vc-MMAE在H1651小鼠模型中的体内抗肿瘤活性。

图19示出了在用与vc-MMAE和dLAE-MMAE缀合的h12F3ADC处理后，七种异种移植物模型中的肿瘤体积变化％。

图20示出了h12F3 HGLF-mc-vc-MMAE或h12F3 HGLF-mp-dL AE-MMAE缀合物与它们各自的同种型ADC对照相比在NCI-N87胃模型中的体内抗肿瘤活性。

图21示出了h12F3 HGLF-mc-vc-MMAE或h12F3 HGLF-mp-dL AE-MMAE缀合物与它们各自的同种型ADC对照相比在NCI-N87胃模型中的体内抗肿瘤活性。

图22示出了h12F3-HGLF mc-vc-MMAE和mp-dLAE-MMAE对包括胰腺(HPAC)、胃(NCI-N87)、卵巢(CAOV3)和肺(SNU-2535)的四种异种移植物肿瘤模型的肿瘤生长抑制的总结。平均非目标ADC示出为虚线。

图23示出了用h12F3-HDLF-mc-vc-MMAE处理的卵巢患者来源的异种移植物的抗肿瘤活性。A)示出了十二种异种移植物的肿瘤生长抑制的总结，而B)和C)示出了与未处理的队列相比的两种缀合物处理的模型的实例。

图24示出了h12F3 HGLF和HFLD对人ALPP和猴直系同源物ALPP的结合亲和力。

图25示出了h12F3 HGLF对表达嵌合大鼠/人ALPP的HEK293细胞的表位作图。

图26示出了示出h12F3、h12F3-HGLF-mc-vc-MMAE、h12F3-mp-dLAE-MMAE或阳性对照mAb(按行变化)与人Fc受体(按列变化)的结合的传感图。平衡解离常数列于每个传感图的右上角。

图27示出了在存在h12F3 HGLF、h12F3 HGLF-mc-vc-MMAE或h12F3 HGLF-mp-dLAE-MMAE缀合物的情况下，将Na2[51Cr]O4(Cr-51)标记的细胞与NK细胞一起温育后，通过铬释放测定确定的LoVo细胞的细胞裂解。

图28示出了在存在h12F3 HGLF、h12F3 HGLF-mc-vc-MMAE或h12F3 HGLF-mp-dLAE-MMAE缀合物的情况下，与阳性(功能阻断性抗CD47抗体)或同种型对照相比，与LoVo细胞一起温育的巨噬细胞的吞噬活性。

图29示出了h12F3 HGLF抗体和ADC对发光报道分子的FcgRIII介导的激活。

图30示出了两种不同浓度的h12F3 HGLF-mc-vc-MMAE或h12F3 HGLF-mp-dLAE-MMAE缀合物对牵涉于免疫原性细胞死亡的两种信号传导途径的激活。

图31示出了与游离MMAE细胞毒素相比，用1或10mg/ml h12F3HGLF-mc-vc-MMAE或h12F3 HGLF-mp-dLAE-MMAE缀合物处理24或48小时的LoVo细胞在培养基中的ATP释放。

具体实施方式

本文所使用的小节标题仅出于组织性目的并且不解释为限制所描述的主题。

本文描述或引用的技术和程序通常是本领域技术人员使用常规方法充分理解和常用的，例如以下文献中描述的广泛使用的方法：Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual第4版(2012)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor N.Y.；Current Protocols In Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑,(2003))；METHODS IN ENZYMOLOGY系列(Academic Press,Inc.)；PCR 2:A PracticalApproach(M.J.MacPherson、B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995))；Greenfield编辑(2013)Antibodies,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编辑,1998)AcademicPress；Animal Cell Culture(R.I.Freshney)编辑,1987)；Introduction to Cell andTissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and TissueCulture Laboratory Procedures(A.Doyle、J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑,1993-8)J.Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编辑,1994)；CurrentProtocols in Immunology(J.E.Coligan等人编辑,1991)；Short Protocols inMolecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.编辑,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean编辑,Oxford University Press,2000)；Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编辑,Harwood Academic Publishers,1995)；Cancer:Principlesand Practice of Oncology(V.T.DeVita等人编辑,J.B.Lippincott Company,1993)；及它们的更新版本。本段中的前述参考文献中的每一篇均通过引用整体并入本文。

I.定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开相关领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。例如，Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；The Dictionary of Celland Molecular Biology,第5版,2013,Academic Press；及Oxford Dictionary OfBiochemistry And Molecular Biology,第2版,2006,Oxford University Press，为技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。

除非上下文另有要求或明确指出，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。

应当理解，本文所述的本发明的方面和实施方案包括“包含”、“由……组成”和/或“基本上由……组成”方面和实施方案。

如本文所用，除非另外指明，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“该/所述”应当理解为是指“一种或多种”任何所列举或枚举的组分”。

当在本文使用时，术语“和/或”应当视为具有或不具有另一者的两种特定特征或组分的每一者的具体公开。因此，如本文在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”意图包括：“A和B”、“A或B”、“A”(单独)及“B”(单独)。类似地，如在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”意图涵盖以下方面的每一种：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A (单独)；B(单独)；及C(单独)。

术语“约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，这将部分取决于如何测量或确定该值或组成，即测量系统的局限性。如本领域技术人员所理解的，本文中提及“约”值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。

如本文所述，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应被理解为包括所述范围内的任何整数及在适当时的其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)的值，除非另外说明。

当本文使用商品名时，除非上下文另有说明，否则提及商品名还指商品名产品的产品制剂、仿制药和活性药物成分。

术语“ALPP”、“碱性磷酸酶”、“胎盘碱性磷酸酶”、“ALPase”或“PLAP”在本文中可互换使用，并且除非另有说明，否则包括人ALPP的任何天然存在的变体(例如，剪接变体、等位基因变体)、异型体和脊椎动物物种同源物。该术语涵盖“全长”、未加工的ALPP以及细胞内加工产生的任何形式的ALPP。Uniprot ID：P05187或RefSeq ID：NM_001632中提供了示例性人ALPP的氨基酸序列。成熟人ALPP蛋白的一个具体实例的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

术语“ALPPL2”、“胎盘样碱性磷酸酶2”或“生殖细胞碱性磷酸酶”在本文中可互换使用，并且除非另有说明，否则包括人ALPPL2的任何天然存在的变体(例如，剪接变体、等位基因变体)、异型体和脊椎动物物种同源物。该术语涵盖“全长”、未加工的ALPPL2以及细胞内加工产生的任何形式的ALPPL2。Uniprot ID：P10696或RefSeq ID：NM_031313中提供了示例性人ALPPL2的氨基酸序列。成熟人ALPPL2蛋白的一个具体实例的氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示。

如本文所用，“抗原结合蛋白”(“ABP”)是指结合特定靶抗原的任何蛋白，而不是结合特定抗原的天然存在的同源配体或这种配体的片段。在本申请中，特定的靶抗原是ALPP和/或ALPPL2或ALPP和/或ALPPL2的片段。“抗原结合蛋白”包括包含至少一个抗原结合区或结构域(例如，至少一个如本文定义的高变区(HVR)或互补决定区(CDR))的蛋白。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含支架，诸如一种或多种多肽，其中嵌入和/或连接有一个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)如本文所述的HVR或CDR。在一些抗原结合蛋白中，HVR或CDR被嵌入到“框架”区中，该框架区定向HVR或CDR，使得实现CDR的适当的抗原结合特性。对于一些抗原结合蛋白，支架是来自抗体或其片段的免疫球蛋白重链和/或轻链。支架的其他实例包括但不限于人纤连蛋白(例如，人纤连蛋白III的第10细胞外结构域)、新制癌菌素CBM4-2、源自脂质运载蛋白的抗促成素、设计的锚蛋白重复结构域(DARPin)、蛋白-A结构域(蛋白Z)、Kunitz结构域、Im9、TPR蛋白、锌指结构域、pVIII、GC4、转铁蛋白、SPA的B结构域、Sac7d、A-结构域，Fyn激酶的SH3结构域和C型凝集素样结构域(参见例如Gebauer和Skerra(2009)Curr.Opin.Chem.Biol.,13:245-255；Binz等人(2005)Nat.Biotech.23:1257-1268；及Yu等人(2017)Annu Rev Anal Chem 10:293-320，这些文献中的每一个通过引用全文并入本文)。因此，抗原结合蛋白包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、微型体、结构域抗体诸如

如本文所用，抗原结合蛋白(例如，抗体)的“抗原结合片段”(或简称为“片段”)或“抗原结合结构域”是指抗原结合蛋白(例如，抗体)的一个或多个片段，不管是如何获得或合成的，其保留特异性结合由整个抗原结合蛋白结合的抗原的能力。抗体片段的实例包括但不限于Fv；Fab；Fab'；Fab'-SH；F(ab')

术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，指氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。此类氨基酸残基的聚合物可以含有天然或非天然氨基酸残基，并且包括但不限于氨基酸残基的二聚体、三聚体、肽、寡肽和多聚体。该定义涵盖全长蛋白质及其片段。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。术语“多肽”还指包括对天然序列的修饰，诸如缺失、添加和取代(通常在性质上是保守的)的蛋白质，只要该蛋白质保持所需的活性。术语“多肽”和“蛋白质”涵盖ALPP和/或ALPPL2抗原结合蛋白，包括抗体、抗体片段或具有抗原结合蛋白的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。

“天然序列”或“天然存在的”多肽包括具有与天然发现的多肽相同的氨基酸序列的多肽。因此，天然序列多肽可以具有来自任何哺乳动物的天然存在的多肽的氨基酸序列。这样的天然序列多肽可以从自然界分离或者可以通过重组或合成手段产生。术语“天然序列”多肽具体涵盖多肽的天然存在的截短形式或分泌形式(例如，胞外结构域序列)、天然存在的变体形式(例如，可变剪接形式)和多肽的天然存在的等位基因变体。

多肽“变体”意指在比对序列并引入间隙(如果需要)以实现最大百分比序列同一性并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分之后，与天然或参考序列多肽具有至少约70％、80％或90％氨基酸序列同一性的生物活性多肽(例如，抗原结合蛋白或抗体)。此类变体包括例如其中在多肽的N-或C-末端添加或缺失一个或多个氨基酸残基的多肽。在一些实施方案中，变体将具有至少约80％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，变体将具有至少约90％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，变体将与天然序列多肽具有至少约95％的氨基酸序列同一性。

如本文所用，关于肽、多肽或抗原结合蛋白(例如，抗体)序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”和“同源性”被定义为在比对序列并引入间隙(如果需要)以实现最大百分比序列同一性并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定百分比氨基酸序列同一性的目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公开可用的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN

100乘以分数X/Y

其中X是在该程序A和B的比对中被序列评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。除非另有具体说明，否则本文使用的所有％氨基酸序列同一性值均使用ALIGN-2计算机程序根据该公式计算。应当理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A与B的％序列同一性将不等于B与A的％序列同一性。

术语“前导序列”是指位于促进多肽从哺乳动物细胞分泌的多肽的N-末端的氨基酸残基序列。前导序列可以在从哺乳动物细胞输出多肽时被切割，形成成熟蛋白质。前导序列可以是天然的或合成的，并且它们可以与它们所连接的蛋白质异源或同源。

术语“免疫球蛋白”是指一类结构相关的糖蛋白，其由两对多肽链，即一对轻(L)低分子量链和一对重(H)链组成，所有四条链通过二硫键相互连接。免疫球蛋白的结构已得到很好的表征。参见例如Fundamental Immunology(Paul,W.编辑,第7版Raven Press,N.Y.(2013))。简单来说，每条重链通常包括重链可变区(本文缩写为V

术语“抗体”以其最广泛的含义使用，并且具体地涵盖例如单克隆抗体(包括全长或完整单克隆抗体)、具有多表位或单表位特异性的抗体、多克隆或单价抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们表现出所需的生物活性)、单链抗体，及前述抗体的片段，如下所述。抗体可以是人的、人源化的、嵌合的和/或亲和力成熟的，以及来自其他物种例如小鼠和兔等的抗体。因此，术语“抗体”包括例如免疫球蛋白类多肽内的B细胞的多肽产物，其能够结合特定的分子抗原并由两对相同的多肽链组成，其中每对具有一条重链(约50-70kDa)和一条轻链(约25kDa)，每条链的每个氨基末端部分包括约100至约130个或更多个氨基酸的可变区，并且每条链的每个羧基末端部分包括恒定区。参见例如

如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中序列高变的每个区域。HVR可以形成结构上限定的环(“高变环”)。通常，天然四链抗体包含六个HVR；VH中有三个(H1、H2、H3)，并且VL中有三个(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3显示出六种HVR中的最大多样性，特别是H3被认为在赋予抗体良好特异性方面起独特作用。参见例如Xu等人,Immunity 13:37-45(2000)；Johnson和Wu,Methods in Molecular Biology 248:1 -25(Lo编辑,Human Press,Totowa,NJ,2003)。实际上，仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在不存在轻链的情况下是功能性且稳定的。参见例如Hamers-Casterman等人,Nature 363:446-448(1993)；Sheriff等人,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。

HVR通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，CDR具有最高的序列变异性和/或参与抗原识别。用于定义给定CDR的边界的多种方案是本领域已知的。例如，kabat互补决定区(CDR)基于序列变异性，并且是最常用的(Kabat等人,Sequencesof Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。Chothia代之以指结构环的位置(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM CDR代表Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷方案，并由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。“contact”CDR是基于对可用的复杂晶体结构的分析。以下参考文献中提供了关于前述方案以及其他编号规则的其他详细信息：Al-Lazikani等人,(1997)J.Mol.Biol.273:927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,(1996)J.Mol.Biol.262:732-745(1996),(“Contact”编号方案)；LefrancM-P.等人,(2003)Dev.Comp.Immunol.27:55-77(“IMGT”编号方案)；及Honegger A.和Pluckthun A.(2001)J.Mol/Biol.309:657-70,(AHo编号方案)。

在一些实施方案中，HVR区和相关序列与基于前述编号规则之一的CDR区和相关序列相同。因此，示例性HVR和/或CDR的残基总结于下表1中。

表1：不同CDR编号方案的总结

在一些实施方案中，HVR可以包含如下的延长的HVR：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)和VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变结构域残基根据Kabat等人(同上)编号。

除非另有说明，否则术语给定抗体或其区域(诸如可变区)的“CDR”和“互补决定区”以及抗体或其区域的各个CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2)应理解为涵盖如上文所述的任何已知方案所定义的互补决定区。在一些情况下，指定用于鉴定一个或多个特定CDR的方案，诸如通过IMGT、Kabat、AbM、Chothia或Contact方法定义的CDR。在其他情况下，给出了CDR的特定氨基酸序列。

因此，在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含如IMGT系统所定义的CDR和/或HVR。在其他实施方案中，抗原结合蛋白包含如Kabat系统所定义的CDR或HVR。在其他实施方案中，抗原结合蛋白包含如AbM系统所定义的CDR或HVR。在其他实施方案中，抗原结合蛋白包含如Chothia系统所定义的CDR或HVR。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含如图5至图8中所鉴定的或如本文其他地方所阐述的HVR和/或CDR残基。

术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗原结合蛋白(例如，抗体)与抗原结合的抗原结合蛋白(例如，抗体)重链或轻链的结构域。抗原结合蛋白诸如抗体的重链和轻链(分别为VH和VL)的可变区或结构域可以进一步细分为高变区(或高变区，其在序列和/或结构限定的环的形式上可以是高变的)，诸如高变区(HVR)或互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。通常，每个重链可变区中有三个HVR(HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3)或CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且每个轻链可变区中有三个HVR(HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3)或CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。“框架区”和“FR”是本领域已知的，指重链和轻链可变区的非HVR或非CDR部分。通常，每个全长重链可变区中有四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，并且每个全长轻链可变区中有四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。在每个VH和VL内，三个HVR或CDR和四个FR通常按以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：在HVR的情况下为FR1、HVR1、FR2、HVR2、FR3、HVR3、FR4，或在CDRs的情况下为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(也参见Chothia和Lesk J.Mot.Biol.,195,901-917(1987))。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。另外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。

如本文所用，术语“重链可变区”(VH)是指包含重链HVR-H1、FR-H2、HVR-H2、FR-H3和HVR-H3的区域。例如，重链可变区可以包含重链CDR-H1、FR-H2、CDR-H2、FR-H3和CDR-H3。在一些实施方案中，重链可变区还包含FR-H1的至少一部分和/或FR-H4的至少一部分。

如本文所用，术语“重链恒定区”是指包含至少三个重链恒定结构域C

如本文所用，术语“重链”(HC)是指包含至少一个重链可变区、具有或不具有前导序列的多肽。在一些实施方案中，重链包含重链恒定区的至少一部分。如本文所用，术语“全长重链”是指包含重链可变区和重链恒定区、具有或不具有前导序列的多肽。

如本文所用，术语“轻链可变区”(VL)是指包含轻链HVR-L1、FR-L2、HVR-L2、FR-L3和HVR-L3的区域。在一些实施方案中，轻链可变区包含轻链CDR-L1、FR-L2、CDR-L2、FR-L3和CDR-L3。在一些实施方案中，轻链可变区还包含FR-L1和/或FR-L4。

如本文所用，术语“轻链恒定区”是指包含轻链恒定结构域C

如本文所用，术语“轻链”(LC)是指包含至少一个轻链可变区、具有或不具有前导序列的多肽。在一些实施方案中，轻链包含轻链恒定区的至少一部分。如本文所用，术语“全长轻链”是指包含轻链可变区和轻链恒定区、具有或不具有前导序列的多肽。

当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如，Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991中报告的EU索引)。“Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。除非本文另有说明，否则提及抗体恒定结构域中的残基编号是指通过EU编号系统进行的残基编号。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即包含该群体的各个抗体除了可以微量存在的可能的天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体针对单一抗原位点具有高度特异性。与可以包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。

如本文所用，“双特异性”抗体是指对至少两种不同抗原表位具有结合特异性的抗体。在一个实施方案中，表位来自相同的抗原。在另一个实施方案中，表位来自两种不同的抗原。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。例如，可以使用两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达重组产生双特异性抗体。参见例如Milstein等人,Nature305:537-39(1983)。替代性地，可以使用化学连接制备双特异性抗体。参见例如Brennan等人,Science 229:81(1985)。双特异性抗体包括双特异性抗体片段。参见例如Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6444-48(1993)、Gruber等人,J.Immunol.152:5368(1994)。

“双可变结构域免疫球蛋白”或“DVD-Ig”是指如例如在DiGiammarino等人,Methods Mol.Biol.899:145-156,2012、Jakob等人,MABs 5:358-363,2013及美国专利号7,612,181、8,258,268、8,586,714、8,716,450、8,722,855、8,735,546和8,822,645中描述的多价和多特异性结合蛋白，这些文献中的每一个通过引用全文并入。

“双亲和力再靶向蛋白”或“DART”是双特异性抗体的形式，其中一种抗体的重可变结构域与另一种抗体的轻可变结构域连接，并且两条链缔合，并且描述于例如Garber,Nature Reviews Drug Discovery13:799-801,2014中。

“双特异性T细胞接合体”或

如本文所用，“嵌合抗体”是指其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同来源或物种的抗体。在一些实施方案中，嵌合抗体是指包含来自第一物种(诸如小鼠、大鼠、食蟹猴等)的至少一个可变区和来自第二物种(诸如人、食蟹猴等)的至少一个恒定区的抗体。在一些实施方案中，嵌合抗体包含至少一个小鼠可变区和至少一个人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体包含至少一个食蟹猴可变区和至少一个人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体的所有可变区来自第一物种，并且嵌合抗体的所有恒定区来自第二物种。

如本文所用，术语“人源化抗体”是指基因工程化的非人抗体，其包含人抗体恒定结构域和被修饰成包含与人可变结构域的高水平的序列同源性的非人可变结构域。这可以通过将六个非人抗体互补决定区(CDR)移植到同源人受体框架区(FR)上来实现(参见WO92/22653和EP0629240)。为了完全重构亲本抗体的结合亲和力和特异性，可需要将来自亲本抗体(即，非人抗体)的框架残基取代为人框架区(回复突变)。结构同源性建模可有助于鉴定框架区中对抗体的结合特性来说重要的氨基酸残基。因此，人源化抗体可包含非人CDR序列，主要是人框架区，任选地包含对非人氨基酸序列的一个或多个氨基酸回复突变；及完全人恒定区。任选地，可应用另外的氨基酸修饰，不一定是回复突变，以获得具有优选特征诸如亲和力和生化特性的人源化抗体。

如本文所用，“人抗体”是指在人中产生的抗体、在包含人免疫球蛋白基因的非人动物中产生的抗体，诸如

用于本文目的的“受体人框架”是包含来源于如下所定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架。源自人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或其可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目为10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小或2或更小。在一些实施方案中，VL受体人框架序列与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。

“亲和力成熟的”抗体是指与不具有此类改变的亲本抗体相比，在一个或多个高变区(HVR)中具有一种或多种改变的抗体，此类改变导致抗体对抗原的亲和力的改善。在一些实例中，亲和力成熟的抗体是指与不具有此类改变的亲本抗体相比，在一个或多个互补决定区(CDR)中具有一种或多种改变的抗体，此类改变导致抗体对抗原的亲和力的改善。

术语“衍生物”是指包括除氨基酸(或核酸)的插入、缺失或取代之外的化学修饰的分子(例如，抗原结合蛋白，诸如抗体或其片段)。在某些实施方案中，衍生物包含共价修饰，包括但不限于与聚合物、脂质或其他有机或无机部分的化学键合。在某些实施方案中，特定抗原结合蛋白的衍生物可具有比未经化学修饰的抗原结合蛋白更长的循环半衰期。在某些实施方案中，衍生物可具有改善的针对所需细胞、组织和/或器官的靶向能力。在一些实施方案中，抗原结合蛋白的衍生物被共价修饰以包括一种或多种聚合物，包括但不限于单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、纤维素或其他基于碳水化合物的聚合物、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)和聚乙烯醇，以及此类聚合物的混合物。参见例如美国专利号4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192和4,179,337。

如本文所用，术语“表位”是指抗原(例如，ALPP或ALPPL2)上靶向该抗原的抗原结合蛋白(例如，抗体或其片段)所结合的位点。表位通常由分子诸如氨基酸、多肽、糖侧链、磷酰基或磺酰基的化学活性表面基团组成，并具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以由通过三级折叠并置的抗原的连续或不连续氨基酸形成。由连续残基形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。在某些实施方案中，表位可以包括但不限于独特空间排列的至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个氨基酸。在一些实施方案中，表位是指独特空间构象中的3-5、4-6或8-10个氨基酸。在其他实施方案中，表位的长度少于20个氨基酸、少于15个氨基酸或少于12个氨基酸、少于10个氨基酸或少于8个氨基酸。在一个实施方案中，本发明的抗ALPP/ALPPL2抗体的表位包含SEQ ID NO:73和/或SEQ ID NO:74。表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其他氨基酸残基，包括被抗原结合分子有效阻断或覆盖的氨基酸残基(即，氨基酸在抗原结合分子的足迹内)。确定表位的空间构象的方法包括例如x射线晶体学、二维核磁共振和HDX-MS(参见例如Methods inMolecular Biology中的Epitope Mapping Protocols,第66卷,G.E.Morris编辑(1996))。一旦确定了抗原的所需表位，就可以使用已建立的技术产生针对该表位的抗原结合蛋白(例如，抗体或其片段)。然后可以在竞争测定中筛选所得抗原结合蛋白以鉴定结合相同或重叠表位的抗原结合蛋白。基于交叉竞争研究对抗体进行分类的方法在WO 03/48731中进行了描述。

“非线性表位”或“构象表位”包含抗原蛋白内的不连续多肽、氨基酸和/或糖，对该表位具有特异性的抗体与所述不连续多肽、氨基酸和/或糖结合。

“线性表位”包含抗原蛋白内的连续多肽、氨基酸和/或糖，对该表位具有特异性的抗原结合蛋白(例如，抗体或其片段)与所述连续多肽，氨基酸和/或糖结合。

当在竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如，抗体或其片段)的背景中使用时，术语“竞争”意指抗原结合蛋白之间的竞争，如通过其中所测试的抗原结合蛋白(例如，抗体或其片段)(例如，测试抗体)阻止或抑制(部分或完全)参考抗原结合蛋白(例如，参考抗体)与共同抗原(例如，ALPP或ALPPL2或其片段)的特异性结合的测定所确定的。多种类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一种竞争，包括各种无标记生物传感器方法，诸如表面等离子体共振(SPR)分析(参见例如Abdiche等人,2009,Anal.Biochem.386:172-180；Abdiche等人,2012,J.Immunol Methods 382:101-116；及Abdiche等人,2014PLoSOne 9:e92451)。可以使用的其他测定包括：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等人,1983,Methods inEnzymology 9:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见例如Kirkland等人,1986,J.Immunol.137:3614-3619)固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如Harlow和Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见例如Morel等人,1988,Mol.Immunol.25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见例如Cheung等人,1990,Virology 176:546-552)；直接标记RIA (Moldenhauer等人,1990,Scand.J.Immunol.32:77-82)。通常，测试抗原结合蛋白过量存在(例如，至少2x、5x、10x、20x或100x)。通常，当竞争性抗原结合蛋白过量存在时，它将抑制参照抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。在其中每种抗原结合蛋白(例如，抗体或其片段)可检测地抑制另一抗原结合蛋白与其同源表位的结合的情况下，无论是相同、更大还是更小的程度，抗原结合蛋白被称为彼此“交叉竞争”以结合其相应表位或彼此“交叉阻断”。通常，此类交叉竞争研究使用上述用于竞争研究的条件和方法进行，并且每种方式的阻断程度为至少30％、至少40％或至少50％。用于鉴定竞争性抗原结合蛋白的其他方法和方法的详细信息在本文的实施例中进行了描述。

“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如，抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。分子X对其伴侣Y的亲和力通常可用解离常数(K

“亲和力成熟的”抗体是指与不具有此类改变的亲本抗体相比，在一个或多个高变区(HVR)中具有一种或多种改变的抗体，此类改变导致抗体对抗原的亲和力的改善。在一些实例中，亲和力成熟的抗体是指与不具有此类改变的亲本抗体相比，在一个或多个互补决定区(CDR)中具有一种或多种改变的抗体，此类改变导致抗体对抗原的亲和力的改善。

如本文所用，术语“特异性结合”、“结合”或简单地“结合”或在抗原结合蛋白与其靶抗原结合的背景中的其他相关术语意指抗原结合蛋白基本上表现出与非靶分子的背景结合。然而，特异性结合靶抗原(例如，ALPP和/或ALPPL2)的抗原结合蛋白可能与来自不同物种的ALPP和/或ALPPL2蛋白交叉反应。通常，当解离常数(K

本文所用的术语“K

“抗体-药物-缀合物”或简称“ADC”是指与细胞毒性剂或细胞生长抑制剂缀合的抗体。抗体-药物-缀合物通常结合细胞表面上的靶抗原(例如，ALPP和/或ALPPL2)结合，随后将抗体-药物-缀合物内化到细胞中，在细胞中释放药物。

缩写“vc”和“val-cit”是指二肽缬氨酸-瓜氨酸。

缩写LAE是指三肽接头亮氨酸-丙氨酸-谷氨酸。缩写dLAE是指三肽接头D-亮氨酸-丙氨酸-谷氨酸，其中三肽接头中的亮氨酸处于D-构型。

缩写VKG是指三肽接头缬氨酸-赖氨酸-甘氨酸。

缩写“PABC”是指自消耗性间隔基：

缩写“mc”是指延伸马来酰亚胺己酰基：

缩写“mp”是指延伸马来酰亚胺丙酰基：

如本文所用，“PEG单元”是包括重复的亚乙基-氧基亚单元(PEG或PEG亚单元)的有机部分，并且可以是多分散的、单分散的或离散的(即，具有离散数量的亚乙基-氧基亚单元)。多分散PEG是大小和分子量的异质混合物，而单分散PEG通常从异质混合物中纯化，因此提供单一链长度和分子量。优选的PEG单元包括离散的PEG、以逐步方式而不是通过聚合过程合成的化合物。离散的PEG提供具有限定和指定链长的单个分子。

本文提供的PEG单元包含一个或多个聚乙二醇链，每个聚乙二醇链包括一个或多个彼此共价连接的乙烯氧基亚单元。聚乙二醇链可以例如以直链、支链或星形构型连接在一起。通常，在掺入喜树碱缀合物之前，至少一条聚乙二醇链在一端用被亲电基团取代的烷基部分衍生化，以共价连接至亚甲基氨基甲酸酯单元的氨基甲酸酯氮(即，代表R的实例)。通常，不参与与接头单元的其余部分共价连接的每个聚乙二醇链中的末端亚乙基氧基亚单元用PEG封端单元(通常是任选取代的烷基，诸如-CH

“细胞毒性作用”是指消耗、消除和/或杀伤靶细胞。

“细胞毒性剂”是指对细胞具有细胞毒性作用的剂。

“细胞生长抑制作用”是指抑制细胞增殖。

“细胞生长抑制剂”是指对细胞具有细胞生长抑制作用，从而抑制特定细胞亚群的生长和/或扩增的剂。细胞生长抑制剂可以与抗体缀合或与抗体组合施用。

本文中的术语“Fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的C-末端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C-末端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991中描述的。

“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的“效应功能”。示例性“效应子功能”包括Fc受体结合；C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)等的下调。此类效应子功能通常需要Fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合，并且可以使用各种测定来评估。

“天然序列Fc区”包含与天然存在的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)、天然序列人IgG2 Fc区、天然序列人IgG3 Fc区和天然序列人IgG4 Fc区以及它们的天然存在的变体。

“变体Fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列。

“Fc受体”或“FcR”描述与抗体的Fc区结合的受体。在一些实施方案中，FcγR是天然人FcR。在一些实施方案中，FcR是结合IgG抗体(γ受体)并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体(包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式)的FcR。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，主要区别在于其细胞质结构域。激活受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见例如Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR在例如Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)、Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994)和de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中进行了综述。本文中的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括将来要鉴定的那些。术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))并调节免疫球蛋白的稳态。测量与FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie和Ward.,Immunol.Today 18(12):592-598(1997)；Ghetie等人,NatureBiotechnology,15(7):637-640(1997)；Hinton等人,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216(2004)；WO 2004/92219(Hinton等人)。

“效应子功能”是指可归因于抗体Fc区的生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；及B细胞激活。此类功能可通过例如Fc效应结构域与具有吞噬或裂解活性的免疫细胞上的Fc受体的结合或通过Fc效应结构域与补体系统的组分的结合来影响。通常，由Fc结合细胞或补体组分介导的作用导致CD33靶向细胞的抑制和/或耗竭。抗体的Fc区可以募集表达Fc受体(FcR)的细胞并将它们与抗体包被的靶细胞并置。表达包括FcγRIII(CD16)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD64)的IgG的表面FcR的细胞可以作为破坏IgG包被细胞的效应细胞。此类效应细胞包括单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。IgG对FcγR的结合会激活抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。ADCC由CD16

“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。在某些实施方案中，细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可以从天然来源分离，例如从血液分离。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指与靶细胞的细胞表面上的抗原结合的抗体的Fc区与某些细胞毒性效应细胞(例如NK细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)相互作用的细胞毒性机制。这种相互作用使得这些细胞毒性效应细胞能够随后用细胞毒素杀伤靶细胞。介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)第464页的表3中进行了总结。为了评价目标分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，诸如美国专利号5,500,362或5,821,337或美国专利号6,737,056(Presta)中描述的测定。用于此类测定的有用效应细胞包括PBMC和NK细胞。目标分子的ADCC活性也可以在体内评估，例如在动物模型中，诸如Clynes等人Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95:652-656(1998)中公开的动物模型。具有改变的Fc区氨基酸序列(具有变体Fc区的多肽)和增加或降低的ADCC活性的另外的多肽变体在例如美国专利号7,923,538和美国专利号7,994,290中进行了描述。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的激活是通过补体系统的第一组分(C1q)与(适当亚类的)抗体的Fc区结合而启动的，这些抗体与靶细胞上它们的同源抗原结合。这种结合激活一系列酶促反应，最终在靶细胞膜上形成孔并随后导致细胞死亡。补体的激活还可能导致补体组分沉积在靶细胞表面上，其通过结合白细胞上的补体受体(例如，CR3)促进ADCC。为了评估补体激活，可以进行CDC测定，例如如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所描述的。具有改变的Fc区氨基酸序列(多肽诸如具有变体Fc区的抗体)和增加或降低的C1q结合能力的多肽变体在例如美国专利号6,194,551B1、美国专利号7,923,538、美国专利号7,994,290和WO1999/51642中进行了描述。还参见例如Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)。

术语“抗体依赖性细胞吞噬作用”，或简称为“ADCP”，是指抗体包被的细胞全部或部分被结合Ig的Fc区的吞噬免疫细胞(例如，巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突状细胞)内化的过程。

具有“改变的”FcR结合亲和力或ADCC活性的多肽变体(例如，抗体)是与亲本多肽或与包含天然序列Fc区的多肽相比具有增强的或减弱的FcR结合活性和/或ADCC活性的多肽变体。“显示出与FcR的结合增加”的多肽变体以比亲本多肽更好的亲和力结合至少一种FcR。“显示出与FcR的结合降低”的多肽变体以比亲本多肽更低的亲和力结合至少一种FcR。在一些实施方案中，与天然序列IgG Fc区相比，显示出与FcR的结合降低的此类变体可以具有很少或不具有明显的与FcR的结合，例如与FcR的结合为0-20％。

术语“核酸分子”、“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合物。此类核苷酸聚合物可以含有天然和/或非天然核苷酸，并且包括但不限于DNA、RNA和PNA。“核酸序列”是指包含核酸分子或多核苷酸的核苷酸的线性序列。

术语“载体”意指用于将核酸分子转移至宿主细胞中的任何分子或实体(例如，核酸、质粒、噬菌体或病毒)。载体通常包括经工程化以含有编码可在宿主细胞中增殖的一种或多种目标多肽的一种或多种克隆多核苷酸的核酸分子。载体的实例包括但不限于质粒、病毒载体和表达载体，例如重组表达载体。载体可以包括以下要素中的一种或多种：复制起点、调节目标多肽表达的一种或多种调节序列(例如，启动子和/或增强子)和/或一种或多种选择标记基因。该术语包括作为自我复制核酸分子的载体以及掺入其已引入的宿主细胞基因组中的载体。

术语“表达载体”是指适于转化宿主细胞并可用于在宿主细胞中表达目标多肽的载体。

术语“宿主细胞”或“宿主细胞系”在本文中可互换使用，并且是指可以是或已经是载体或分离的多核苷酸的受体的细胞或细胞群。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。示例性真核细胞包括哺乳动物细胞，诸如灵长类或非灵长类动物细胞；真菌细胞，诸如酵母；植物细胞；及昆虫细胞。非限制性示例性哺乳动物细胞包括但不限于NSO细胞、

术语“控制序列”是指可以影响与其连接的编码序列的表达和加工的多核苷酸序列。此类控制序列的性质可以取决于宿主生物体。在具体的实施方案中，原核生物的控制序列可以包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。真核生物的控制序列可以包括例如包含一个或多个转录因子识别位点的启动子、转录增强子序列和转录终止序列。“控制序列”可以包括前导序列和/或融合伴侣序列。

如本文所用，“可操作地连接”是指该术语所应用的组分处于允许它们在合适的条件下执行其固有功能的关系。例如，载体中与蛋白质编码序列“可操作地连接”的控制序列与其连接，使得在与控制序列的转录活性相容的条件下实现蛋白质编码序列的表达。在两个编码序列可操作地连接的情况下，该短语意指两个DNA片段或编码序列被连接，使得由两个片段编码的氨基酸序列保持在框内。

术语“转染”是指细胞摄取外来或外源DNA，并且当外源DNA被引入细胞膜内时细胞已被“转染”。许多转染技术是本领域众所周知的并在本文中公开。参见例如Graham等人,1973,Virology 52:456；Sambrook等人,2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,同上；Davis等人,1986,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier；Chu等人,1981,Gene 13:197。此类技术可用于将一种或多种外源DNA部分引入合适的宿主细胞中。

术语“转化”是指细胞的遗传特征的改变，并且当细胞被修饰为含有新的DNA或RNA时，细胞被转化。例如，通过转染、转导或其他技术引入新的遗传物质，对细胞进行转化，使其从其天然状态被遗传修饰。转染或转导后，转化DNA可以通过物理整合到细胞的染色体中而与细胞的DNA重组，或者可以作为游离元件暂时维持而不被复制，或者可以作为质粒独立复制。当转化DNA随细胞的分裂而复制时，认为细胞已被“稳定转化”。

如本文所用，术语“分离的”是指已与通常在自然界中发现或产生的至少一些组分分离的分子。例如，当多肽与产生它的细胞的至少一些组分分离时，它被称为“分离的”。当多肽在表达后由细胞分泌时，将含有多肽的上清液从产生多肽的细胞中物理分离被认为是“分离”多肽。类似地，当多核苷酸不是通常在自然界中发现的较大多核苷酸(例如，在DNA多核苷酸的情况下，基因组DNA或线粒体DNA)的一部分时，或者与产生多核苷酸的细胞的至少一些组分分离(例如，在RNA多核苷酸的情况下)时，该多核苷酸被称为“分离的”。因此，包含在宿主细胞内的载体中的DNA多核苷酸可以被称为“分离的”。

术语“个体”、“受试者”或患者在本文中可互换使用，是指动物，例如哺乳动物。在一些实施方案中，提供了治疗哺乳动物的方法，所述哺乳动物包括但不限于人、啮齿动物、猿类、猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物、猪科动物、绵羊科动物、山羊科动物、哺乳动物实验动物、哺乳动物农场动物、哺乳动物运动动物和哺乳动物宠物。在一些情况下，“个体”或“受试者”是人。在一些实例中，“个体”或“受试者”是指需要治疗疾病或病症的个体或受试者(例如，人)。

如本文所用，“疾病”或“病症”是指需要治疗的疾患。

如本文所用，“癌症”和“肿瘤”是指动物中任何异常的细胞或组织生长或增殖的可互换术语。如本文所用，术语“癌症”和“肿瘤”涵盖实体癌和血液/淋巴癌，并且还涵盖恶性、恶变前和良性生长，诸如发育异常。实体瘤是通常不含囊肿或液体区域的组织的异常生长或肿块。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体的非限制性实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、垂体癌、食道癌、星形细胞瘤、软组织肉瘤、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer)、肾癌(renal cancer)、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、脑癌、子宫内膜癌、睾丸癌、胆管癌、胆囊癌、胃癌、黑素瘤及多种类型的头颈癌。

“肿瘤负荷”也称为“肿瘤负载”，是指遍及身体分布的肿瘤物质的总量。肿瘤负荷是指遍及身体(包括淋巴结和骨狭窄)中癌细胞的总数或肿瘤的总大小。肿瘤负荷可以通过本领域已知的多种方法来确定，例如通过在从受试者中取出时测量肿瘤的尺寸，例如使用卡尺，或者在体内时使用成像技术，例如超声、骨扫描、计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)扫描。

术语“转移性癌症”和“转移性疾病”意指已经从起源部位扩散到身体的另一部分，例如扩散到区域淋巴结或扩散到远处部位的癌症。

术语“晚期癌症”、“局部晚期癌症”、“晚期疾病”和“局部晚期疾病”是指已经延伸穿过相关组织被膜的癌症。通常不建议对患有局部晚期疾病的患者进行手术，并且与患有临床局限性(器官限制性)癌症的患者相比，这些患者具有显著较差的结果。

如本文所用，“治疗”是用于获得有益的或期望的临床结果的方法。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物(包括人)的疾病的治疗剂的任何施用或应用。有益的或期望的临床结果包括但不限于以下中的任何一种或多种：减轻一种或多种症状、减轻疾病的程度、预防或延迟疾病的扩散(例如，转移，例如转移至肺或淋巴结)、预防或延迟疾病的复发、延迟或减缓疾病进展、改善疾病状态、抑制疾病或疾病的进展、抑制或减缓疾病或其进展、阻止其发展和缓解(无论是部分还是全部)。“治疗”还包括减少增殖性疾病的病理后果。

在癌症的背景中，术语“治疗”包括以下任一项或全部：抑制癌细胞的生长、抑制癌细胞的复制、减少癌细胞的数目、降低癌细胞浸润到周围器官中的速率、降低肿瘤转移的速率或程度、减轻总体肿瘤负荷，及改善与癌症相关的一种或多种症状。

在自身免疫疾病的背景中，术语“治疗”包括以下任一项或全部：预防与自身免疫疾病状态相关的细胞(包括但不限于能够产生自身免疫抗体的细胞)的复制、减轻自身免疫抗体负担及改善自身免疫疾病的一种或多种症状。

在传染病的背景中，术语“治疗”包括预防引起传染病的病原体的生长、增殖或复制和改善传染病的一种或多种症状中的任一种或全部。

术语“抑制”是指任何表型特征的降低或停止，或者指该特征的发生率、程度或可能性的降低或停止。“减少”或“抑制”是指与参考相比降低、减少或阻止活性、功能和/或量。在某些实施方案中，“减少”或“抑制”是指引起20％或更大的总体降低的能力。在另一个实施方案中，“减少”或“抑制”是指引起50％或更大的总体降低的能力。在又一个实施方案中，“减少”或“抑制”是指引起75％、85％、90％、95％或更大的总体降低的能力。

如本文所用，“参考”是指用于比较目的的任何样品、标准品或水平。可以从健康和/或未患病的样品获得参考。在一些实例中，可以从未治疗的样品获得参考。在一些实例中，从受试者个体的未患病的或未治疗的样品获得参考。在一些实例中，从不是受试者或患者的一个或多个健康个体获得参考。

如本文所用，“延迟疾病的发展”意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定、抑制和/或推迟疾病(诸如癌症)的发展。这种延迟可以具有不同的时间长度，这取决于疾病史和/或接受治疗的个体。如本领域技术人员显而易见的，充分或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不发展疾病。例如，可以延迟晚期癌症，诸如转移的发展。

如本文所用，“预防”包括提供关于受试者中疾病的发生或复发的预防，该受试者可能易患该疾病但尚未被诊断患有该疾病。

如本文所用，“抑制”功能或活性是指当与除了感兴趣的条件或参数之外的其他相同条件相比时，或者替代性地，与另一种条件相比，降低该功能或活性。例如，与不存在抗体时肿瘤的生长速率相比，抑制肿瘤生长的抗体降低肿瘤的生长速率。

药物或治疗剂的“有效量”或“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时提供治疗效果的药物或剂的任何量，诸如保护受试者免于疾病的发作或促进疾病消退，如通过疾病症状的严重性的降低、无疾病症状期的频率和持续时间的增加、或预防由于疾病折磨引起的损伤或残疾所证明的。可以使用技术人员已知的多种方法评估治疗剂促进疾病消退的能力，诸如在临床试验期间在人受试者中、在预测在人体中的功效的动物模型系统中，或通过在体外测定中测定剂的活性。

举例来说，对于肿瘤的治疗，在一些实施方案中，相对于未治疗的受试者(例如，一个或多个未治疗的受试者)，治疗有效量的抗癌剂在治疗的受试者(例如，一个或多个治疗的受试者)中抑制细胞生长或肿瘤生长至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、或至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％，或至少约99％。在一些实施方案中，相对于未治疗受试者(例如，一个或多个未治疗受试者)，治疗有效量的抗癌剂在经治疗受试者(例如，一个或多个经治疗受试者)中抑制细胞生长或肿瘤生长达100％。在本公开的其他实施方案中，可以观察到肿瘤消退并持续至少约20天、至少约30天、至少约40天、至少约50天、或至少约60天的时间段。

药物的治疗有效量包括“预防有效量”，其为当单独或与抗癌剂组合向处于发展癌症风险的受试者(例如，具有癌前病症的受试者)或遭受癌症复发的受试者施用时抑制癌症的发展或复发的药物的任何量。在一些实施方案中，预防有效量完全防止癌症的发展或复发。“抑制”癌症的发展或复发意味着减少癌症发展或复发的可能性，或者完全防止癌症的发展或复发。

如本文所用，“亚治疗剂量”意指低于当单独施用用于治疗过度增殖性疾病(例如，癌症)时治疗化合物的常用或典型剂量的治疗化合物的剂量。

“施用”是指使用本领域技术人员已知的多种方法和递送系统中的任一种将治疗剂物理引入受试者。示例性施用途径包括静脉内、肌内、皮下、腹膜内、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注(例如，静脉内输注)。也可以例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时间段内进行施用。

如本文所用，术语“单一疗法”意指本发明的抗ALPP/ALPPL2抗体或ADC是在治疗周期期间向受试者施用的唯一抗癌剂。然而，可以向受试者施用其他治疗剂。例如，向患有癌症的受试者施用以治疗与癌症相关的症状，但不治疗潜在的癌症本身，包括例如炎症、疼痛、体重减轻和全身不适的抗炎剂或其他剂可以在单一疗法期的过程中施用。

“与一种或多种其他治疗剂组合”施用包括以任何顺序同时(并行)和连续或依次施用。

术语“同时”在本文中用于指两种或更多种治疗剂的施用，其中施用的至少一部分在时间上重叠或者其中一种治疗剂的施用相对于另一种治疗剂的施用落在较短的时间段内。例如，两种或更多种治疗剂同时施用或以不超过约60分钟的时间间隔施用，诸如不超过约30、15、10、5或1分钟中的任一个。

术语“依次”在本文中用于指两种或更多种治疗剂的施用，其中一种或多种剂的施用在停止施用一种或多种其他剂之后继续。例如，两种或更多种治疗剂的施用以超过约15分钟的时间间隔施用，诸如约20、30、40、50或60分钟、1天、2天、3天、1周、2周或1个月或更长时间中的任一个。

术语“化疗剂”是指有效抑制肿瘤生长的所有化合物。化疗剂的非限制性实例包括烷化剂(例如，氮芥、乙烯亚胺化合物和烷基磺酸盐)；抗代谢物(例如，叶酸、嘌呤或嘧啶拮抗剂)；有丝分裂抑制剂(例如，抗微管蛋白剂诸如长春花生物碱、奥瑞他汀(auristatin)和鬼臼毒素的衍生物)；细胞毒性抗生素；损害或干扰DNA表达或复制的化合物(例如，DNA小沟结合物)；及生长因子受体拮抗剂和细胞毒性剂或细胞生长抑制剂。

短语“药学上可接受的”表示物质或组合物在化学上和/或毒理学上与构成制剂的其他成分和/或用其治疗的受试者是相容的。

术语“药物制剂”和“药物组合物”是指这样的制剂，其以允许活性成分的生物活性有效的形式存在，并且其不含对将施用制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。此类制剂可以是无菌的。

“药学上可接受的载剂”是指本领域中常规的与治疗剂一起使用的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料、制剂助剂或载剂，它们一起构成用于向受试者施用的“药物组合物”。药学上可接受的载剂在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且与制剂的其他成分相容。药学上可接受的载剂适合于所采用的制剂。

如本文所用的短语“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的药学上可接受的有机盐或无机盐。示例性盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、单宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐(glucaronate)、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲烷磺酸盐“甲磺酸盐”、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、双羟萘酸盐(即，4,4’-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))、碱金属(例如，钠和钾)盐、碱土金属(例如，镁)盐及铵盐。药学上可接受的盐可涉及包含另一分子，诸如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其他抗衡离子。抗衡离子可以是稳定母体化合物上的电荷的任何有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐在其结构中可具有多于一个带电原子。多个带电原子是药学上可接受的盐的一部分的情况可以具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可以具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。

在以下部分中更详细地描述本公开的各个方面。

II.综述

本发明提供了抗体-药物缀合物，包括与vcMMAE(在本文中有时称为mc-vc-PABC-MMAE或mc-vc-MMAE)或dLAE-MMAE(在本文中有时称为mp-dLAE-PABC-MMAE或mp-dLAE-MMAE)缀合的抗ALPP抗体，其对杀伤表达ALPP+的细胞特别有效。本发明还提供了抗体-药物缀合物，包括与vcMMAE或dLAE-MMAE缀合的抗ALPPL2抗体，其对杀伤表达ALPPL2+的细胞特别有效。在优选的实施方案中，本发明提供了结合与vcMMAE或dLAE-MMAE缀合的ALPP和ALPPL2两者的抗体(抗ALPP/ALPPL2抗体)，其对杀伤表达ALPP+和ALPPL2+两者的细胞特别有效。ALPP和ALPPL2均已被证明在多种癌症中表达，包括卵巢癌、肺癌、子宫内膜癌、睾丸癌和胃癌。

本文提供了结合ALPP/ALPPL2的抗原结合蛋白(ABP)，包括其抗原结合片段(例如，抗体及其抗原结合片段)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白和片段含有特异性结合ALPP(包括人ALPP)的抗原结合结构域(例如，SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白和片段含有特异性结合ALPPL2(包括人ALPPL2)的抗原结合结构域(例如，SEQ ID NO:4)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白和片段含有特异性结合ALPP和ALPPL2两者(包括人ALPP(例如，SEQ ID NO:2)和人ALPPL2(例如，SEQ ID NO:4))的抗原结合结构域。

III.抗ALPP/ALPPL2抗原结合蛋白，包括片段

本文提供了多种抗原结合蛋白并在下文中更详细地描述。本文公开的抗原结合蛋白通常包含支架，诸如一种或多种多肽，其中一个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)高变区(HVR)或互补决定区(CDR)被嵌入、移植和/或连接。在一些抗原结合蛋白中，HVR或CDR被嵌入、移植或连接到“框架”区中，该框架区定向HVR或CDR，使得实现HVR或CDR的适当的抗原结合特性。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含一个或多个VH和/或VL结构域。

在一些抗原结合蛋白中，HVR或CDR序列被嵌入、移植或连接到蛋白支架或其他生物相容性聚合物中。在一些实施方案中，抗原结合蛋白是抗体或衍生自抗体。因此，提供的抗原结合蛋白包括但不限于单克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、微型体、结构域抗体、合成抗体(有时在本文中称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合体、抗体缀合物，及前述每一种的部分或片段。本文提供的为片段的抗原结合蛋白的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')

在一些实施方案中，抗原结合蛋白以小于10nM、5nM、2nM、1nM、500pM、250pM、200pM、150pM、130pM、100pM、50pM、25pM、10pM或1pM的亲和力(例如，K

A.示例性抗原结合蛋白，包括片段

在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包括本文实施例中描述的抗体12F3。在一些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包括鼠、嵌合、人源化和/或人12F3抗体。

在一个实施方案中，本文公开的抗原结合蛋白包含分别包含SEQ ID NO:56-58或60-62的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3及分别包含SEQ ID NO:63-65或68-70的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在另一个实施方案中，本文公开的抗原结合蛋白包含分别包含SEQ ID NO:56-58的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3及分别包含SEQ ID NO:63-65的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR由Kabat确定。在另一个实施方案中，本文公开的抗原结合蛋白包含分别包含SEQ ID NO:60-62的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3及分别包含SEQ ID NO:68-70的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR由IMGT确定。

在另一个实施方案中，本文公开的抗原结合蛋白包含：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VL。

在另一个实施方案中，本文公开的抗原结合蛋白包含：包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的HC和包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的LC。

在其他实施方案中，提供的抗原结合蛋白包括或源自下述抗体的CDR、可变重链、可变轻链、重链和/或轻链中的一种或多种。

在另一个实施方案中，ABP包含(a)包含至少一个、至少两个或全部三个VH CDR序列的VH结构域，其中VH CDR序列选自(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:60的CDR-H1；(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:61的CDR-H2；及(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:62的CDR-H3，及(b)包含至少一个、至少两个或全部三个VLCDR序列的VL结构域，其中VL CDR序列选自(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:68的CDR-L1；(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:69的CDR-L2；及(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:70的CDR-L3，条件是在ABP包含多个CDR的实施方案中，每个CDR选自不同的组。

在另一个实施方案中，ABP包含(a)包含至少一个、至少两个或全部三个VH CDR序列的VH结构域，其中VH CDR序列选自(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:56的CDR-H1；(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:57的CDR-H2；及(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:58的CDR-H3，及(b)包含至少一个、至少两个或全部三个VL CDR序列的VL结构域，其中VL CDR序列选自(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:63的CDR-L1；(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:64的CDR-L2；及(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:65的CDR-L3，其中CDR由Kabat确定，并且条件是在ABP包含多个CDR的实施方案中，每个CDR选自不同的组。

在另一个实施方案中，ABP包含(a)包含至少一个、至少两个或全部三个VH CDR序列的VH结构域，其中VH CDR序列选自(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:60的CDR-H1；(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:61的CDR-H2；及(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:62的CDR-H3，及(b)包含至少一个、至少两个或全部三个VL CDR序列的VL结构域，其中VL CDR序列选自(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的CDR-L1；(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:69的CDR-L2；及(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:70的CDR-L3，其中CDR由IMGT确定，并且条件是在ABP包含多个CDR的实施方案中，每个CDR选自不同的组。

在另一个实施方案中，ABP包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:60的CDR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:61的CDR-H2；及(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:62的CDR-H3，(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:63或SEQ IDNO:68的CDR-L1；(e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:69的CDR-L2；及(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:70的CDR-L3。

在另一个实施方案中，ABP包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:56的CDR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:57的CDR-H2；及(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:58的CDR-H3，(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:63的CDR-L1；(e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:64的CDR-L2；及(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:65的CDR-L3；其中CDR由Kabat确定。

在另一个实施方案中，ABP包含(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO:60的CDR-H1；(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO:61的CDR-H2；及(c)包含氨基酸序列SEQ ID NO:62的CDR-H3，(d)包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的CDR-L1；(e)包含氨基酸序列SEQ ID NO:69的CDR-L2；及(f)包含氨基酸序列SEQ ID NO:70的CDR-L3；其中CDR由IMGT确定。

某些ABP包含含有CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH，其中VH的CDR相对于相应的CDR参考序列总共具有至多1、2、3、4或5个氨基酸变化，并且其中CDR-H1参考序列具有氨基酸序列SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:60，CDR-H2参考序列具有氨基酸序列SEQ ID NO:57或SEQ IDNO:61，并且CDR-H3参考序列具有氨基酸序列SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:62。在这样的实施方案中，氨基酸变化通常是插入、缺失和/或取代。在这些实施方案中的一些中，氨基酸变化的总数是1-3；在其他实施方案中，氨基酸变化的总数是1或2。在前述实施方案中的某些中，变化是保守氨基酸取代。

在其他实施方案中，ABP包含含有CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL，其中VL的CDR相对于相应的CDR参考序列总共具有至多1、2、3、4或5个氨基酸变化，并且其中CDR-L1参考序列具有氨基酸序列SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:68，CDR-L2参考序列具有氨基酸序列SEQ IDNO:64或SEQ ID NO:69，并且CDR-L3参考序列具有氨基酸序列SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:70。在这样的实施方案中，氨基酸变化通常是插入、缺失和/或取代。在这些实施方案中的一些中，氨基酸变化的总数是1-3；在其他实施方案中，氨基酸变化的总数是1或2。在前述实施方案中的某些中，变化是保守氨基酸取代。

在另一个实施方案中，ABP包含(a)包含CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的VH，其中VH的CDR相对于相应的CDR参考序列总共具有至多1、2、3、4或5个氨基酸变化，并且其中CDR-H1参考序列具有氨基酸序列SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:60，CDR-H2参考序列具有氨基酸序列SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:61，并且CDR-H3参考序列具有氨基酸序列SEQ ID NO:58或SEQID NO:62，及(b)包含CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的VL，其中VL的CDR相对于相应的CDR参考序列总共具有至多1、2、3、4或5个氨基酸变化，并且其中CDR-L1参考序列具有氨基酸序列SEQID NO:63或SEQ ID NO:68，CDR-L2参考序列具有氨基酸序列SEQ ID NO:64或SEQ ID NO:69，并且CDR-L3参考序列具有氨基酸序列SEQ ID NO:65或SEQ ID NO:70。在这样的实施方案中，氨基酸变化通常是插入、缺失和/或取代。在这些实施方案中的一些中，氨基酸变化的总数是1-3；在其他实施方案中，氨基酸变化的总数是1或2。在前述实施方案中的某些中，变化是保守氨基酸取代。

在另一个实施方案中，ABP包含VH结构域，其中VH结构域序列与选自SEQ ID NO:9-16中的任一个的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，条件是ABP保留结合ALPP和/或ALPPL2的能力。在某些实施方案中，这样的ABP相对于参考序列(即，SEQ ID NO:9-16中的一个)含有取代(例如，保守取代)、插入和/或缺失，条件是这样的ABP保留结合ALPP和/或ALPPL2的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NOs:9-16中的任一个中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，VH序列中的1-5或1-3个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在这些实施方案中的某些中，此类取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即，在FR中)。

在另一个实施方案中，ABP包含VL结构域，其中VL结构域序列与选自SEQ ID NO:22-33中的任一个的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，条件是ABP保留结合ALPP和/或ALPPL2的能力。在某些实施方案中，这样的ABP相对于参考序列(即，SEQ ID NO:22-33中的一个)含有取代(例如，保守取代)、插入和/或缺失，条件是这样的ABP保留结合ALPP和/或ALPPL2的能力。在某些实施方案中，SEQ ID NOs:22-33中的任一个中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在一些实施方案中，VL序列中的1-5或1-3个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。在这些实施方案中的某些中，此类取代、插入或缺失发生在CDR之外的区域中(即，在FR中)。

在另一个实施方案中，ABP包含(a)VH结构域，其中VH结构域序列与选自SEQ IDNO:9-16中的任一个的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；及(b)VL结构域，其中VL结构域序列与选自SEQ IDNO:22-33中的任一个的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，条件是ABP保留结合ALPP和/或ALPPL2的能力。

在另一个实施方案中，ABP包含(a)VH结构域，其中VH结构域序列与氨基酸序列SEQID NO:15具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；及(b)VL结构域，其中VL结构域序列与氨基酸序列SEQ ID NO:30具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，条件是ABP保留结合ALPP和/或ALPPL2的能力。

任何前述实施方案中的抗原结合蛋白可以是任何形式的抗体。因此，任何上述实施方案中描述的抗原结合蛋白可以是例如单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体，及任何上述的ALPP结合片段，诸如单链抗体、Fab片段、F(ab')片段或由Fab表达文库产生的片段。抗体可以是任何免疫球蛋白同种型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。

在某些实施方案中，具有本文所述的CDR和/或可变结构域序列的ABP是抗原结合片段(例如，人抗原结合片段)，并且包括但不限于Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)和包含VL或VH结构域的片段。抗原结合片段，包括单链抗体，可包含单独或与以下的全部或一部分组合的一个或多个可变区：铰链区、CH1、CH2、CH3和CL结构域。本公开还包括抗原结合片段，其包含一个或多个可变区与铰链区、CH1、CH2、CH3和CL结构域的任何组合。

ABP可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的或具有更大的多特异性。多特异性抗体可以对ALPP和/或ALPPL2的不同表位具有特异性，或者可以对ALPP和/或ALPPL2两者以及异源蛋白质具有特异性。参见例如PCT公布WO 93/17715；WO 92/08802；WO 91/00360；WO 92/05793；Tutt等人,1991,J.Immunol.147:60 69；美国专利号4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；及Kostelny等人,1992,J.Immunol.148:1547 1553。

在本文所述的任何实施方案中，在轻链和/或重链的氨基或羧基末端的一个或几个氨基酸(例如，1、2、3或4个)，诸如重链的C-末端赖氨酸，可以在组合物中的一些或全部分子中缺失或衍生化。这种修饰的一个具体实例是重链的羧基末端赖氨酸缺失(例如，作为翻译后修饰的一部分)的ABP。此外，应当理解，本文所述的任何序列包括在细胞培养物(例如，CHO细胞培养物)中ABP表达期间对特定序列的翻译后修饰。

B.嵌合抗原结合蛋白

在某些实施方案中，本文提供的抗原结合蛋白是嵌合抗体。在一些实施方案中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类诸如猴的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体为“类型转换(class switched)”抗体，其中类或亚类已从亲本抗体的类或亚类而改变。某些嵌合抗体在例如美国专利号4,816,567和Morrison等人,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中进行了描述。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

非限制性示例性嵌合抗体包括包含本文所述的任何重链和/或轻链可变区的嵌合抗体。在某些实施方案中，重链和/或轻链可变结构域选自，另外的非限制性示例性嵌合抗体包括包含如本文提供的重链HVR序列(例如，CDR)或其部分和/或轻链HVR序列(例如，CDR)的嵌合抗体。

C.人源化抗原结合蛋白

在某些实施方案中，ABP是结合ALPP和/或ALPPL2的人源化抗体。通常，非人抗体被人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。人源化抗体是基因工程化抗体，其中来自非人“供体”抗体的HVR(例如，CDR)或其部分被移植到人“受体”抗体序列中(参见例如Queen,US 5,530,101和5,585,089；Winter,US 5,225,539；Carter,US 6,407,213；Adair,US 5,859,205；及Foote,US 6,881,557)。

受体抗体序列可以是例如成熟的人抗体序列、此类序列的复合物、人抗体序列的共有序列或种系区序列。可以选择与供体序列在可变区框架中具有高度序列同一性的人受体序列，以匹配受体与供体HVR或CDR之间的规范形式及其他标准。因此，人源化抗体是具有完全或基本上来自供体抗体的HVR或CDR及完全或基本上来自人抗体序列的可变区框架序列和恒定区(如果存在)的抗体。类似地，人源化重链通常具有完全或基本上来自供体抗体重链的全部三个HVR或CDR，及基本上来自人重链可变区框架和恒定区序列的重链可变区框架序列和重链恒定区(如果存在)。同样地，人源化轻链通常具有完全或基本上来自供体抗体轻链的全部三个CDR，及基本上来自人轻链可变区框架和恒定区序列的轻链可变区框架序列和轻链恒定区(如果存在)。当相应的HVR或CDR之间至少80％、85％、90％、95％或100％的相应残基(如Kabat所定义)相同时，人源化抗体中的HVR或CDR基本上来自非人抗体中的相应HVR或CDR。当Kabat定义的至少80％、85％、90％、95％或100％的相应残基相同时，抗体链的可变区框架序列或抗体链的恒定区分别基本上来自人可变区框架序列或人恒定区。

尽管人源化抗体通常掺入来自小鼠抗体的所有六个HVR(例如，CDR，优选地如Kabat所定义)，但它们也可以制备成具有少于来自小鼠抗体的所有HVR或CDR(例如，至少3、4或5个)HVR或CDR(例如，Pascalis等人,J.Immunol.169:3076,2002；Vajdos等人,Journalof Molecular Biology,320:415-428,2002；Iwahashi等人,Mol.Immunol.36:1079-1091,1999；及Tamura等人,Journal of Immunology,164:1432-1441,2000)。

可以基于来自人可变区框架残基的某些氨基酸对HVR(例如，CDR)构象和/或与抗原的结合的可能影响来选择它们用于取代。对这种可能的影响的研究是通过建模、检查特定位置的氨基酸的特征或对特定氨基酸的取代或诱变的影响进行经验观察。

例如，当鼠可变区鼠框架残基与选定的人可变区框架残基之间的氨基酸不同时，人框架氨基酸可以被来自小鼠抗体的等效框架氨基酸取代，此时合理地预期该氨基酸：

(1)非共价地直接结合抗原，

(2)邻近HVR或CDR区，

(3)以其他方式与HVR或CDR区相互作用(例如，在该区域的约

(4)介导重链与轻链之间的相互作用，或

(5)是小鼠链中体细胞突变的结果。

(6)是糖基化位点。

(1)-(3)类的框架残基有时交替地称为规范残基和游标残基。规范残基是指定义决定CDR环的构象的供体CDR环的规范类别的框架残基(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196,901-917(1987)；Thornton和Martin,J.Mol.Biol.,263,800-815,1996)。游标残基是指支持抗原结合环构象并在微调抗体与抗原的配合方面起作用的框架残基层(Foote和Winter,1992,J Mol Bio.224,487-499)。

人源化抗体及其制备方法在例如Almagro和Fransson,(2008)Front.Biosci.13:1619-1633中进行了综述，并且在例如以下文献中进行了进一步描述：Riechmann等人,(1988)Nature 332:323-329；Queen等人,(1989)Proc.Natl Acad.Sci.USA 86:10029-10033；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人,(2005)Methods 36:25-34(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,(1991)Mol.Immunol.28:489-498(描述“重新表面化”)；Dall'Acqua等人,(2005)Methods 36:43-60(描述“FR改组”)；及Osbourn等人,(2005)Methods36:61-68和Klimka等人,(2000)Br.J.Cancer,83:252-260(描述FR改组的“导向选择”方法)。

可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如Sims等人(1993)J.Immunol.151:2296)；源自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285；及Presta等人(1993)J.Immunol,151:2623)；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见例如Almagro和Fransson,(2008)Front.Biosci.13:1619-1633)；及来自筛选FR文库的框架区(参见例如Baca等人,(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684和Rosok等人,(1996)J.Biol.Chem.271:22611-22618)。

非限制性示例性人源化抗体包括包含或源自本文公开的任何CDR和/或重链和/或轻链可变区的人源化抗体。此类抗体的具体实例包括小鼠抗体12F3的人源化形式。小鼠抗体12F3的一种这样的人源化变体被命名为HGLF，其包含：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的成熟重链可变区和包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的成熟轻链可变区。本发明的人源化抗体包括HGLF人源化抗体的变体，其中人源化重链成熟可变区显示出与SEQ ID NO:15至少90％、95％或99％的同一性，并且人源化轻链成熟可变区显示出与SEQ ID NO:30至少90％、95％或99％的序列同一性。优选地，在此类抗体中，保留了HGLF中的一些或全部回复突变。换句话说，重链位置H30、H37、H48、H49、H73、H78和H93中的至少1、2、3、4、5、6个或优选全部7个分别被T、V、L、A、N、L和A占据。同样，轻链位置L2、L38、L49和L69中的至少1、2、3、4个或优选全部4个分别被T、Y、H和R占据。在实施例中更详细地描述了HGLF，并且其具有图5至图8中所示的序列。

D.示例性抗体恒定区

对于其中ABP是抗体的那些实施方案，本文描述的抗体的重链和轻链可变区可以连接至人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人重链恒定区是选自IgA、IgG和IgD的同种型。在一些实施方案中，人轻链恒定区具有选自κ和λ的同种型。在一些实施方案中，本文描述的抗体包含人IgG恒定区。在一些实施方案中，本文描述的抗体包含人IgG4重链恒定区。在这些实施方案中的一些中，本文描述的抗体在人IgG4恒定区中包含S228P突变。在一些实施方案中，本文描述的抗体包含人IgG4恒定区和人κ轻链。

在本说明书和权利要求书中，除非明确说明或本领域技术人员已知，否则免疫球蛋白重链中残基的编号是如Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中的EU索引的编号，该文献通过引用明确地并入本文。“Kabat中的EU索引”是指人IgG1EU抗体的残基编号。

人恒定区在不同个体之间显示出同种异型变异和同族同种异型变异，即恒定区在不同个体中在一个或多个多态性位置上可以不同。同族同种异型与同种异型的不同之处在于，识别同族同种异型的血清与一种或多种其他同种型的非多态性区域结合。提及人恒定区包括具有任何天然同种异型或占据天然同种异型中多态性位置的残基的任何排列的恒定区。此外，相对于天然人恒定区，可以存在多达1、2、5或10个突变，诸如上文指出的那些，以减少Fcγ受体结合或增加与FcRn的结合。

在一些实施方案中，轻链和/或重链的氨基或羧基末端的一个或多个氨基酸，诸如重链的C-末端赖氨酸，可以在部分或全部分子中缺失或衍生化。

恒定区的选择部分取决于是否需要抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、抗体依赖性细胞吞噬作用和/或补体依赖性细胞毒性。例如，人同位素IgG1和IgG3具有强补体依赖性细胞毒性，人同种型IgG2具有弱补体依赖性细胞毒性，而人IgG4缺乏补体依赖性细胞毒性。人IgG1和IgG3也比人IgG2和IgG4诱导更强的细胞介导的效应子功能。轻链恒定区可以是λ或κ。

此外，如下文更详细描述的，可以在恒定区中进行取代以降低或增加效应子功能，诸如补体介导的细胞毒性或ADCC(参见例如Winter等人,美国专利号5,624,821；Tso等人,美国专利号5,834,597；及Lazar等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:4005,2006)，或延长在人中的半衰期(参见例如Hinton等人,J.Biol.Chem.279:6213,2004)。

E.变体

本文提供的抗原结合蛋白还包括本文提供的抗原结合蛋白的氨基酸序列变体。例如，可以制备具有改善的抗体结合亲和力和/或其他生物学性质的变体。抗原结合蛋白的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入编码抗原结合蛋白的核苷酸序列中或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗原结合蛋白的氨基酸序列内残基的缺失和/或插入和/或取代。可进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终的构建体，前体条件是最终的构建体具有所需的特性，例如，抗原结合。

1.取代、插入和缺失变体

在一些实施方案中，抗原结合蛋白是变体，其相对于本文所述的抗原结合蛋白具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。在某些这样的实施方案中，变体具有一个或多个氨基酸取代。在其他这样的实施方案中，取代是保守氨基酸取代。

氨基酸取代可包括但不限于用另一个氨基酸替换多肽中的一个氨基酸。保守氨基酸取代可以涵盖非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而不是通过生物系统中的合成掺入。天然存在的残基可以基于共同的侧链性质分为几类：

(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性的：Asp、Glu；

(4)碱性的：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳族的：Trp、Tyr、Phe。

取代诱变的目标位点包括CDR和FR。保守取代示于下表2中“优选取代”标题下。表2中“示例性取代”标题下提供了更实质性的改变，并且如下文关于氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸取代引入目标抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。

表2

非保守取代涉及将这些类别之一的成员替换为另一个类别的成员。

在改变抗原结合蛋白(例如，抗ALPP/ALPPL2抗体)的氨基酸序列时，在一些实施方案中，可以考虑氨基酸的亲水指数。每个氨基酸基于其疏水性和电荷特性被指定了一个亲水指数，如下：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；及精氨酸(-4.5)。

亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用的生物功能方面的重要性在本领域中是已知的。Kyte等人,1982,J.Mol.Biol.,157:105-131。已知某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或评分的其他氨基酸取代，并且仍然保持相似的生物活性。在基于亲水指数进行改变时，在某些实施方案中，包括亲水指数在±2内的氨基酸的取代。在某些实施方案中，包括在±1内的那些氨基酸，并且在某些实施方案中，包括在±0.5内的那些氨基酸。

本领域还应当理解，可以在亲水性的基础上有效地进行类似氨基酸的取代，特别是当如此产生的生物功能蛋白质或肽(例如，抗体)意图用于免疫学实施方案中时，如在本发明的情况下。在某些实施方案中，蛋白质的最大局部平均亲水性(受其相邻氨基酸的亲水性影响)与其免疫原性和抗原性相关，即，与蛋白质的生物学性质相关。

这些氨基酸残基已指定以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0±1)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于相似亲水性值进行改变时，在某些实施方案中，包括亲水性值在±2内的氨基酸的取代，在某些实施方案中，包括在±1内的那些氨基酸，并且在某些实施方案中，包括在±0.5内的那些氨基酸。还可以基于亲水性从一级氨基酸序列鉴定表位。这些区域也称为“表位核心区域”。

可以在CDR中进行改变(例如，取代)，例如以提高抗体亲和力。此类改变可以在CDR“热点”中进行，即，由在体细胞成熟过程中经历高频率突变的密码子编码的残基(参见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或接触抗原的残基，并测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建二级文库并从二级文库中重新选择的亲和力成熟例如在Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编辑,HumanPress,Totowa,N.J.,(2001))中进行了描述。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或针对寡核苷酸的诱变)中的任一种将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及针对CDR的方法，其中多个CDR残基(例如，一次4-6个残基)被随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定参与抗原结合的CDR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。

在某些实施方案中，取代、插入或缺失可以发生在一个或多个CDR内，只要此类改变不会显著降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在CDR中进行不会显著降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文提供的保守取代)。此类改变可以例如在CDR中的抗原接触残基之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个CDR是未改变的，或者含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。

一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在此方法中，将残基或靶残基的组(例如，带电荷的残基诸如arg、asp、his、lys和glu)鉴定，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)取代以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始取代显示功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的取代。替代性地，或另外，抗原-抗体复合物的晶体结构可鉴定抗体与抗原之间的接触点。可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基作为取代的候选。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。

氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基-和/或羧基-末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N-或C-末端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合。

2.具有修饰的Fc区的变体

效应子功能降低的抗体包括Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个被取代的抗体(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297被丙氨酸取代的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。

在某些实施方案中，制备了具有改善的或减弱的与FcR结合的抗体变体。(参见例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312；及Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。在一些实施方案中，抗体变体包含具有一个或多个改善ADCC的氨基酸取代的Fc区，例如在Fc区的位置298、333和/或334(残基的EU编号)处的取代。例如，人IgG1 Fc区的暴露于溶剂的氨基酸的系统取代产生了FcγR结合亲和力改变的IgG变体(Shields等人,2001,J.Biol.Chem.276:6591-604)。当与亲本IgG1比较时，涉及在Thr256/Ser298、Ser298/Glu333、Ser298/Lys334或Ser298/Glu333/Lys334处取代为Ala的这些变体的子集证明对FcγR的结合亲和力和ADCC活性增加(Shields等人,2001,J.Biol.Chem.276:6591-604；Okazaki等人,2004,J.Mol.Biol.336:1239-49)。

在一些实施方案中，在Fc区中进行改变以改变(即，改善或减少)Clq结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所描述的。例如，抗体的补体结合活性(C1q结合和CDC活性)可以通过在Lys326和Glu333处的取代来提高(Idusogie等人,2001,J.Immunol.166:2571-2575)。人IgG2主链上的相同取代可以将与C1q结合较差且补体激活活性严重缺乏的抗体同种型转化为既能结合C1q又能介导CDC的抗体同种型(Idusogie等人,2001,J.Immunol.166:2571-75)。还应用了几种其他方法来提高抗体的补体结合活性。例如，将IgM的18个氨基酸的羧基末端尾段接枝到IgG的羧基末端大大增强了它们的CDC活性。即使对于通常没有可检测的CDC活性的IgG4也观察到这一点(Smith等人,1995,J.Immunol.154:2226-36)。此外，用Cys取代位于IgG1重链羧基末端附近的Ser444诱导IgG1的尾-尾二聚化，其CDC活性是单体IgG1的200倍(Shopes等人,1992,J.Immunol.148:2918-22)。此外，对C1q具有特异性的双特异性双抗体构建体也赋予CDC活性(Kontermann等人,1997,Nat.Biotech.15:629-31)。

可以通过将重链的氨基酸残基318、320和322中的至少一个突变为具有不同侧链的残基(诸如Ala)来降低补体活性。其他烷基取代的非离子残基，诸如Gly、Ile、Leu或Val，或芳族非极性残基诸如Phe、Tyr、Trp和Pro替代三个残基中的任一个，也可减少或消除C1q结合。Ser、Thr、Cys和Met可用于残基320和322，而不是318，以降低或消除C1q结合活性。用极性残基替换318(Glu)残基可改变但不消除C1q结合活性。用Ala替换残基297(Asn)导致裂解活性的消除，但对C1q的亲和力仅略微降低(约原来的三分之一)。这种改变破坏了糖基化位点和补体激活所需的碳水化合物的存在。在该位点处的任何其他取代也会破坏糖基化位点。以下突变及其任何组合也减少C1q结合：D270A、K322A、P329A和P311S(参见WO 06/036291)。

可以增加或减少本文提供的抗体的半衰期以改变其治疗活性。FcRn是在结构上类似于与β2-微球蛋白非共价结合的MHC I类抗原的受体。FcRn调节IgG的分解代谢和它们跨组织的转胞吞作用(Ghetie和Ward,2000,Annu.Rev.Immunol.18:739-766；Ghetie和Ward,2002,Immunol.Res.25:97-113)。IgG-FcRn相互作用在pH 6.0(细胞内囊泡的pH)下发生，但在pH 7.4(血液的pH)下不发生；这种相互作用使得IgG能够再循环回到循环中(Ghetie和Ward,2000,Ann.Rev.Immunol.18:739-766；Ghetie和Ward,2002,Immunol.Res.25:97-113)。已经绘制了人IgG

3.具有修饰的糖基化的抗体变体

在某些实施方案中，本文提供的抗体包括一个或多个修饰，以增加或减少抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点来方便地实现抗体的糖基化位点的添加或缺失。

在抗体包含Fc区的情况中，可以改变与其连接的碳水化合物。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的、双触角寡糖，其一般通过N键连接于Fc区的CH2结构域的Asn297。参见例如Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及在双触角寡糖结构的“茎”中连接至GlcNAc的岩藻糖。

在IgG上工程化这种糖型可以显著改善IgG介导的ADCC。向该糖型添加二等分的N-乙酰基葡糖胺修饰(Umana等人,1999,Nat.Biotechnol.17:176-180；Davies等人,2001,Biotech.Bioeng.74:288-94)或从该糖型去除岩藻糖(Shields等人,2002,J.Biol.Chem.277:26733-40；Shinkawa等人,2003,J.Biol.Chem.278:6591-604；Niwa等人,2004,Cancer Res.64:2127-33)是IgG Fc工程化的两个实例，其改善了IgG Fc与FcγR之间的结合，从而增强了Ig介导的ADCC活性。包括此类取代或工程化的抗体包括在本文提供的一些实施方案中。

在某些实施方案中，提供了具有缺乏(直接或间接)连接至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的抗体。例如，这种抗体中的岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。岩藻糖的量通过计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来确定，相对于连接至As n 297的所有糖结构(例如，复合物，杂合体和高甘露糖结构)的总和，如通过MALDI-TOF质谱法所测量的，如例如WO 2008/077546中所描述的。Asn297是指位于Fc区中约位置297处的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可位于位置297上游或下游约±3个氨基酸处，即在位置294与300之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公布号US2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“脱岩藻糖基化”或“岩藻糖缺乏”抗体变体相关的公布的实例包括：US2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/0110704；US2004/0110282；US2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Ok azaki等人J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够产生脱岩藻糖基化抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请号US2003/0157108A1,Presta,L；及WO 2004/056312 A1,Adams等人，特别是在实施例11中)和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因、FUT8、敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；及WO2003/085107)。

还提供了含有二等分寡糖的其他抗体，例如其中连接至抗体Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分。此类抗体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体的实例在例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)、美国专利号6,602,684(Umana等人)和US2005/0123546(Umana等人)中进行了描述。还提供了在连接至Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体在例如WO 1997/30087(Patel等人)、WO 1998/58964(Raju,S.)和WO 1999/22764(Raju,S.)中进行了描述。

4.半胱氨酸工程化抗体变体

在一些实施方案中，本文提供的抗体变体包括将天然氨基酸取代为人IgG1同种型中氨基酸位置234、235、237、239、267、298、299、326、330或332处的半胱氨酸残基，优选S239C突变(恒定区的取代根据EU索引)。额外半胱氨酸残基的存在允许形成链间二硫键。这种链间二硫键的形成可引起空间位阻，从而降低Fc区-FcγR结合相互作用的亲和力。IgG恒定区的Fc区中或附近引入的半胱氨酸残基也可用作与治疗剂缀合的位点(例如，使用硫醇特异性试剂偶联细胞毒性药物，诸如药物的马来酰亚胺衍生物)。治疗剂的存在引起空间位阻，从而进一步降低Fc区-FcγR结合相互作用的亲和力。在位置234、235、236和/或237中的任一个处的其他取代降低了对Fcγ受体、特别是FcγRI受体的亲和力(参见例如US 6,624,821、US 5,624,821)。

在其他半胱氨酸工程化抗体变体中，一个或多个反应性硫醇基团位于抗体的可接近位点处，并且可用于将抗体缀合至其他部分，诸如药物部分或接头-药物部分，以产生免疫缀合物，如本文进一步描述的。在某些实施方案中，以下残基中的任何一个或多个可以被半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；及重链Fc区的5400(EU编号)。半胱氨酸工程化抗体的产生在例如美国专利号7,521,541中进行了描述。

5.示例性Fc变体

提供的某些ABP包括对恒定区的以下修饰。

F.竞争性抗原结合蛋白

本文提供的抗原结合蛋白包括与上述示例性ABP或片段之一竞争与ALPP和/或ALPPL2(例如，SEQ ID NO:2的人ALPP和/或SEQ ID NO:4的人ALPPL2)特异性结合的那些。在这些实施方案中的一些中，测试和参考ABP彼此交叉竞争。此类ABP可以结合与本文所述的抗原结合蛋白之一相同的表位，或结合重叠的表位。在一个实施方案中，此类ABP结合具有SEQ ID NO:73和/或SEQ ID NO:74的氨基酸序列的表位。预期包括与示例性ABP竞争的片段的ABP显示出类似的功能性质(例如，上述活性中的一种或多种)。

在一些实施方案中，提供的ABP包括与具有以下的抗体竞争的那些ABP：(a)对于与SEQ ID NO:56-58或60-62和63-65或68-70中相同的抗体列出的所有6个CDR；(b)对于与SEQID NO:15和30中相同的抗体列出的VH和VL；或(c)对于与SEQ ID NO:40和50中相同的抗体指定的轻链和重链。

G.结合相同表位的抗原结合蛋白

在另一个实施方案中，提供的抗原结合蛋白包括与本文所述的任何ABP结合相同表位的那些。多种技术可用于鉴定与本文所述的一种或多种ABP结合相同表位的ABP。此类方法包括例如本文所述的竞争测定、肽片段的筛选、基于MS的蛋白质足迹、丙氨酸或谷氨酰胺扫描方法，及通过提供表位的原子分辨率的抗原:抗原结合蛋白复合物的晶体的x射线分析。

用于确定特异性抗体结合的表位或表位区域(“表位区域”是包含表位或与表位重叠的区域)的一种方法涉及评估ABP与包含ALPP和/或ALPPL2片段(例如，非变性或变性片段)的肽的结合。可以制备一系列包含ALPP和/或ALPPL2(例如，人ALPP和/或人ALPPL2)序列的重叠肽并筛选结合，例如在直接ELISA、竞争性ELISA(其中评估肽阻止抗体与结合至微量滴定板的孔的ALPP和/或ALPPL2结合的能力)中或在芯片上。此类肽筛选方法可能无法检测一些不连续的功能性表位，即涉及沿着ALPP和/或ALPPL2多肽链的一级序列不连续的氨基酸残基的功能性表位。

在其他实施方案中，含有与抗体接触或被抗体掩埋的残基的区域可以通过突变ALPP和/或ALPPL2中的特定残基并确定ABP是否可以结合突变的或变体ALPP和/或ALPPL2蛋白来鉴定。通过进行多个单独的突变，可以鉴定在结合中起直接作用或与抗体足够接近的残基，使得突变可以影响抗原结合蛋白与抗原之间的结合。根据这些氨基酸的知识，可以阐明含有与ABP接触或被抗体覆盖的残基的抗原的结构域或区域。这样的结构域可以包括ABP的结合表位。这种扫描技术的一般方法涉及用精氨酸和/或谷氨酸残基(通常单独地)取代野生型多肽中的氨基酸。这两种氨基酸通常用于此类扫描技术中，因为它们是带电且庞大的，因此具有破坏引入突变的ALPP和/或ALPPL2区域中的ABP与ALPP和/或ALPPL2之间结合的潜力。野生型抗原中存在的精氨酸被谷氨酸取代。获得多种此类单独的突变体并分析收集的结合结果以确定哪些残基影响结合(参见例如Nanevicz,T.等人,1995,J.Biol.Chem.,270:37,21619-21625和Zupnick,A.等人,2006,J.Biol.Chem.,281:29,20464-20473)。

鉴定表位的另一种方法是基于MS的蛋白质足迹，诸如氢/氘交换质谱(HDX-MS)和蛋白质的快速光化学氧化(FPOP)。用于进行HDX-MS的方法在例如Wei等人(2014)DrugDiscovery Today 19:95中进行了描述。用于执行FPOP的方法在例如Hambley和Gross(2005)J.American Soc.Mass Spectrometry 16:2057中进行了描述。

ABP结合的表位也可以通过结构方法确定，诸如X射线晶体结构测定、分子建模和核磁共振(NMR)光谱，包括当游离时和当与ABP结合在复合物中时抗原中不稳定酰胺氢的H-D交换率的NMR测定(参见例如Zinn-Justin等人(1992)Biochemistry 31,11335-11347；及Zinn-Justin等人(1993)Biochemistry 32,6884-6891)。

X射线晶体学分析可以使用本领域已知的任何方法完成。结晶方法的实例例如由Giege等人(1994)Acta Crystallogr.D50:339-350和McPherson(1990)Eur.J.Biochem.189:1-23进行了描述。此类结晶方法包括微批量(例如Chayen(1997)Structure 5:1269-1274)、悬滴蒸气扩散(例如McPherson(1976)J.Biol.Chem.251:6300-6303)、接种和透析。一旦形成，ABP:抗原晶体本身可以使用熟知的X射线衍射技术研究，并且可以使用计算机软件诸如X-PLOR(耶鲁大学，1992年，由Molecular Simulations,Inc.发行；参见例如Blundell和Johnson(1985)Meth.Enzymol.114和115,H.W.Wyckoff等人编辑,Academic Press；美国专利申请公布号2004/0014194)和BUSTER(Bricogne(1993)ActaCryst.D49:37-60；Bricogne(1997)Meth.Enzymol.276A:361-423,Carter和Sweet编辑；Roversi等人(2000)Acta Cryst.D56:1313-1323)精制。

在一些实施方案中，ABP结合连续表位。在一个优选的实施方案中，ABP结合具有SEQ ID NO:73和/或SEQ ID NO:74的氨基酸序列的表位。

H.其他示例性形式

抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)可以是单个多肽，或者可以包含两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个(相同或不同的)多肽。在抗体或其抗原结合片段是单个多肽的一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可以包含单个抗原结合结构域或两个抗原结合结构域。在抗体或抗原结合片段是单个多肽并且包含两个抗原结合结构域的一些实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以彼此相同或不同(并且可以特异性结合相同或不同的抗原或表位)。

本文所述的抗原结合蛋白的不同部分可以以各种构型排列以获得另外的抗原结合蛋白。例如，在抗体或抗原结合片段是单个多肽的一些实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域(如果存在)可以各自独立地选自：VH结构域、VHH结构域、VNAR结构域和scFv。在抗体或抗原结合片段是单个多肽的一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可以是

V

在抗体或抗原结合片段是单个多肽并且包含两个抗原结合结构域的一些实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以都是VHH结构域，或者至少一个抗原结合结构域可以是VHH结构域。在抗体或抗原结合片段是单个多肽并且包含两个抗原结合结构域的一些实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域都是V

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可以包含两个或更多个多肽(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多肽)。在抗体或抗原结合片段包含两个或更多个多肽的一些实施方案中，两个或更多个多肽中的两个、三个、四个、五个或六个多肽可以是相同的。

在抗体或抗原结合片段包含两个或更多个多肽(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个多肽)的一些实施方案中，抗体或抗原结合片段的两个或更多个多肽可以组装(例如，非共价组装)以形成一个或多个抗原结合结构域，例如抗体的抗原结合片段(例如，本文所述的抗体的任何抗原结合片段)、VHH-scAb、VHH-Fab、双scFab、F(ab')

在一些实施方案中，抗原结合蛋白基于非免疫球蛋白支架。可以插入或移植诸如本文所述的结合结构域(例如，HVR或CDR)的其他支架的实例包括但不限于人纤连蛋白(例如，人纤连蛋白III的第10细胞外结构域)、新制癌菌素CBM4-2、源自脂质运载蛋白的抗促成素、设计的锚蛋白重复结构域(DARPin)、蛋白-A结构域(蛋白Z)、Kunitz结构域、Im9、TPR蛋白、锌指结构域、pVIII、GC4、转铁蛋白、SPA的B结构域、Sac7d、A-结构域，Fyn激酶的SH3结构域和C型凝集素样结构域(参见例如Gebauer和Skerra(2009)Curr.Opin.Chem.Biol.,13:245-255；Binz等人(2005)Nat.Biotech.23:1257-1268；及Yu等人(2017)Annu Rev AnalChem 10:293-320，这些文献中的每一个通过引用全文并入本文)。

IV.抗原结合蛋白表达和生产

A.编码抗原结合蛋白的核酸分子

还提供了编码本文所述的抗原结合蛋白或其部分的核酸分子。此类核酸包括例如：1)编码抗原结合蛋白(例如，抗体或其片段)或其衍生物或变体的那些；2)编码重链和/或轻链、VH和/或VL结构域或位于可变结构域内的1个或多个HVR或CDR(例如，1、2或全部3个VH HVR或CDR或1、2或全部3个VL HVR或CDR)的多核苷酸；3)足以用作杂交探针、PCR引物或测序引物以鉴定、分析、突变或扩增此类编码多核苷酸的多核苷酸；4)用于抑制此类编码多核苷酸表达的反义核酸；及5)前述的互补序列。核酸可以是任何长度。它们的长度可以是例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750或1,000或更多个核苷酸，和/或可以包含一个或多个另外的序列，例如调节序列，和/或是较大核酸例如载体的一部分。核酸可以是单链或双链的。

核酸分子可以存在于完整细胞、细胞裂解物中或以部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过标准技术(包括碱/SDS处理、CsCl条带、柱层析、限制酶、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其他技术)从其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸(例如，其他染色体DNA，例如，与天然分离的DNA连接的染色体DNA)或蛋白质中纯化时，核酸是“分离的”或“基本上纯的”。参见F.Ausubel等人编辑(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。本文所述的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或不含有内含子序列。在某些实施方案中，核酸是cDNA分子。

在一个实施方案中，编码本文提供的抗体的VH序列的核酸分子包含SEQ ID NO:71。在另一个实施方案中，编码本文提供的抗体的VL序列的核酸分子包含SEQ ID NO:72。在另一个实施方案中，编码本文提供的抗体的VH和VL序列的核酸分子分别包含SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72。

因此，提供了包含编码ABP的一条或多条链的多核苷酸的核酸分子，诸如抗ALPP/ALPPL2抗体。在一些实施方案中，核酸分子包含编码ABP(例如，抗ALPP/ALPPL2抗体)的重链或轻链的多核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包含编码ABP(例如，抗ALPP/ALPPL2抗体)的重链的多核苷酸序列和编码其轻链的多核苷酸序列两者。在一些实施方案中，第一核酸分子包含编码重链的第一多核苷酸序列，并且第二核酸分子包含编码轻链的第二多核苷酸序列。

在一个实施方案中，核酸分子包含编码本文提供的抗体之一的VH的多核苷酸。在另一个实施方案中，核酸包含编码本文提供的抗体之一的VL的多核苷酸。在另一个实施方案中，核酸编码本文提供的抗体之一的VH和VL。在某些实施方案中，核酸分子包含编码SEQID NO:15或SEQ ID NO:30的氨基酸序列的多核苷酸。

在一个具体的实施方案中，核酸编码一种或多种上述氨基酸序列(例如，本文公开的重链和/或轻链氨基酸序列，或VH和/或VL氨基酸序列)的变体，其中变体具有至多25个氨基酸修饰，诸如至多20个，诸如至多15、14、13、12或11个氨基酸修饰，诸如10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸修饰，诸如缺失或插入，优选取代，诸如保守取代。

还提供了与任何前述序列具有至少80％、85％、90％(例如，95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核酸分子。因此，例如，在某些实施方案中，核酸包含编码本文公开的抗原结合蛋白之一的重链和/或轻链序列或VH和/或VL序列的核苷酸序列。

一旦获得编码VH和VL区段的核酸，就可以通过标准重组DNA技术进一步操作这些核酸，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的核酸可操作地连接至编码另一多肽的另一核酸，诸如抗体恒定区或柔性接头。

分离的编码VH区的核酸可以通过将编码VH的核酸可操作地连接至编码重链恒定区(铰链、CH1、CH2和/或CH3)的另一核酸分子而转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公布号91-3242)并且包含这些区域的核酸片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，例如IgG1区。对于Fab片段重链基因，编码VH的核酸可以可操作地连接至仅编码重链CH1恒定区的另一核酸分子。

分离的编码VL区的核酸分子可以通过将编码VL的核酸分子操作地连接至编码轻链恒定区CL的另一核酸分子而转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公布号91-3242)并且包含这些区域的核酸片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。

为了产生scFv基因，将编码VH和VL的核酸片段可操作地连接至编码柔性接头(例如，编码氨基酸序列(Gly

另一方面，还提供了适合用作检测核酸序列的引物或杂交探针的核酸分子。核酸分子可仅包含编码全长多肽的核酸序列的一部分，例如，可用作探针或引物的片段或编码多肽的活性部分(例如，ALPP和/或ALPPL2结合部分)的片段。

基于核酸序列的探针可用于检测核酸或类似核酸，例如编码多肽的转录物。探针可包含标记基团，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。此类探针可用于鉴定表达多肽的细胞。

还提供了包含编码ABP的一种或多种组分(例如VH和/或VL；及轻链和/或重链)的一种或多种核酸的载体，包括表达载体。表达载体可以包括但不限于影响或控制转录、翻译的序列，并且如果存在内含子，则影响与其可操作地连接的编码区的RNA剪接。原核生物中表达所必需的核酸序列包括启动子、任选的操纵子序列、核糖体结合位点和可能的其他序列。已知真核细胞利用启动子、增强子及终止和聚腺苷酸化信号。

如果需要，表达载体还可以包括可操作地连接至目标编码序列的分泌信号肽序列，使得表达的多肽可以由重组宿主细胞分泌，以便更容易地从细胞中分离目标多肽。

本发明的表达和克隆载体通常含有被宿主生物体识别并可操作地连接至编码多肽的分子的启动子。被多种潜在宿主细胞识别的大量启动子是众所周知的。通过限制酶消化从源DNA中除去启动子并将所需的启动子序列插入载体，将合适的启动子可操作地连接至编码本发明的抗体和抗原结合片段的重链、轻链或其他组分的DNA。用于酵母宿主的合适的启动子也是本领域众所周知的。酵母增强剂有利地与酵母启动子一起使用。用于哺乳动物宿主细胞的合适的启动子是众所周知的，并且包括但不限于从病毒基因组获得的启动子，所述病毒例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒血清型2、8或9)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40(SV40)。其他合适的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如热休克启动子和肌动蛋白启动子。

可以使用的另外的特定启动子包括但不限于：SV40早期启动子(Benoist和Chambon,1981,Nature 290:304-310)；CMV启动子(Thornsen等人,1984,Proc.Natl.Acad.U.S.A.81:659-663)；劳斯肉瘤病毒的3'长末端重复序列中含有的启动子(Yamamoto等人,1980,Cell22:787-797)；疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1444-1445)；来自金属硫蛋白基因的启动子和调节序列(Prinster等人,1982,Nature 296:39-42)；及原核启动子诸如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:3727-3731)；或tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:21-25)。

在某些实施方案中，编码ABP的不同组分的核酸可以插入到相同的表达载体中。例如，编码抗ALPP/ALPPL2抗体轻链或可变区的核酸可以克隆到与编码抗ALPP/ALPPL2抗体重链或可变区的核酸相同的载体中。在这样的实施方案中，两个核酸可以被内部核糖体进入位点(IRES)分开，并且在单个启动子的控制下，使得轻链和重链由相同的mRNA转录物表达。替代性地，两个核酸可以在两个单独的启动子的控制下，使得轻链和重链由两个单独的mRNA转录物表达。在一些实施方案中，将编码抗ALPP/ALPPL2抗体轻链或可变区的核酸克隆到一种表达载体中，并且将编码抗ALPP/ALPPL2抗体重链或可变区的核酸克隆到第二表达载体中。在这样的实施方案中，宿主细胞可以用两种表达载体共转染以产生本发明的完整抗体或抗原结合片段。

B.宿主细胞

在构建载体并将编码本文所述的ABP的组分的一种或多种核酸分子插入到载体的适当位点后，可以将完整的载体插入到合适的宿主细胞中以进行扩增和/或多肽表达。

因此，在另一方面，还提供了包含诸如本文所述的核酸分子或载体的宿主细胞。在各种实施方案中，ABP重链和/或抗轻链可以在原核细胞诸如细菌细胞或真核细胞诸如真菌细胞(诸如酵母)、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达。合适宿主细胞的选择取决于多种因素，诸如所需的表达水平、活性所需或必需的多肽修饰(诸如糖基化或磷酸化)及折叠成生物活性分子的容易程度。

将一种或多种核酸引入所需宿主细胞可以通过任何方法完成，包括但不限于磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。非限制性示例性方法在例如Sambrook等人,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第3版,ColdSpring Harbor Laboratory Press(2001)中进行了描述。根据任何合适的方法，核酸可以在所需宿主细胞中瞬时或稳定转染。

示例性原核宿主细胞包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，诸如埃希氏菌属(Escherichia)(例如，大肠杆菌(E.coli))、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如，粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans))和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacillus)(诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis))、假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)。

酵母也可以用作宿主细胞，包括但不限于酿酒酵母(S.cerevisae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)或乳酸克鲁维酵母(K.lactis)。

多种哺乳动物细胞系可以用作宿主，包括但不限于可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括CHOK1细胞(ATCCCCL61)、DXB-11、DG-44和中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216,1980)；SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293或293细胞，Graham等人,J.GenVirol.36:59,1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠支持细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251,1980)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝癌细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TM细胞(Mather等人,Annals N.YAcad.Sci.383:44-68,1982)；MRC 5细胞或FS4细胞；哺乳动物骨髓瘤细胞和许多其他细胞系。

一旦制备了合适的宿主细胞，就可以用它来表达所需的ABP。因此，在另一方面，还提供了用于产生如本文所述的ABP的方法。通常，此类方法包括在允许表达由一种或多种表达载体编码的ABP的条件下，在培养基中培养包含如本文所述的一种或多种表达载体的宿主细胞；及从培养基中回收ABP。

在一些实施方案中，ABP在无细胞系统中产生。非限制性示例性无细胞系统在例如Sitaraman等人,Methods Mol.Biol.498:229-44(2009)、Spirin,Trends Biotechnol.22:538-45(2004)、Endo等人,Biotechnol.Adv.21:695-713(2003)中进行了描述。

V.抗原结合蛋白缀合物

本文提供的ABP可以缀合至细胞毒性或细胞生长抑制部分(包括其药学上相容的盐)以形成缀合物，诸如抗体药物缀合物(ADC)。用于与ABP(例如，抗体)缀合的特别合适的部分是细胞毒性剂(例如，化疗剂)、前药转化酶、放射性同位素或化合物、或毒素(这些部分统称为治疗剂)。例如，ABP(例如，抗ALPP/ALPPL2抗体)可以缀合至细胞毒性剂，诸如化疗剂或毒素(例如，细胞生长抑制剂或杀细胞剂，例如，相思豆毒素、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素)。有用的细胞毒性剂类别的实例包括例如DNA小沟结合剂、DNA烷化剂和微管蛋白抑制剂。示例性细胞毒性剂包括例如奥瑞他汀、喜树碱、加利车霉素、多卡霉素、依托泊苷、类美登素(例如，DM1、DM2、DM3、DM4)、紫杉烷、苯并二氮杂

在一个实施方案中，ABP(例如，抗ALPP/ALPPL2抗体)与前药转化酶缀合。可以使用已知方法将前药转化酶重组融合至抗体或与其化学缀合。示例性前药转化酶是羧肽酶G2、β-葡糖醛酸酶、青霉素-V-酰胺酶、青霉素-G-酰胺酶、β-内酰胺酶、β-葡糖苷酶、硝基还原酶和羧肽酶A。

将治疗剂与蛋白质、特别是与抗体缀合的技术是众所周知的。(参见例如Alley等人,Current Opinion in Chemical Biology 2010 14:1-9；Senter,Cancer J.,2008,14(3):154-169。)治疗剂可以以降低其活性的方式缀合，除非其被从抗体上裂解(例如，通过水解、通过蛋白水解降解或通过裂解剂)。在一些方面，治疗剂通过可裂解接头连接至抗体，该可裂解接头对表达ALPP的癌细胞的细胞内环境中的裂解敏感，但对细胞外环境基本上不敏感，使得当缀合物被表达ALPP的癌细胞内化时(例如，在内体中，或例如借助于pH敏感性或蛋白酶敏感性，在溶酶体环境中或在细胞膜穴环境中)，缀合物从抗体裂解。在一些方面，治疗剂还可以通过不可切割的接头连接至抗体。

通常，ADC包含治疗剂与抗ABP(例如，抗ALPP/ALPPL2抗体)之间的接头区。接头通常在细胞内条件下是可裂解的，使得接头的裂解在细胞内环境中(例如，在溶酶体或核内体或细胞膜穴中)从抗体释放治疗剂。接头可以是例如被细胞内肽酶或蛋白酶(包括溶酶体或内体蛋白酶)裂解的肽基接头。裂解剂可以包括组织蛋白酶B和D及纤溶酶(参见例如Dubowchik和Walker,Pharm.Therapeutics 83:67-123,1999)。最典型的是可被表达ALPP的细胞中存在的酶裂解的肽基接头。例如，可以使用可被在癌组织中高度表达的硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶-B裂解的肽基接头(例如，包含Phe-Leu或Val-Cit肽的接头)。

可裂解接头可以是pH敏感的，即，在某些pH值下对水解敏感。通常，pH敏感性接头在酸性条件下是可水解的。例如，可以使用在溶酶体中可水解的酸不稳定接头(例如，腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺式乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等)。(参见例如美国专利号5,122,368；5,824,805；5,622,929；Dubowchik和Walker,Pharm.Therape utics 83:67-123,1999；Neville等人,Biol.Chem.264:14653-14661,1989。)此类接头在中性pH条件下(诸如在血液中)相对稳定，但在低于pH 5.5或5.0(溶酶体的大致pH)下不稳定。

其他接头在还原条件下是可裂解的(例如，二硫键接头)。二硫键接头包括可以使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯)、SPDB和SMPT形成的那些。(参见例如Thorpe等人,Cancer Res.47:5924-5931,1987；Wawrzynczak等人,In Immunoconjugates:Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer(C.W.Vogel编辑,Oxford U.Press,1987.还参见美国专利号4,880,935。)

接头也可以是丙二酸酯接头(Johnson等人,Anticancer Res.15:1387-93,1995)、马来酰亚胺苯甲酰基接头(Lau等人,Bioorg-Med-Chem.3:1299-1304,1995)或3'-N-酰胺类似物(Lau等人,Bioorg-Med-Chem.3:1305-12,1995)。

在其他实施方案中，接头是不可裂解的接头，诸如马来酰亚胺基-亚烷基-或马来酰亚胺-芳基接头，其直接连接至治疗剂并通过抗体的蛋白水解降解而释放。

通常，接头对细胞外环境基本上不敏感，这意味着当ADC存在于细胞外环境中(例如，血浆中)时，ADC样品中不超过约20％，通常不超过约15％，更通常不超过约10％，甚至更通常不超过约5％，不超过约3％或不超过约1％的接头被裂解。接头是否对细胞外环境基本上不敏感可以例如通过以下方式来确定：将(a)ADC(“ADC样品”)和(b)等摩尔量的未缀合的抗体或治疗剂(“对照样品”)与血浆独立地温育预定的时间段(例如，2、4、8、16或24小时)，然后将ADC样品中存在的未缀合的抗体或治疗剂的量与对照样品中存在的量进行比较，如例如通过高效液相色谱法所测量的。

接头还可以促进细胞内化。当与治疗剂缀合时(即，在如本文所述的ADC或ADC衍生物的接头-治疗剂部分的环境中)，接头可以促进细胞内化。替代性地，当与治疗剂和抗原结合蛋白(例如，抗ALPP/ALPPL2抗体)两者缀合时(即，在如本文所述的ADC的环境中)，接头可以促进细胞内化。

示例性抗体-药物缀合物包括基于奥瑞他汀的抗体-药物缀合物，这意味着药物组分是奥瑞他汀药物。奥瑞他汀结合微管蛋白，已被证明干扰微管动力学及细胞核和细胞分裂，并且具有抗癌活性。通常，基于奥瑞他汀的抗体-药物缀合物包含在奥瑞他汀药物与ABP(例如，抗ALPP/ALPPL2抗体)之间的接头。接头可以是例如可裂解接头(例如，肽基接头)或不可裂解接头(例如，通过抗体降解释放的接头)。奥瑞他汀可以是奥瑞他汀E或其衍生物。奥瑞他汀可以是例如在奥瑞他汀E与酮酸之间形成的酯。例如，奥瑞他汀E可以与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰戊酸反应分别产生AEB和AEVB。其他典型的奥瑞他汀包括MMAF和MMAE。示例性奥瑞他汀的合成和结构在美国公布号7,659,241、7,498,298、2009-0111756、2009-0018086和7,968,687中进行了描述，这些公开中的每一个通过引用全文并入本文并且用于所有目的。

示例性的基于奥瑞他汀的抗体药物缀合物包括mc-vc-PABC-MMAE(在本文中也称为vcMMAE或1006)、mc-vc-PABC-MMAF、mc-MMAF和mp-dLAE-PABC-MMAE(在本文中也称为dLAE-MMAE或mp-dLAE-MMAE或7092)，抗体药物缀合物如下所示，其中Ab是ABP(例如，如本文所述的抗ALPP/ALPPL2抗体)并且val-cit(vc)代表缬氨酸-瓜氨酸二肽，并且dLAE代表D-亮氨酸-丙氨酸-谷氨酸三肽：

三肽：

/>

或其药学上可接受的盐。载药量由p表示，即每个抗体的药物-接头部分的数量。根据上下文，p可以代表抗体组合物中每个抗体的药物-接头部分的平均数，也称为平均载药量。P的范围为1至20并且优选为1至12或1至8。在一些优选的实施方案中，当p代表平均载药量时，p的范围为约2至约5。在一些实施方案中，p为约2、约3、约4或约5。制剂中每个抗体的药物平均数可以通过常规手段诸如质谱法、HIC、ELISA测定和HPLC来表征。在一些方面，ABP(例如，抗ALPP/ALPPL2抗体)通过抗体的半胱氨酸残基连接至药物-接头。在一些实施方案中，半胱氨酸残基是被工程化到抗体中的半胱氨酸残基。在其他方面，半胱氨酸残基是链间二硫键半胱氨酸残基。

VI.治疗应用

A.治疗疾病的方法

另一方面，提供了治疗与表达ALPP和/或ALPPL2的细胞相关的病症(例如，癌症)的方法。相对于与感兴趣的病症不相关的细胞，这些细胞可以表达或不表达升高水平的ALPP和/或ALPPL2。因此，某些实施方案涉及使用本文所述的ABP(例如，抗ALPP/ALPPL2抗体)作为裸抗体或作为缀合物(例如，抗体药物缀合物)来治疗受试者，例如患有癌症的受试者。在这些实施方案中的一些中，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的ABP(例如，抗ALPP/ALPPL2抗体)或缀合物(例如，抗ALPP/ALPPL2 ADC)或包含此类ABP或缀合物的组合物。在某些示例性实施方案中，该方法包括治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的癌症。最典型地，治疗方法包括治疗人的癌症。在一些实施方案中，治疗涉及单一疗法。在其他方法中，抗原结合蛋白作为与一种或多种其他治疗剂、手术和/或放射的组合治疗的一部分施用。

癌症的积极治疗效果可以以多种方式测量(参见例如W.A.Weber,J.Null.Med.50:1S-10S(2009)；及Eisenhauer等人,Eur.J Cancer45:228-247(2009))。在一些实施方案中，使用RECIST 1.1标准评估对用ABP或缀合物治疗的反应。在一些实施方案中，通过治疗有效量实现的治疗是抑制进一步肿瘤生长、诱导肿瘤消退、部分反应(PR)、完全反应(CR)、无进展生存(PFS)、无病生存(DFS)、客观反应(OR)或总生存(OS)中的任一种。在一些实施方案中，治疗延迟或预防了转移的发生。可以使用多种方法监测治疗的进展。例如，抑制可以导致肿瘤大小减小和/或肿瘤内代谢活性降低。这两个参数都可以通过例如MRI或PET扫描来测量。还可以通过活检来监测抑制以确定坏死水平、肿瘤细胞死亡和肿瘤内血管分布水平。有效治疗癌症患者的本文所述疗法的剂量方案可以根据诸如患者的疾病状态、年龄和体重及疗法在受试者中引发抗癌反应的能力等因素而变化。虽然本发明的治疗方法、药物和用途的实施方案可能无法有效地在每个受试者中实现积极的治疗效果，但它应当在统计学上显著数量的受试者中做到这样，如通过本领域已知的任何统计检验诸如学生t检验、chi2检验、根据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验所确定的。

如本文所用，“RECIST 1.1反应标准”是指Eisenhauer等人,Eur.JCancer 45:228-247(2009)中针对靶病变或非靶病变(视情况而定)所阐述的定义，基于测量反应的背景。

有效量的ABP(例如，抗ALPP/ALPPL2抗体)或ADC可以一次或多次施用、应用或剂量施用，并且不意图限于特定制剂或施用途径。通常，活性组分的治疗有效量在0.1mg/kg至100mg/kg，例如1mg/kg至100mg/kg、1mg/kg至10mg/kg的范围内。

ABP(例如，抗ALPP/ALPPL2抗体)的示例性剂量为例如0.1mg/kg至50mg/kg患者体重，更通常为1mg/kg至30mg/kg、1mg/kg至20mg/kg、1mg/kg至15mg/kg、1mg/kg至12mg/kg、或1mg/kg至10mg/kg1、或2mg/kg至30mg/kg、2mg/kg至20mg/kg、2mg/kg至15mg/kg、2mg/kg至12mg/kg、或2mg/kg至10mg/kg、或3mg/kg至30mg/kg、3mg/kg至20mg/kg、3mg/kg至15mg/kg、3mg/kg至12mg/kg、或3mg/kg至10mg/kg。

ABP(例如，抗ALPP/ALPPL2抗体)的示例性剂量为例如0.01mg/kg至10mg/kg、0.1mg/kg至10mg/kg、0.3mg/kg至3mg/kg、0.5mg/kg至3mg/kg、1mg/kg至7.5mg/kg或2mg/kg至7.5mg/kg或3mg/kg至7.5mg/kg受试者体重，或0.1-20或0.5-5mg/kg体重(例如，0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg)或10-1500或200-1500mg作为固定剂量。在一些方法中，向患者施用至少1.5mg/kg、至少2mg/kg或至少3mg/kg的剂量，每三周或更长时间施用一次。

施用的剂量可以根据已知因素而变化，诸如特定剂的药效学特征及其施用模式和途径；接受者的年龄、健康状况和体重；待治疗的疾病或适应症的类型和程度、症状的性质和程度、同时治疗的种类、治疗的频率及所需的效果。初始剂量可以增加到超过上限水平，以快速达到所需的血液水平或组织水平。替代性地，初始剂量可以小于最佳值，并且每日剂量可以在治疗过程中逐渐增加。

施用频率取决于ABP或ADC在循环中的半衰期、患者的状况和施用途径等因素。频率可以是例如每天、每周、每月、每季度或响应于患者状况的变化或所治疗的癌症的进展而以不规则的间隔。静脉内施用的示例性频率是在连续治疗过程中每周两次与每季度一次之间，但是也可以更高或更低频率的给药。静脉内施用的其他示例性频率是在连续治疗过程中每周、每隔一周、每四周中的三周或每三周，但是也可以更高或更低频率的给药。对于皮下施用，示例性给药频率是每天至每月，但是也可以更高或更低频率的给药。

施用的剂量数量取决于癌症的性质(例如，是否呈现急性或慢性症状)和病症对治疗的反应。在一些方面，对于急性病症或慢性病症的急性恶化，1至10个剂量通常是足够的。有时，任选地以分开形式的单次推注剂量足以用于急性病症或慢性病症的急性恶化。对于急性病症的复发或急性加重，可以重复治疗。对于慢性病症，抗体可以以规则的间隔施用，例如每周、每两周、每月、每季度、每六个月，持续至少1、5或10年，或患者的一生。

适于用本文提供的抗原结合蛋白治疗的示例性癌症是在癌细胞或组织中具有ALPP和/或ALPPL2表达的那些。可用ABP或其缀合物治疗的癌症的实例包括但不限于造血肿瘤、产生实体瘤的造血肿瘤、实体瘤、软组织肿瘤和转移性病变。

可以治疗的示例性实体瘤包括但不限于多种器官系统的恶性肿瘤，例如腺癌和癌，诸如影响头和颈(包括咽)、肺(小细胞肺癌(SCLC)或非小细胞肺癌(NSCLC))、乳腺、胃肠道(例如，口腔、食道、胃、肝、胰腺、小肠、结肠和直肠、肛管)、生殖器和泌尿生殖道(例如，肾、尿路上皮、膀胱、卵巢、子宫、子宫颈、子宫内膜、前列腺、睾丸)、肤(例如，黑素瘤)等的那些恶性肿瘤。在某些实施方案中，实体瘤是NMDA受体阳性畸胎瘤。在其他实施方案中，癌症选自乳腺癌、结肠癌、胰腺癌(例如，胰腺神经内分泌肿瘤(PNET)或胰腺导管腺癌(PDAC))、胃癌、子宫癌和卵巢癌。在一些实施方案中，癌症是恶性睾丸生殖细胞肿瘤(GCT)或恶性卵巢GCT。在其他实施方案中，癌症不是纯畸胎瘤。在一些实施方案中，实体瘤癌症是转移性的。在一些实施方案中，滑动肿瘤癌不能通过手术去除(不可切除)。

在某些实施方案中，癌症是与腹水相关的实体瘤。腹水是许多类型的癌症的症状，并且还可能由多种疾患引起，诸如晚期肝病。可能引起腹水的癌症类型包括但不限于乳腺癌、肺癌、大肠癌(结肠癌)、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌(子宫内膜癌)、腹膜癌等。在一些实施方案中，与腹水相关的实体瘤选自乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、子宫癌和卵巢癌。在一些实施方案中，癌症与胸腔积液相关，例如肺癌。

在具体的实施方案中，癌症是HGSOC，其中HGSOC在之前的含铂化疗后六个月内在患者体内进展或复发，并且患者已经接受过一至三线先前的抗癌治疗，包括含贝伐单抗或与贝伐单抗生物类似的至少一线治疗。在其他实施方案中，癌症是NSCLC，其中患者患有不可切除的局部晚期或转移性NSCLC并且已接受基于铂的疗法和PD-L1抑制剂。在其他实施方案中，癌症是胃癌，其中患者患有不可切除的局部晚期或转移性胃癌并且之前已接受过基于铂和氟嘧啶的化疗。

在具体的实施方案中，癌症是卵巢癌、肺癌、子宫内膜癌、膀胱癌或胃癌。

B.组合治疗

本文所述的方法、抗原结合蛋白和缀合物可以与其他治疗剂和/或方式组合使用。在这样的组合治疗方法中，在受试者受病症折磨的过程中向受试者递送两种(或更多种)不同的治疗，使得治疗对患者的效果在某个时间点重叠。在某些实施方案中，一种治疗的递送在第二种治疗的递送开始时仍然发生，使得在施用方面存在重叠。这在本文中有时被称为“同时”或“并行递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的一些实施方案中，由于组合施用，治疗更有效。例如，第二治疗更有效，例如，与在没有第一治疗的情况下施用第二治疗相比，用更少的第二治疗观察到等同的效果，或者第二治疗更大程度地减轻症状，或者用第一治疗观察到类似的情况。在一些实施方案中，递送使得与病症相关的症状或其他参数的减轻大于在不存在另一种治疗的情况下递送一种治疗时所观察到的减轻。两种治疗的效果可以是部分相加、完全相加或大于相加(即协同反应)。递送可以使得当递送第二治疗时仍然可检测到所递送的第一治疗的效果。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括向受试者施用本文所述的ABP(例如，抗ALPP/ALPPL2抗体)或ADC，例如组合物或制剂，与一种或多种另外的疗法例如手术、放射疗法或施用另一种治疗制剂组合。例如，在一些实施方案中，ABP与化疗(例如，细胞毒性剂)、靶向疗法(例如，针对癌症抗原的抗体)、血管生成抑制剂和/或免疫调节剂(诸如免疫检查点分子的抑制剂)组合。在其他实施方案中，另外的疗法是抗炎剂(例如，甲氨蝶呤)或抗纤维化剂。ABP(例如，抗ALPP/ALPPL2抗体)或ADC和另外疗法可以同时或依次施用。

在一些实施方案中，可以与ABP组合使用的示例性细胞毒性剂包括抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物、蛋白质合成和降解抑制剂、有丝分裂抑制剂、烷化剂、铂化剂、核酸合成抑制剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDAC抑制剂，例如，伏立诺他(SAHA，MK0683)、恩替司他(MS-275)、帕比司他(LBH589)、曲古抑菌素A(TSA)、莫西诺司他(MGCD0103)、贝利司他(PXD101)、罗米地辛(FK228，缩酚酸肽))、DNA甲基转移酶抑制剂、氮芥、亚硝基脲、乙烯亚胺、烷基磺酸盐、三氮烯、叶酸类似物、核苷类似物、核糖核苷酸还原酶抑制剂、长春花生物碱、紫杉烷、埃博霉素、嵌入剂、能够干扰信号转导途径的剂、促进细胞凋亡和辐射的剂、或结合表面蛋白以递送毒性剂的抗体分子缀合物。在一个实施方案中，可以与本文所述的ABP一起施用的细胞毒性剂是基于铂的药剂(诸如顺铂)、环磷酰胺、达卡巴嗪、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、吉西他滨、卡培他滨、羟基脲、拓扑替康、伊立替康、氮杂胞苷、伏立诺他、伊沙匹隆、硼替佐米、紫杉烷类(例如，紫杉醇或多西他赛)、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、秋水仙碱、蒽环类(例如，多柔比星或表柔比星)、柔红霉素，二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、阿霉素、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、蓖麻毒蛋白或类美登素。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白作为化疗方案的一部分施用，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松)；CVP(环磷酰胺、长春新碱和泼尼松)；RCVP(利妥昔单抗+CVP)；RCHOP(利妥昔单抗+CHOP)；RCHP(利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星和泼尼松)；RICE(利妥昔单抗+异环磷酰胺、卡铂、依托泊苷)；RDHAP(利妥昔单抗+地塞米松、阿糖胞苷、顺铂)；RESHAP(利妥昔单抗+依托泊苷、甲泼尼龙、阿糖胞苷、顺铂)；R-BENDA(利妥昔单抗和苯达莫司汀)、RGDP(利妥昔单抗、吉西他滨、地塞米松、顺铂)。在一个实施方案中，CHOP、CVP、RCVP、RCHOP、RCHP、RICE、RDHAP、RESHAP、R-BENDA和RGDP中的一种在与如本文所述的抗原结合蛋白或缀合物的组合疗法中施用。

在某些实施方案中，可以与ABP组合的靶向疗法的实例包括但不限于使用治疗抗体。示例性抗体包括但不限于与肿瘤细胞上存在的细胞表面蛋白诸如Her2、CDC20、CDC33、粘蛋白样糖蛋白和表皮生长因子受体(EGFR)结合并任选地对展示这些蛋白的肿瘤细胞诱导细胞生长抑制和/或细胞毒性作用的那些。示例性抗体还包括

在某些实施方案中，本文提供的抗原结合蛋白与一种或多种减少血管生成的抗血管生成剂组合使用。此类剂包括但不限于IL-8拮抗剂；

可以与抗原结合蛋白组合使用的其他抗血管生成剂包括诸如MMP-2(基质金属蛋白酶2)抑制剂、MMP-9(基质金属蛋白酶9)抑制剂和COX-II(环加氧酶II)抑制剂的剂。有用的COX-II抑制剂的实例包括

如本文所用，“免疫检查点分子”是指免疫系统中的分子，其上调信号(刺激分子)和/或下调信号(抑制分子)。许多癌症通过抑制T细胞信号传导来逃避免疫系统。在某些实施方案中，可以与ABP一起使用的示例性免疫检查点分子包括但不限于程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序性死亡配体1(PD-L1)、PD-L2、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞激活基因3(LAG-3)、癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM-1)、CEACAM-5、T细胞激活的V结构域Ig抑制因子(VISTA)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、CD160、TGFR、腺苷2A受体(A2AR)、B7-H3(也称为CD276)、B7-H4(也称为VTCN1)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、2B4、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、OX40、4-1BB、4-1BBL、B7-H3、诱导型T细胞共刺激因子(ICOS/ICOS-L)、CD27/CD70、糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)、CD47/信号调节蛋白α(SIRPα)和吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)。

在某些实施方案中，可以与ABP组合使用的免疫检查点抑制剂的具体实例包括但不限于以下单克隆抗体：PD-1抑制剂诸如帕博利珠单抗(

VII.诊断应用

另一方面，如本文提供的ABP(例如，抗ALPP/ALPPL2抗体或其片段)、多肽和核酸可用于检测、诊断和监测与ALPP和/或ALPPL2相关的疾病、病症或疾患的方法中。

在一些实施方案中，该方法包括检测从怀疑患有与ALPP和/或ALPPL2相关的病症的受试者获得的样品中ALPP和/或ALPPL2的表达。在一些实施方案中，检测方法包括使样品与如本文所述的抗体、多肽或多核苷酸接触并确定结合水平是否不同于参考或比较样品的结合水平。在一些实施方案中，此类方法可用于确定本文所述的抗体或多肽是否是对受试者合适的治疗。

例如，在一个实施方案中，使细胞或细胞/组织裂解物与抗ALPP/ALPPL2抗体接触并确定抗体与细胞或抗原之间的结合。当测试细胞与相同组织类型的参考细胞相比显示出结合活性时，它可以表明与ALPP和/或ALPPL2相关的疾病或疾患的存在。在一些实施方案中，测试细胞来自人体组织。

可以使用本领域已知的用于检测特异性抗体-抗原结合的各种方法。可以根据本发明进行的示例性免疫测定包括荧光偏振免疫测定(FPIA)、荧光免疫测定(FIA)、酶免疫测定(EIA)、浊度抑制免疫测定(NIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。

本文提供的诊断应用包括使用ABP(例如，抗ALPP/ALPPL2抗体或其片段)来检测ALPP和/或ALPPL2的表达及配体与ALPP和/或ALPPL2的结合。对于诊断应用，ABP通常用可检测的标记基团标记。合适的标记基团包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，

另一方面，ABP可用于鉴定表达ALPP和/或ALPPL2的一种或多种细胞。在一个具体的实施方案中，抗原结合蛋白用标记基团标记，并检测标记的抗原结合蛋白与ALPP和/或ALPPL2的结合。在另一个具体的实施方案中，在体内检测抗原结合蛋白与ALPP和/或ALPPL2的结合。

抗原结合蛋白(例如，抗ALPP/ALPPL2抗体或其片段)也可以使用本领域众所周知的技术用作病理学中的染色试剂。

VIII.药物组合物和制剂

还提供了包含ABP(例如，抗ALPP/ALPPL2抗体或其片段)的药物组合物，并且可以将其用于本文公开的任何治疗应用中。在某些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的一种或多种抗原结合蛋白，及药学上可接受的稀释剂或载剂。在其他实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的一种或多种抗原结合蛋白、药学上可接受的稀释剂、载剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。可接受的制剂材料在所使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的。药物组合物可以配制为液体、冷冻或冻干组合物。

在某些实施方案中，药物组合物可以含有用于改变、维持或保存组合物的例如pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的制剂材料。合适的制剂材料包括但不限于氨基酸；抗微生物剂；抗氧化剂；缓冲剂；增容剂；螯合剂；络合剂；填料；碳水化合物，诸如单糖或二糖；蛋白质；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物；低分子量多肽；成盐抗衡离子(诸如钠)；防腐剂；溶剂(诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂；稳定性增强剂；张力增强剂；递送媒介物；和/或药物佐剂。可以掺入药物组合物中的合适剂的其他细节和选择提供于例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第22版,(Loyd V.Allen编辑)PharmaceuticalPress(2013)、Ansel等人,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第7版,Lippencott Williams and Wilkins(2004)和Kibbe等人,Handbook ofPharmaceutical Excipients,第3版,Pharmaceutical Press(2000)中。

药物组合物的组分的选择取决于例如预期的施用途径、递送形式和所需的剂量。参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第22版,(Loyd V.Allen编辑)Pharmaceutical Press(2013)。选择组合物以影响所公开的抗原结合蛋白的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。药物组合物中的主要媒介物或载剂可以是水性或非水性的。例如，合适的媒介物或载剂可以是注射用水或生理盐水溶液。在某些实施方案中，抗原结合蛋白组合物可以通过将具有所需纯度的所选组合物与任选的制剂剂以冻干饼或水溶液的形式混合来制备用于储存。此外，在某些实施方案中，可以使用合适的赋形剂将抗原结合蛋白配制为冻干物。

药物组合物被配制为与其预期的施用途径相容。施用途径的实例是静脉内(IV)、皮内、吸入、经皮、局部、经粘膜和直肠施用。抗原结合蛋白(例如，抗体)的优选施用途径是IV输注。在另一个优选的实施方案中，制剂通过肌内或皮下注射施用。

IX.试剂盒/制品

还提供了含有本文所述的ABP的试剂盒。在一个实施方案中，此类试剂盒包含一个或多个容器，该一个或多个容器包含抗原结合蛋白(例如，抗ALPP/ALPPL2抗体)或单位剂型和/或制品。在一些实施方案中，提供了单位剂量，其中该单位剂量含有预定量的包含抗原结合蛋白的组合物，具有或不具有一种或多种另外的剂。在一些实施方案中，这样的单位剂量在用于注射的一次性预填充注射器中提供。在各种实施方案中，包含在单位剂量中的组合物可以包含：盐水；缓冲剂、其他制剂组分，和/或在如本文所述的稳定且有效的pH范围内配制。替代性地，在一些实施方案中，组合物以冻干粉末的形式提供，其可在添加适当液体(例如，无菌水)后重构。

如本文提供的一些试剂盒还包含用于根据本文所述的任何方法治疗与ALPP和/或ALPPL2相关的疾病(诸如卵巢癌)的说明书。试剂盒还可以包含如何选择或鉴定适于治疗的个体的说明。本发明的试剂盒中提供的说明书通常是标签或包装插页上的书面说明书(例如，包含在试剂盒中的纸片)，但机器可读说明书(例如，磁或光存储盘上携带的说明书)也是可接受的。在一些实施方案中，试剂盒还包含另一种治疗剂，例如上述适合与抗原结合蛋白组合使用的治疗剂。

另一方面，提供了用于检测样品中ALPP和/或ALPPL2或表达ALPP和/或ALPPL2的细胞的存在的试剂盒。此类试剂盒通常包含本文所述的抗原结合蛋白和试剂盒的使用说明书。

某些试剂盒例如用于诊断癌症并且包含容纳抗原结合蛋白(例如，抗ALPP/ALPPL2抗体)和一种或多种用于检测抗原结合蛋白与ALPP和/或ALPPL2的结合的试剂的容器。此类试剂可以包括例如荧光标记、酶标记或其他可检测标记。试剂还可以包括二级或三级抗体或试剂，例如用于产生可以被可视化的产物的酶反应。在一个实施方案中，诊断试剂盒包含在合适的容器中的标记或未标记形式的一种或多种抗原结合蛋白、用于间接测定的温育试剂，及用于在这种测定中检测的底物或衍生剂，这取决于标记的性质。

诸如本文提供的试剂盒可用于原位检测。利用此类试剂盒的一些方法包括从患者取出组织学样本，然后将标记的抗原结合蛋白(例如，抗ALPP/ALPPL2抗体)与生物样品组合。使用此类方法，不仅可以确定ALPP或ALPP片段和/或ALPPL2或ALPPL2片段的存在，而且可以确定此类肽在所检查的组织中的分布(例如，在评估癌细胞扩散的情况下)。

另一方面，提供了结合抗原结合蛋白(例如，抗ALPP/ALPPL2抗体)的抗独特型抗体(Id)。Id抗体可以通过用制备抗Id的mAb免疫与抗ALPP/ALPPL2 mAb来源相同物种和基因类型的动物来制备。免疫动物通常可以通过产生针对这些独特型决定簇的抗体(抗Id抗体)来识别和反应免疫抗体的独特型决定簇。

提供以下实施例(包括进行的实验和获得的结果)仅用于说明目的，而不应解释为限制所附权利要求的范围。

X.实施例

实施例1：ALPP/ALPPL2表达水平

根据美国典型培养物保藏中心(ATCC)或德国微生物和细胞培养物保藏中心(DMSZ)、日本癌症研究资源库(JCRB)或其他已知的条件，将以下实施例中描述的细胞系维持在培养物中。

使用鼠ALPP mAb作为一抗和DAKO QiFiKit流式细胞术间接测定法(如制造商(DAKO A/S,Glostrup,Denmark)所述)对各种癌细胞系细胞表面上的ALPP拷贝数进行定量，并用Attune NxT流式细胞仪进行评估。所得的每个细胞表达的ALPP分子的数目示出于表3中。ALPP/ALPPL2 mRNA表达水平从Genentech细胞系RNA-seq数据(参见Klijn C等人NatBiotechnol.2015Mar；33(3):306-12)获得。

表3：各种细胞系的ALPP/ALPPL2分子/细胞

肿瘤组织阵列获自商业来源。冷冻或福尔马林固定并石蜡包埋(FFPE)的组织购自USBiomax Inc。所有样品均在Bond-Max

将在载玻片上切片的冷冻样品在染色前用丙酮固定10分钟。将载玻片与抗ALPP/ALPPL2一抗(H17E2；Thermo；目录号MA1-20245)一起温育。同种型匹配的小鼠IgG1用作背景染色的阴性对照。对于自动IHC染色，我们使用Refine DAB试剂盒(Leica，目录号DS9800)。将载玻片与5μg/ml的针对ALPP的小鼠单克隆一抗一起温育45分钟，并与PeroxAbolish(Biocare Medical目录号PXA969M)试剂预温育15分钟，然后与蛋白块(DAKO目录号X0909)预温育20分钟。使用Bond

表4

9

实施例2：先导抗体选择

缀合和体外细胞毒性

用重组全长ALPPL2免疫小鼠。将从产生ALPP抗体的小鼠的脾脏和淋巴结中收集的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合。在杂交瘤生长培养基中过夜回收融合细胞。回收后，将细胞离心，然后铺板于半固体培养基中。温育杂交瘤并挑选产生IgG的杂交瘤克隆。根据制造商说明书，使用iQue在表达ALPP、ALPPL2、ALPI和ALPL的HEK293细胞系上筛选来自该杂交瘤系列的抗体。对ALPP和ALPPL2(而非ALPI和ALPL)具有交叉反应性的抗体被评估为ADC。

将各种小鼠抗ALPP/ALPPL2单克隆小鼠抗体与10-12个负载的MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE或奥瑞他汀T缀合，它们分别表现出旁观者活性或不表现出旁观者活性。缀合方法在美国公布号2018/0092984中进行了描述。

将CAOV3(ALPP)、COV644(ALPP+)和NCI-H1651(ALPPL2++ALPP+)肿瘤细胞与ALPP/ALPPL2抗体药物缀合物(ADC)在37℃下温育96小时。使用人IgG ADC作为阴性对照。根据制造商的说明书使用Cell Titer Glo测量细胞活力。在Fusion HT荧光酶标仪(Perk inElmer,Waltham,MA)上测量荧光信号。将数据归一化为未处理的细胞，并使用Graph Pad软件计算x50值。如图1至图2所示，Ab亚组表现出较低的x50值，其中两种有效负载表明较高的药物递送能力。

流式细胞术和饱和结合测定

用表达食蟹猴ALPP、人ALPP、ALPPL2、ALPI和ALPL的HEK293细胞评估特异性和结合亲和力。简言之，将十万个表达靶标的HEK293细胞转移至96孔板。通过离心沉淀细胞，并重悬于100μL PBS+2％w/v BSA中。封闭后，将细胞重悬于PBS+2％w/v BSA中，其中未标记的单克隆抗ALPP/ALPPL2抗体的浓度范围为8pM至666nM，并在冰上温育30分钟。将细胞在PBS中洗涤两次，并在冰上重悬于R-PE标记的山羊抗人或抗鼠二抗(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)中30分钟。通过流式细胞术证实了单克隆抗体对人和食蟹猴ALPP和ALPPL2的特异性，但对该碱性磷酸酶家族的其他成员没有特异性。使用Attune NxT流式细胞仪分析荧光，并使用饱和荧光信号的百分比来确定结合百分比并随后计算表观K

实施例3：人源化和结合研究

人源化抗体源自鼠12F3抗体。制备在不同位置掺入回复突变的八条人源化重链(HA-HH)和十二条人源化轻链(L1-LI)。在一些情况下，回复突变与鼠种系匹配，在其他情况下则不然(如体细胞突变的情况)。人源化重链和轻链配对。参见图5至图8的序列比对和表5至图8的特异性突变。

表5：h12F3可变重(vH)链变体中的人源化突变

表6：h12F3可变重链变体中的特异性鼠框架突变

表7：h12F3可变κ(vL)轻链变体中的人源化突变

表8：h12F3可变κ轻链变体中的特异性鼠框架突变

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命名为HAL1的抗体(具有命名为vHA的重链可变区和命名为vL1的轻链可变区的抗体)、命名为HAL2的抗体(具有命名为vHA的重链可变区和命名为vL2的轻链可变区的抗体)、命名为HAL3的抗体(具有命名为vHA的重链可变区和命名为vL3的轻链可变区的抗体)、命名为HALA的抗体(具有命名为vHA的重链可变区和命名为vLA的轻链可变区的抗体)、命名为HALB的抗体(具有命名为vHA的重链可变区和命名为vLB的轻链可变区的抗体)、命名为HALC的抗体(具有命名为vHA的重链可变区和命名为vLC的轻链可变区的抗体)、命名为HALD的抗体(具有命名为vHA的重链可变区和命名为vLD的轻链可变区的抗体)、命名为HALE的抗体(具有命名为vHA的重链可变区和命名为vLE的轻链可变区的抗体)、命名为HALE的抗体(具有命名为vHA的重链可变区和命名为vLE的轻链可变区的抗体)、命名为HALF的抗体(具有命名为vHA的重链可变区和命名为vLF的轻链可变区的抗体)、命名为HALG的抗体(具有命名为vHA的重链可变区和命名为vLG的轻链可变区的抗体)、命名为HALH的抗体(具有命名为vHA的重链可变区和命名为vLH的轻链可变区的抗体)和命名为HALI的抗体(具有命名为vHA的重链可变区和命名为vLI的轻链可变区的抗体)可以在本发明中用于替代HGLF抗体。类似地，具有命名为vHA、vHB、vHC、vHD、vHE、vHF、vHG或vHH的重链可变区与命名为vL1、vL2、vL3、vLA、vLB、vLC、vLD、vLE、vLF、vLG、vLH或vLI的轻链可变区的任何排列的抗体可以在本发明中用于替代HGLF抗体。vHA、vHB、vHC、vHD、vHE、vHF、vHG、vHH、vL1、vL2、vL3、vLA、vLB、vLB-Q、vLB-V、vLC、vLD、vLE、vLF、vLG、vLH和vLI序列参见图5至图8。

低质量、低表达产量或不利序列的人源化抗体未在功能测定中进行评估。使用流式细胞术评估人源化抗体对表达ALPPL2的细胞的表观亲和力。简言之，然后通过饱和结合测定确定每种所得抗体的K

表9：通过流式细胞术测定hALPP-1抗体变体在HEK-ALPPL2细胞上的结合(KD(nM))；NT＝未测试。

实施例4：h12F3缀合和体外细胞毒性

使用hIGHV3-49/hIGHJ4重链可变区人种系和hIGKV1-33/hIGKJ 2或hIGKV1D-43/hIGKJ2或hIGKV1-16/hIGKJ2轻链可变区人种系作为人受体序列构建了几种h12F3抗体。这些抗体在选择突变回小鼠抗体或小鼠种系序列的氨基酸残基方面不同。

如上所述，低质量、低表达或不利序列的人源化抗体未在功能测定中进行评估。对于药物递送评估，将各种人源化形式的h12F3抗体与8个负载的MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE奥瑞他汀T缀合。在选择潜在的抗体前导物后，对不同的有效负载进行了另外的细胞毒性评价，包括缀合与4个负载的mc-vc-PABC-MMAE或mp-dLAE-PABC-MMAE或与8个负载的MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE缀合的抗体。缀合方法在美国公布号2018/0092984中进行了描述。对于mp-dLAE-PABC-MMAE接头缀合，如PCT/US2020/051648(2020年9月18日提交)中所述，使用本文所述的人源化抗ALPP/ALPPL2抗体制备抗体药物缀合物。对于与mp-dLAE-PABC-MMAE的抗体缀合，根据US2005/0238649的程序，使用适当当量的TCEP(三(2-羧乙基)膦)部分还原抗体，该程序通过引用明确并入本文。简言之，用2.1当量TCEP处理含2mM DTPA (pH 7.4)的磷酸盐缓冲盐水中的抗体，然后在37℃下温育约45分钟。通过使还原的抗体与化合物1反应并使用疏水相互作用色谱法测定负载来检查硫醇/Ab值。

使用US2005/0238649的方法，将基于三肽的奥瑞他汀药物-接头mp-dLAE-PABC-MMAE化合物与部分还原的抗体缀合，该方法通过引用明确并入本文。简言之，将DMSO中的药物-接头化合物(mp-dLAE-PABC-MMME)(50％过量)添加到含EDTA的PBS中的还原抗体及另外的DMSO中，以获得10％-20％的总反应共溶剂。在环境温度下30分钟后，向混合物中添加过量的QuadraSil MPTM以淬灭所有未反应的马来酰亚胺基团。然后将所得ADC纯化，并通过使用Sephadex G25树脂脱盐至PBS缓冲液中来更换缓冲液，并保持在-80℃直至进一步使用。在280nm下测定所得ADC组合物的蛋白质浓度。通过疏水相互作用色谱法(HIC)测定缀合物的药物-抗体比率(DAR)。

对于体外细胞毒性测定，在ADC处理之前24小时将肿瘤细胞系铺板。用指定剂量的ADC处理细胞并在37℃下温育96小时。在一些实验中，包括非抗原结合ADC作为阴性对照。根据制造商的说明书，使用Cell Titer Glo(Promega Corporation,Madison,WI)测量细胞系的细胞活力。将细胞与Cell Titer Glo试剂在室温下温育30分钟，并在Envision酶标仪(Perkin Elmer,Waltham,MA)上测量发光。如图9所示，含有轻链F变体的h12F3抗体的人源化形式鉴定了具有高药物递送能力的变体，尤其是当与其他组合相比时。

基于细胞毒性效力和表观亲和力，进一步评估了所选人源化抗体向肿瘤细胞递送不同有效负载的能力。将具有高药物递送能力的人源化12F3抗体与4个负载的mc-vc-MMAE或mc-vc-PABC-MMAE或与8个负载的MDpr-PEG(12)-gluc MMAE缀合，如前所述。

将肿瘤细胞与每种ADC在37℃下温育96-144小时。非结合(称为h00或IgG)ADC用作阴性对照。根据制造商的说明书使用Cell Titer Glo测量细胞活力。在Fusion HT荧光酶标仪(Perkin Elmer,Waltham,MA)上测量荧光信号。将数据归一化为未处理的细胞，并使用Graph Pad软件计算IC50值。结果在表10中报告为IC

表10：h12F3 HGLF抗体药物缀合物对各种癌细胞的IC50(ng/ml)。结果报告为IC50和终点时的剩余活力百分比。

通过绘制多个细胞系的IC50值，比较使用相同有效负载(mp-dLAE-MMAE)的人源化变体的抗体药物缀合物的细胞毒性效力。12F3抗体的人源化变体在体外显示出与图10所示相似的效力。

基于命名为HGLF(如SEQ ID NO:15所示的重链可变区(vHG)和如SEQ ID NO:30所示的轻链可变区(vLF))的抗体的(i)结合特性、(ii)递送药物的能力和(iii)与其他变体相比回复突变的数目，最终选择它作为先导人源化抗ALPP/ALPPL2抗体(参见表5至表8)。

HGLF ADC对肿瘤癌细胞球状体的评估如下进行：将100uL细胞以2.5E4个细胞/孔在超低附着圆底96孔板(Corning,Corning,NY)中在37℃下48小时。温育后，添加100uL含有2X ADC的培养基并在37℃下温育120小时。在一些实验中，包括非抗原结合ADC作为阴性对照。根据制造商的说明书，使用3D Cell Titer Glo(Promega Corporation,Madison,WI)测量细胞系的细胞活力。将细胞与3D Cell Titer Glo试剂在室温下温育30分钟，并在Envision酶标仪(Perkin Elmer,Waltham,MA)上测量发光。结果报告为IC50，即与媒介物处理的细胞(对照＝100％)相比产生活力的半数最大降低所需的化合物浓度。如图11和表11所示，与基于vcMMAE、mp-dLAE-MMAE和mdpr-gluc-MMAE的接头缀合的h12F3 HGLF ADC对3D球状体表现出高细胞毒性，其效力与2D培养物中的效力相似。

表11：h12F3 HGLF ADC对肿瘤细胞3D球状体的IC50(ng/ml)值

实施例5：抗体内化

通过自动荧光显微镜(IncuCyte S3,Essen Bioscience)对RMUGS、Hep2亲本和Hep2 ALPP敲除细胞系进行内化实验。将细胞接种在96孔平底透明黑色组织培养物处理的微孔板(Corning,Corning,NY)中并在37℃下保持粘附过夜。根据制造商的方案，用IncuCyte FabFluor-pH Red抗体标记试剂(Essen Bioscience,Ann Arbor,MI)标记h12F3HGLF和非靶向对照抗体。所需的测试抗体、FabFluor试剂和培养基的体积按最终测定浓度的2倍计算，并将FabFluor试剂以与抗体1:3的摩尔比添加。将抗体和FabFlour轻轻混合并在37℃下温育15分钟，然后将抗体-FabFluor复合物添加到含有细胞的板的每个适当的孔中。每孔h12F3 HGLF和非结合对照抗体的最终浓度为250ng/mL。将板排列在IncuCyte S3(Essen Bioscience,Ann Arbor,MI)中的微孔板盘上，并使用Adherent Cell-by-Cell方案进行扫描。收集相位数据和红色通道数据(采集时间设置为400ms)，每孔4个图像，最少每0.5-2小时采集一次，持续长达20小时，物镜设置为10x。使用IncuCyte软件分析工具进行荧光信号强度的定量。利用无标记细胞计数和用于预览和算法训练的手动图像选择，对每个细胞系的分析进行细化和调整。在完成分析后，使用IncuCyte软件将数据作图，其中将图度量设置为归一化为非结合对照的每个细胞的红色平均强度对象平均值。如图12所示，h12F3HGLF在表达ALPP的细胞中内化，并且内化是特异性的，因为ALPP敲除HEP2细胞不内化裸抗体。

实施例6：动力学结合和pH敏感性

在pH 7.4，37℃下，在具有抗人Fab-CH1第二代(FAB2G)生物传感器的Octet Red384系统(ForteBio)上，通过生物层干涉测量法(BLI)测量二价亲和力。在CHO细胞中产生可溶性人ALPP-Fc和ALPPL2-Fc融合二聚体蛋白以用作分析物。将抗体h12F3 HGLF和HFLD以3ug/mL固定在生物传感器上600秒，然后将滴定的分析物hALPP和hALPPL2以0.12-125nM范围内的6个浓度结合600秒，然后在动力学缓冲液(1％酪蛋白和0.2％ Tween20的1×PBS pH7.4溶液)中进行最后50分钟的解离步骤。在减去仅探针曲线的参考后，数据与Rmax传感器未连接的1:1模型进行全局拟合。使用浓度31.3、7.8、1.95、0.49和0.12nM的曲线拟合，h12F3 HGLF与hALPP和hALPPL2的二价结合分别测量为1.3E-10M(k

为了评估pH敏感性，使用与pH 7.4实验相同的BLI方法测定在pH 6.0、37℃下的二价亲和力。唯一的区别是使用了不同的动力学缓冲液(1％酪蛋白和0.2％ Tween20的磷酸柠檬酸盐溶液，pH 6.0)。使用800秒的解离和浓度125、31.3、7.8、1.95、0.49和0.12nM的曲线拟合，h12F3 HGLF与hALPP和hALPPL2的二价结合分别测量为6.8E-09M(k

实施例7：体内抗肿瘤活性

用5×10

对于卵巢肿瘤模型CAOV3，未处理的小鼠和用3和5mg/kg h12F3 HGLF或HFLD-dLAE-MMAE处理的小鼠随时间的所得肿瘤体积示于图15中。对于胃肿瘤模型NCI-N87，未处理的小鼠和用1和3mg/kg h12F3 HGLF或HFLD-dLAE-MMAE处理的小鼠随时间的所得肿瘤体积示于图16中。对于胃肿瘤模型NCI-N87，未处理的小鼠和用与vc-MMAE和dLAE-MMAE缀合的3mg/kg h12F3 ADC处理的小鼠随时间的所得肿瘤体积示于图17中。ALPP ADC在体内显示出类似的抗肿瘤活性。

对于肺肿瘤模型NCI-H1651，未处理的小鼠和用与vc-MMAE和dLAE-MMAE缀合的3mg/kg h12F3 ADC处理的小鼠随时间的所得肿瘤体积示于图18中。ALPP ADC在体内显示出类似的抗肿瘤活性。七种异种移植物模型中的所得肿瘤生长抑制示于图19中。柱状图总结了处理组相对于对照的％肿瘤体积变化。比较是在3mg/kg与vc-MMAE和dLAE-MMAE缀合的h12F3-HFLD ADC下进行的。非结合ADC对照的平均抗肿瘤活性由虚线显示。

在另一组测定中，NSG小鼠皮下接种5×10

对于胃肿瘤模型NCI-N87，未处理的小鼠和用与vc-MMAE和dLAE-MMAE缀合的1或3mg/kg h12F3 ADC处理的小鼠随时间的所得肿瘤体积示于图20中。ALPP ADC在体内显示出类似的抗肿瘤活性。

对于胰腺肿瘤模型HPAC，未处理的小鼠和用与mc-vc-MMAE和mp-dLAE-MMAE缀合的1或3mg/kg h12F3 ADC处理的小鼠随时间的所得肿瘤体积示于图21中。ALPP ADC在体内显示出类似的抗肿瘤活性。四种异种移植物模型中的所得肿瘤生长抑制示于图22中。柱状图总结了处理组相对于对照的肿瘤体积变化百分比。比较是在3mg/kg与vc-MMAE和dLAE-MMAE缀合的h12F3-HGLF ADC下进行的。非结合ADC对照的平均抗肿瘤活性由虚线显示。

在另一测定中，使用2+2实验设计在裸鼠中对十二个患者来源的异种移植物进行了抗肿瘤活性。简言之，当足够的储备动物的肿瘤达到1.0-1.5cm

实施例8：交叉反应性和表位作图

为了证实抗体与直系同源物ALPP蛋白的交叉反应性，将食蟹猕猴(macacafalsicularis)ALPP基因(NHP ALPP)转染到HEK293细胞中，并通过流式细胞术筛选抗体。简言之，然后通过饱和结合测定确定每种所得抗体的KD。将稳定表达人ALPPL或ALPPL2以及NHP ALPP的1×105个HEK293细胞等分至96孔v型底板的每个孔中。添加浓度范围为0.2nM至20nM的h12F3 HGLF和HFLD抗体，并在冰上温育60分钟。将细胞沉淀并用PBS/BSA洗涤3次，然后添加10ug/ml的APC标记的抗人IgG山羊二抗，并在冰上再温育60分钟。将细胞沉淀并用PBS/BSA洗涤3次，并重悬于125μL PBS/BSA中。通过流式细胞术分析荧光，使用饱和荧光信号的百分比来确定结合百分比并随后计算表观KD。两种抗体的表观K

由于h12F3 HGLF不与大鼠ALPP/ALPPL2直系同源物交叉反应，因此将人ALPP区域与来自大鼠ALPP的同源物区域交换。根据制造商的说明书，使用lipofectamine 3000(1:1.5DNA/lipofectamine比率)将这些构建体瞬时转染至2×10

实施例9：抗体与Fc受体的动力学结合

基于抗体的免疫反应由与免疫细胞上的Fc受体的相互作用驱动。因此，为了确定h12F3 HGLF、h12F3 HGLF-mc-vc-MMAE或h12F3HGLF-mp-dLAE-MMAE与Fc受体相互作用的能力，通过生物层干涉测量法(BLI)评估与hFcγRI、hFcγRIIa H131、hFcγRIIa R131、hFcγRIIIa F158、hFcγRIIIa V158和hscFcRN的结合动力学。将与单体Fc融合的生物素化的avi-标记的人Fc受体(在Seagen设计和表达)装载到高精度链霉亲和素生物传感器(来自ForteBio)上，所有受体在0.4nm附近反应，但hFcγR1在1.2nm附近反应。在固定缓冲液(0.1％BSA、0.02％ Tween 20、1x PBS pH 7.4)中完成初始基线，然后在动力学缓冲液(1％酪蛋白、0.2％ Tween 20、1x PBS pH 7.4用于hFcγRI、IIa、IIIa和IIb相互作用，1％ BSA+0.2％ Tween 20、磷酸柠檬酸盐pH 6.0用于hscFcRN相互作用)中完成第二基线。滴定的h12F3 HGLF、h12F3HGLF-mc-vc-MMAE、h12F3 HGLF-mp-dLAE-MMAE和阳性对照mAb样品如下结合和解离：在动力学缓冲液中，hFcγRI分别为600s和1000s，hFcγRIIa和hFcγRIIb为10s和50s，hFcγRIIIa为60s和200s，并且hscFcRN为50s和200s。在30℃下在Octet HTX系统(ForteBio)上生成传感图，并在减去负载抗原的0nM分析物传感器的参考后，用1:1动力学Langmuir等温线模型(Rmax未连接)进行全局拟合。还包括具有最高浓度的抗体和未固定Fc受体的ADC(20μM)的阴性对照，以验证分析物与链霉亲和素生物传感器本身不存在非特异性结合。列出了链霉亲和素传感器的每种受体的比装载浓度和时间及滴定分析物的浓度(表12和表13)。总之，亲本抗体和mc-vc-MMAE ADC结合所有人Fc受体，如图26所示。对hFcγRI的亲和力最高，范围为约1.3-2.2nM，而对hFcRN的亲和力次之，为约10.6-13.9nM。hFcγRIIa和hFcγRIIIa变体的亲和力范围为0.81-7.3μM，而hFcγRIIb显示出最弱亲和力范围为36-67μM。与阳性对照mAb结果相比，h12F3 HGLF-mc-vc-MMAE和h12F3 HGLF-mp-dLAE-MMAE对所有人Fc受体的亲和力与亲本抗体h12F3 HGLF非常相似且相当。

表12：链霉亲和素生物传感器上的固定浓度和时间

表11：分析物浓度

1.-对于使用mc-vc-MMAE和mp-dLAE-MMAE的基于12F3HGLF的缀合物，使用相同的浓度

原代NK细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)

为了确定h12F3 HGLF主链和衍生的缀合物是否引起抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，在h12F3 HGLF、h12F3 HGLF-mc-vc-MMAE或h12F3 HGLF-mp-dLAE-MMAE的存在下，将表达ALPPL2的细胞与天然杀伤(NK)细胞在体外温育。温育后，测量细胞裂解的百分比。简言之，效应细胞制备：在测定前一天，将外周血单核细胞(PBMC)在37℃水浴中快速解冻。将细胞转移到含有补充有5％热灭活的人血清(Gemini Bio-products，目录号100-512)(AIM-V/5％HIHS)的AIM-V培养基(Gibco，目录号12055091)的50mL试管中。将细胞以1500rpm离心10分钟。将PBMC以20μg/mL的最终浓度重悬于含有DNase I(Sigma-Aldrich，目录号D5025)的AIM-V/5％ HIHS(用1mg/mL储备溶液进行1:50稀释)中，并在37℃下温育10至15分钟。如上离心沉淀细胞并将其重悬于AIM-V/5％ HIHS中。对细胞进行计数并以2-4×108个细胞/烧瓶的浓度接种在T150烧瓶中，每个烧瓶25mL。将细胞在37℃、5％ CO2、湿润培养箱中不受干扰地温育过夜。第二天，收集非粘附细胞，并用PBS剧烈冲洗烧瓶3次(7mL)。将冲洗液与非粘附细胞合并，并通过以1500rpm离心7分钟沉淀。将细胞以小体积(2mL)重悬以进行计数，并将细胞悬液在PBS+2％FBS中调节至5×107个细胞/mL的浓度(按照EasySep方案推荐)。按照EasySep Human NK细胞富集试剂盒(干细胞技术，目录号19055)说明书，通过负选择分离NK细胞。然后将富集的效应细胞以7.2×105个细胞/mL的浓度悬浮于RPMI/1％ FBS中(使得70μL含有约5×104个效应细胞)。靶细胞制备：收集表达ALPPL2的LoVo细胞并计数。接着，取出5×106个细胞并通过离心沉淀。将细胞重悬于100μL的FBS中。然后，将100μL(约100μCi)Cr-51(Perkin Elmer Hea lth Sciences,Inc.，目录号NEZ030S)添加到细胞中并通过轻轻敲击来混合。将细胞置于37℃、5％ CO2、湿润培养箱中标记1小时，偶尔轻敲试管使细胞悬浮。用RPMI/1％ FBS洗涤细胞3次。在洗涤之间轻敲试管以松开细胞沉淀。洗涤后，将细胞重悬于10mL RPMI/1％FBS中并计数。然后，取出7.2×105个细胞并悬浮在总体积为10mL的测定培养基中，使得70μL相当于～5×103个靶细胞。ADC和抗体稀释液的制备和板组装：将抗体和ADC以3x浓度稀释在测定培养基中。测试的抗体是h12F3 HGLF、h12F3 HGLF-mc-vc-MMAE或h12F3 HGLF-mp-dLAE-MMAE、结合CD71的无岩藻糖基化抗体和同种型对照。在添加Cr-标记的靶细胞之前将抗体添加到测定板中。此外，分别将70μL和140μL测定培养基代替抗体添加到代表总释放对照和自发释放对照的对照孔中。最后，将靶细胞混合，并向96孔板的每个测试孔和对照孔中添加70μL。将靶标与mAb在37℃、5％ CO 2、湿润培养箱中温育30分钟。然后，将70μL(5×104)效应细胞添加到每个测试孔中，同时将70μL 3％ Triton X-100添加到总释放孔中并混合。将板放回37℃、5％、CO2、湿润培养箱中4小时。温育后，将35μL上清液转移至Luma板。将Luma板干燥过夜，然后用密封带覆盖并在Perkin Elmer TopCount NXT微板闪烁计数器上读数。通过如下计算％特异性裂解进行分析(用GraphPad Prism分析)：％特异性裂解＝[(测试cpm-背景cpm)÷(总cpm-背景cpm)]×100。如图27所示，在h12F3 HGLF抗体以及h12F3 HGLF-mc-vc-MMAE和h12F3 HGLF-mp-dLAE-MMAE存在下，在体外介导NK细胞细胞毒性。该活性与阳性对照相似，并且由于非结合抗体不能刺激效应细胞，因此由细胞上靶标的存在介导。

抗体依赖性细胞毒性

为了确定h12F3 HGLF、h12F3 HGLF-mc-vc-MMAE或h12F3HGLF-mp-dLAE-MMAE是否显示出ADCP活性，将表达ALPP/ALPPL2的抗体或ADC包被的荧光细胞与原代巨噬细胞共温育，并用荧光流式细胞术测量吞噬作用。简言之，根据制造商的说明书，用PKH26对LoVo肿瘤细胞进行荧光标记。用0.05％胰蛋白酶EDTA从培养皿中收获细胞，并用1xPBS洗涤一次。将细胞重悬于PKH26红色荧光细胞膜标记试剂盒(Sigma-Aldrich，目录号PKH26GL-1KT)中包含的1mL稀释剂C中。在单独的试管中，添加1mL稀释剂C+4μL PKH26染料并上下移液以混合。将染色溶液转移到重悬的细胞中，并通过上下移液多次快速混合。将细胞在室温下温育5分钟，并通过添加2mL FBS终止标记反应。将细胞用RPMI/10％ FBS洗涤3次，并以0.8×106个细胞/mL的浓度重悬于PBS中。将标记的靶细胞转移到96孔U形底板中，并使用以下步骤用测试抗体、ADC或同种型对照抗体处理。在单独的96孔U形底板中，将10倍mAb、ADC和同种型对照在PBS中的储备液在PBS中以1:10连续稀释，并将33μL/孔添加到U形底板中细胞的适当孔中。将板在室温下温育30分钟，离心，并用200μL/孔培养基(RPMI/10％ FBS)洗涤一次。将细胞重悬于330μL/孔培养基(RPMI/10％ FBS)中。在测定前一天，将来自2名健康捐献者的PBMC在37℃水浴中解冻并转移到RPMI/10％ FBS(0.1-0.2EU/mL)中。将每孔总共0.7×106个PBMC添加到48孔平底板中并使其粘附过夜。吸出旧培养基(和非粘附细胞)并用200μL新鲜培养基替换。接着，将每个孔中的100μL标记的、处理的靶细胞一式三份转移到粘附的单核细胞/巨噬细胞平底板的相应孔中，并将板在37℃下温育过夜16-18小时。通过收集上样液、用1x PBS收集洗涤液并用1x Versene分离来收获48孔板中的所有细胞。使用以下步骤对巨噬细胞进行荧光标记：将靶细胞和巨噬细胞收集在U形底板中，离心，重悬于含有人Fc片段封闭剂(1:20稀释)的50μLFACS染色缓冲液中，并在冰上温育30分钟。接着，将50μL在FACS染色缓冲液中稀释的CD14-BV421和CD45-APC-Cy7抗体的1:50稀释液添加到每个孔中，并在箔中在冰上温育30分钟。将细胞离心，用FACS缓冲液洗涤2次，并重悬于1x PBS中，用于随后在Attune NxT流式细胞仪上进行流式细胞术分析。使用FlowJo分析CD14+/CD45细胞的YL1 GeoMean荧光(CD14+/CD45+细胞的MFI)，然后将值导出到Excel和GraphPad Prism中以进行进一步的数据分析。吞噬作用被报告为CD14+细胞的MFI。如图28所示，h12F3 HGLF、h12F3HGLF-mc-vc-MMAE或h12F3 HGLF-mp-dLAE-MMAE缀合物的存在使得能够以与阳性对照(抗CD47抗体)相似的动力学吞噬靶表达细胞。该活性取决于靶细胞上ALPPL2表达的存在，因为非结合抗体不会引起任何细胞死亡。

在另一测定中，通过使用Promega的基于替代萤光素酶介导的生物测定测量FcgRIII依赖性抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。简言之，将表达ALPP/ALPPL2的细胞铺在96孔板上，并在增加量的裸h12F3抗体或分别与4或8个mc-vc-PABC-MMAE或MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE分子缀合的h12F3 HGLF抗体存在下与ADCC生物测定效应细胞(Promega)共培养。处理后24小时，根据制造方法用Bio-Glo(Promega)温育细胞并用Envision平台测量发光。如图29所示，h12F3HGLF能够以与h12F3 HGLF ADC缀合的mc-vc-PABC-MMAE类似的动力学激活报告细胞系中的FcgRIII信号传导。与裸h12F3 HGLF相比，与8个MDpr-PEG(12)-gluc-MMAE分子的缀合降低了ADCC活性。

实施例10：免疫原性细胞死亡

用于免疫原性细胞死亡的信号途径激活

为了确定h12F3 HGLF-mc-vc-MMAE和h12F3 HGLF-mp-dLAE-MMAE是否可以激活ICD的标志，用ADC处理表达ALPP/ALPPL 2的细胞，并使用免疫印迹法确定IRE和JNK途径的磷酸化状态。简言之，将四百万个LOVO细胞铺在10cm TC处理的培养皿中的10mL竞争生长培养基(Ham's F-12K(Kaighn's)培养基+10％ FBS)中，并使其粘附过夜。在完全培养基中用10nMMMAE或1和10ug/mL的h12F3 HGLF-mc-vc-MMAE或h12F3 HGLF-mp-dLAE-MM AE处理细胞。然后将细胞在经过处理的培养基中温育48或96小时。收集细胞，洗涤并重悬于500uL冷PBS中并转移至Eppendorf管中。将样品以300xg、4度旋转3分钟。除去上清液，并将细胞重悬于含有蛋白酶和磷酸酶的RIPA裂解缓冲液中。在冰上温育5分钟后，将样品以17000xg、4度旋转10分钟，收集上清液，并储存在-80℃。将定量的样品在NuPAGE 4％-12％bis-tris凝胶中分离，并在MES运行缓冲液中运行较小的蛋白质，或在MOPS中运行较大的蛋白质(165v 40分钟)。使用iBlot2(20v，7分钟)将凝胶转移至PVDF膜。将膜在DI水中短暂冲洗，然后在4度下置于封闭缓冲液(TBS+0.1％tween-20+5％ BSA)中过夜。然后将印迹与针对IRE、JNK、p-IRE或p-JNK的一抗以1:1000稀释度在封闭缓冲液中在室温下温育2小时。p-ERK以1:500使用并以相同方式温育。用TBST(TBS+0.1％Tween-20)洗涤印迹3次。在封闭缓冲液中以1:10,000稀释度制备抗兔过氧化物酶二抗。将印迹与二抗在室温下温育1小时。用TBST再次洗涤印迹3次。使用SignalFire ECL进行印迹分析并在AmershamImager 600上成像。然后将印迹剥离并重新探测GAPDH作为上样对照并如上所述进行印迹分析。如图30所示，用h12F3 HGLF-mc-vc-MMAE或h12F3 HGLF-mp-dLAE-MMAE温育LoVo细胞增加了pI RE和pJNK的磷酸化水平，这在免疫原性细胞死亡过程的激活中起关键作用。

为了确定用h12F3 HGLF ADC先导物处理是否导致培养基中的ATP释放，将600,000个LOVO细胞铺在6孔TC处理的培养皿中的2mL竞争生长培养基(Ham's F-12K(Kaighn's)培养基+10％ FBS)中，并使其粘附过夜。在完全培养基中制备10nM MMAE，1或10μg/mL h12F3HGLF mp-dLAE-MMAE或mc-vc-MMAE的溶液。然后将细胞在经过处理的培养基中温育24、48或72小时。在每个终点，从每个孔(样品)收集500uL上清液。将上清液以200xg、4度旋转1分钟以小心地除去任何细胞碎片。然后将每种上清液的3个50uL等分试样(用于一式三份数据)置于黑壁、透明底96孔板中。然后向含有上清液的所有孔中添加50uL重构Cell Titer Glo。将板覆盖并避光。然后在Envision酶标仪上读板。将所有样品的一式三份数据的原始发光数据进行平均。为了确定与未处理样品相比的倍数变化，将实验样品的平均发光除以未处理样品的平均值。如图31所示，h12F3 HGLF mp-dLAE-MMAE或mc-vc-MMAE缀合物均导致ATP的释放，这是免疫原性细胞死亡的标志。

实施例11：药代动力学

在非人灵长类动物中进行了人源化h12F3 ADC的药代动力学评评估。将包含h12F3HGLF-vc-MMAE(4)和HGLF-dLAE-MMAE(4)的抗体药物缀合物以1mg/kg给药一次，并在指定的时间点收集血浆样品。使用Gyrolab(Gyros Protein Technologies,Sweden)1步通用总抗体(gTAb)测定法分析总h12F3 HGLF-vc-MMAE(4)和HGLF-dLA E-MMAE(4)食蟹猴血浆水平。简言之，用在合并的食蟹猴K2EDTA血浆(BioIVT)中稀释的给药供试品制备测定标准品和质量控制样品(QC)。将供试品浓度超出测定定量限的研究样品用未接触过药物的食蟹猴K2EDTA血浆稀释至一定范围。将标准品、QC和研究样品在Rexxip HX缓冲液(Gyros ProteinTechnologies,Sweden)中稀释至1:20的最小所需稀释度(MRD)。通过在含有0.01％(v/v)tween-20(PBST)的1x磷酸盐缓冲盐水溶液中稀释生物素化抗人κ轻链(Seagen)和AlexaFlour-647抗人Fcγ(Jackson Immunoresearch)制备30nM等摩尔主混合溶液。混合等体积的MRD标准品，QC或研究样品和主混合溶液。将所得溶液避光温育，在室温下振摇1-2小时。温育后，将溶液转移至96孔PCR板中，并添加到Gyrolab Bioaffy 1000CD(GyrosProtein Technologies,Sweden)中，其中使样品通过CD内的链霉亲和素亲和柱。用PBST洗涤柱4次，并在635nm处检测柱上的相关荧光。使用Gyrolab Evaluator软件将校准物的荧光反应拟合至5参数逻辑回归(5-PL)。总h12F3 HGLF-vcMMAE和HGLF-dLAE-MMAE QC和研究样品浓度根据各自的拟合标准曲线进行内插，并用于药代动力学评估。适当时，使用PhoenixWinNonlin(8.2版，Certara USA,Inc.)通过非房室分析(NCA)确定PK参数。确定以下PK参数：至21天的血浆浓度-时间曲线下面积(AUC0-21)、观察到的最大血浆浓度(Cmax)、终末半衰期、清除率(Cl)和计算的稳态分布体积(Vss)。使用线性梯形线性方法计算AUC。对于调节R2≥0.8和外推AUC0-inf<20％的血浆浓度-时间曲线，报告半衰期、Cl和Vss。所得药代动力学参数见表14，显示与vcMMAE和mp-dLAE-MMAE两者的h12F3 HG LF缀合物显示出相似的抗体缀合的MMAE药代动力学特征，当与非结合ADC对照相比时，没有靶标介导的药物处置的证据。

表14

为了定量抗体缀合的MMAE(acMMAE)，血浆样品首先在2-8℃进行免疫捕获以分离ADC(MAbSelect,GE Healthcare)一小时。使用木瓜蛋白酶消化缓冲液(20mM KPO4、10mMEDTA、20mM半胱氨酸HCl)洗涤结合的样品，然后将消化缓冲液中的2mg/mL木瓜蛋白酶添加到每个样品中。将样品在37℃下温育四小时以酶促释放acMMAE。使用固相萃取来萃取所得释放的acMMAE。然后使用正相UPLC(Betasil,ThermoFisher)结合串联质谱法(Sciex 6500+Triple Quad)分析每个样品。表15示出了使用h12F3 HGLF vc-MMAE和HGLF-dLAE-MMAE缀合物的抗体缀合的MMAE的类似药代动力学参数，其中后者显示出延长的半衰期。

表15

h12F3 HGLF ADC的耐受性在食蟹猴中进行了评估，食蟹猴作为药理学相关物种，与人和食蟹猴ALPP直系同源物具有相当的结合亲和力。对雌性猴分别施用5mg/kg的h12F3HGLF-vc-MMAE(4)或5、8、9和10mg/kg的h12F3 HGLF-dLAE-MMAE(4)，每周一次，持续四周(q1wx4)。毒理学评估包括体重、临床观察、血液学、凝血、血清化学和TK。在终末期(最后一次给药后1周)和恢复期(最后一次给药后4周)尸检时，进行大体病理学检查，并对组织进行组织病理学检查。h12F3 HGLF-vc-MMAE(4)的最大耐受剂量为5mg/kg，并且h12F3 HGLF-dLAE-MMAE(4)的最大耐受剂量为9mg/kg(表16)。通过血液学和解剖病理学评估检测两种ADC的与MMAE药理学一致的骨髓毒性，并考虑剂量限制性毒性。肺部肺泡巨噬细胞积聚、卵巢中二级和三级卵泡数量减少及胸腺中淋巴样耗竭的其他毒性

表16

通过引用并入

本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、科学论文、教科书等，均通过引用整体并入。

序列表

<110> 思进股份有限公司

<120> 抗ALPP/ALPPL2抗体和抗体-药物缀合物

<130> 5620-00112PC

<150> US 63/162,635

<151> 2021-03-18

<150> US 63/301,574

<151> 2022-01-21

<160> 74

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1608

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

atgctggggc cctgcatgct gctgctgctg ctgctgctgg gcctgaggct acagctctcc 60

ctgggcatca tcccagttga ggaggagaac ccggacttct ggaaccgcga ggcagccgag 120

gccctgggtg ccgccaagaa gctgcagcct gcacagacag ccgccaagaa cctcatcatc 180

ttcctgggcg atgggatggg ggtgtctacg gtgacagctg ccaggatcct aaaagggcag 240

aagaaggaca aactggggcc tgagataccc ctggccatgg accgcttccc atatgtggct 300

ctgtccaaga catacaatgt agacaaacat gtgccagaca gtggagccac agccacggcc 360

tacctgtgcg gggtcaaggg caacttccag accattggct tgagtgcagc cgcccgcttt 420

aaccagtgca acacgacacg cggcaacgag gtcatctccg tgatgaatcg ggccaagaaa 480

gcagggaagt cagtgggagt ggtaaccacc acacgagtgc agcacgcctc gccagccggc 540

acctacgccc acacggtgaa ccgcaactgg tactcggacg ccgacgtgcc tgcctccgcc 600

cgccaggagg ggtgccagga catcgctacg cagctcatct ccaacatgga cattgacgtg 660

atcctaggtg gaggccgaaa gtacatgttt cgcatgggaa ccccagaccc tgagtaccca 720

gatgactaca gccaaggtgg gaccaggctg gacgggaaga atctggtgca ggaatggctg 780

gcgaagcgcc agggtgcccg gtatgtgtgg aaccgcactg agctcatgca ggcttccctg 840

gacccgtctg tgacccatct catgggtctc tttgagcctg gagacatgaa atacgagatc 900

caccgagact ccacactgga cccctccctg atggagatga cagaggctgc cctgcgcctg 960

ctgagcagga acccccgcgg cttcttcctc ttcgtggagg gtggtcgcat cgaccatggt 1020

catcatgaaa gcagggctta ccgggcactg actgagacga tcatgttcga cgacgccatt 1080

gagagggcgg gccagctcac cagcgaggag gacacgctga gcctcgtcac tgccgaccac 1140

tcccacgtct tctccttcgg aggctacccc ctgcgaggga gctccatctt cgggctggcc 1200

cctggcaagg cccgggacag gaaggcctac acggtcctcc tatacggaaa cggtccaggc 1260

tatgtgctca aggacggcgc ccggccggat gttaccgaga gcgagagcgg gagccccgag 1320

tatcggcagc agtcagcagt gcccctggac gaagagaccc acgcaggcga ggacgtggcg 1380

gtgttcgcgc gcggcccgca ggcgcacctg gttcacggcg tgcaggagca gaccttcata 1440

gcgcacgtca tggccttcgc cgcctgcctg gagccctaca ccgcctgcga cctggcgccc 1500

cccgccggca ccaccgacgc cgcgcacccg gggcggtccg tggtccccgc gttgcttcct 1560

ctgctggccg ggaccctgct gctgctggag acggccactg ctccctga 1608

<210> 2

<211> 535

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Leu Gly Pro Cys Met Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Arg

1 5 1015

Leu Gln Leu Ser Leu Gly Ile Ile Pro Val Glu Glu Glu Asn Pro Asp

202530

Phe Trp Asn Arg Glu Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ala Ala Lys Lys Leu

354045

Gln Pro Ala Gln Thr Ala Ala Lys Asn Leu Ile Ile Phe Leu Gly Asp

505560

Gly Met Gly Val Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln

65707580

Lys Lys Asp Lys Leu Gly Pro Glu Ile Pro Leu Ala Met Asp Arg Phe

859095

Pro Tyr Val Ala Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Val Asp Lys His Val Pro

100 105 110

Asp Ser Gly Ala Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn

115 120 125

Phe Gln Thr Ile Gly Leu Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys Asn

130 135 140

Thr Thr Arg Gly Asn Glu Val Ile Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Lys

145 150 155 160

Ala Gly Lys Ser Val Gly Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala

165 170 175

Ser Pro Ala Gly Thr Tyr Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser

180 185 190

Asp Ala Asp Val Pro Ala Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp Ile

195 200 205

Ala Thr Gln Leu Ile Ser Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly

210 215 220

Gly Arg Lys Tyr Met Phe Arg Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr Pro

225 230 235 240

Asp Asp Tyr Ser Gln Gly Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu Val

245 250 255

Gln Glu Trp Leu Ala Lys Arg Gln Gly Ala Arg Tyr Val Trp Asn Arg

260 265 270

Thr Glu Leu Met Gln Ala Ser Leu Asp Pro Ser Val Thr His Leu Met

275 280 285

Gly Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp Ser

290 295 300

Thr Leu Asp Pro Ser Leu Met Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Arg Leu

305 310 315 320

Leu Ser Arg Asn Pro Arg Gly Phe Phe Leu Phe Val Glu Gly Gly Arg

325 330 335

Ile Asp His Gly His His Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Leu Thr Glu

340 345 350

Thr Ile Met Phe Asp Asp Ala Ile Glu Arg Ala Gly Gln Leu Thr Ser

355 360 365

Glu Glu Asp Thr Leu Ser Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val Phe

370 375 380

Ser Phe Gly Gly Tyr Pro Leu Arg Gly Ser Ser Ile Phe Gly Leu Ala

385 390 395 400

Pro Gly Lys Ala Arg Asp Arg Lys Ala Tyr Thr Val Leu Leu Tyr Gly

405 410 415

Asn Gly Pro Gly Tyr Val Leu Lys Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val Thr

420 425 430

Glu Ser Glu Ser Gly Ser Pro Glu Tyr Arg Gln Gln Ser Ala Val Pro

435 440 445

Leu Asp Glu Glu Thr His Ala Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala Arg

450 455 460

Gly Pro Gln Ala His Leu Val His Gly Val Gln Glu Gln Thr Phe Ile

465 470 475 480

Ala His Val Met Ala Phe Ala Ala Cys Leu Glu Pro Tyr Thr Ala Cys

485 490 495

Asp Leu Ala Pro Pro Ala Gly Thr Thr Asp Ala Ala His Pro Gly Arg

500 505 510

Ser Val Val Pro Ala Leu Leu Pro Leu Leu Ala Gly Thr Leu Leu Leu

515 520 525

Leu Glu Thr Ala Thr Ala Pro

530 535

<210> 3

<211> 1599

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

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atcccagttg aggaggagaa cccggacttc tggaaccgcc aggcagccga ggccctgggt 120

gccgccaaga agctgcagcc tgcacagaca gccgccaaga acctcatcat cttcctgggt 180

gacgggatgg gggtgtctac ggtgacagct gccaggatcc taaaagggca gaagaaggac 240

aaactggggc ctgagacctt cctggccatg gaccgcttcc cgtacgtggc tctgtccaag 300

acatacagtg tagacaagca tgtgccagac agtggagcca cagccacggc ctacctgtgc 360

ggggtcaagg gcaacttcca gaccattggc ttgagtgcag ccgcccgctt taaccagtgc 420

aacacgacac gcggcaacga ggtcatctcc gtgatgaatc gggccaagaa agcaggaaag 480

tcagtgggag tggtaaccac cacacgggtg cagcatgcct cgccagccgg cgcctacgcc 540

cacacggtga accgcaactg gtactcggat gccgacgtgc ctgcctcggc ccgccaggag 600

gggtgccagg acatcgccac gcagctcatc tccaacatgg acattgatgt gatcctaggt 660

ggaggccgaa agtacatgtt tcccatgggg accccagacc ctgagtaccc agatgactac 720

agccaaggtg ggaccaggct ggacgggaag aatctggtgc aggaatggct ggcgaagcac 780

cagggtgccc ggtacgtgtg gaaccgcact gagctcctgc aggcttccct ggacccgtct 840

gtgacccatc tcatgggtct ctttgagcct ggagacatga aatacgagat ccaccgagac 900

tccacactgg acccctccct gatggagatg acagaggctg ccctgctcct gctgagcagg 960

aacccccgcg gcttcttcct cttcgtggag ggtggtcgca tcgaccatgg tcatcatgaa 1020

agcagggctt accgggcact gactgagacg atcatgttcg acgacgccat tgagagggcg 1080

ggccagctca ccagcgagga ggacacgctg agcctcgtca ctgccgacca ctcccacgtc 1140

ttctccttcg gaggctaccc cctgcgaggg agctccatct tcgggctggc ccctggcaag 1200

gcccgggaca ggaaggccta cacggtcctc ctatacggaa acggtccagg ctatgtgctc 1260

aaggacggcg cccggccgga tgttacggag agcgagagcg ggagccccga gtatcggcag 1320

cagtcagcag tgcccctgga cggagagacc cacgcaggcg aggacgtggc ggtgttcgcg 1380

cgcggcccgc aggcgcacct ggttcacggc gtgcaggagc agaccttcat agcgcacgtc 1440

atggccttcg ccgcctgcct ggagccctac accgcctgcg acctggcgcc ccgcgccggc 1500

accaccgacg ccgcgcaccc ggggccgtcc gtggtccccg cgttgcttcc tctgctggca 1560

gggaccttgc tgctgctggg gacggccact gctccctga 1599

<210> 4

<211> 532

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

Met Gln Gly Pro Trp Val Leu Leu Leu Leu Gly Leu Arg Leu Gln Leu

1 5 1015

Ser Leu Gly Ile Ile Pro Val Glu Glu Glu Asn Pro Asp Phe Trp Asn

202530

Arg Gln Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ala Ala Lys Lys Leu Gln Pro Ala

354045

Gln Thr Ala Ala Lys Asn Leu Ile Ile Phe Leu Gly Asp Gly Met Gly

505560

Val Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly Gln Lys Lys Asp

65707580

Lys Leu Gly Pro Glu Thr Phe Leu Ala Met Asp Arg Phe Pro Tyr Val

859095

Ala Leu Ser Lys Thr Tyr Ser Val Asp Lys His Val Pro Asp Ser Gly

100 105 110

Ala Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly Asn Phe Gln Thr

115 120 125

Ile Gly Leu Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys Asn Thr Thr Arg

130 135 140

Gly Asn Glu Val Ile Ser Val Met Asn Arg Ala Lys Lys Ala Gly Lys

145 150 155 160

Ser Val Gly Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His Ala Ser Pro Ala

165 170 175

Gly Ala Tyr Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr Ser Asp Ala Asp

180 185 190

Val Pro Ala Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp Ile Ala Thr Gln

195 200 205

Leu Ile Ser Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly Gly Gly Arg Lys

210 215 220

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225 230 235 240

Ser Gln Gly Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu Val Gln Glu Trp

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260 265 270

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275 280 285

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325 330 335

Gly His His Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Leu Thr Glu Thr Ile Met

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355 360 365

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465 470 475 480

Met Ala Phe Ala Ala Cys Leu Glu Pro Tyr Thr Ala Cys Asp Leu Ala

485 490 495

Pro Arg Ala Gly Thr Thr Asp Ala Ala His Pro Gly Pro Ser Val Val

500 505 510

Pro Ala Leu Leu Pro Leu Leu Ala Gly Thr Leu Leu Leu Leu Gly Thr

515 520 525

Ala Thr Ala Pro

530

<210> 5

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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1 5 1015

Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

202530

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu

354045

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505560

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65707580

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100 105 110

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<210> 6

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 6

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 1015

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202530

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu

354045

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505560

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile

65707580

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr

859095

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 7

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1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr

202530

Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

354045

Gly Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Thr Ala

505560

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Ser Lys Ser Ile

65707580

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

859095

Tyr Cys Thr Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

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<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His

202530

Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

354045

Gly Arg Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala

505560

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65707580

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859095

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100

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<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr

202530

Tyr Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

354045

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505560

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Ser Lys Ser Ile

65707580

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859095

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100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> h12F3 vHB

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

202530

Tyr Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

354045

Gly Leu Ile Arg Asn Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala

505560

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Ile

65707580

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

859095

Tyr Cys Thr Arg Ala Ser Phe Tyr Tyr Asp Gly Lys Val Leu Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> h12F3 vHC

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

202530

Tyr Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

354045

Ala Leu Ile Arg Asn Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala

505560

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Ile

65707580

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

859095

Tyr Cys Thr Arg Ala Ser Phe Tyr Tyr Asp Gly Lys Val Leu Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 12

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> h12F3 vHD

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

202530

Tyr Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

354045

Gly Leu Ile Arg Asn Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala

505560

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Ile

65707580

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

859095

Tyr Cys Ala Arg Ala Ser Phe Tyr Tyr Asp Gly Lys Val Leu Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<210> 13

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> h12F3 vHE

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

202530

Tyr Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

354045

Ala Leu Ile Arg Asn Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala

505560

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Ile

65707580

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

859095

Tyr Cys Ala Arg Ala Ser Phe Tyr Tyr Asp Gly Lys Val Leu Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 14

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> h12F3 vHF

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

202530

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

354045

Ala Leu Ile Arg Asn Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala

505560

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Ile

65707580

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

859095

Tyr Cys Ala Arg Ala Ser Phe Tyr Tyr Asp Gly Lys Val Leu Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 15

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> h12F3 vHG

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

202530

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

354045

Ala Leu Ile Arg Asn Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Thr Ala

505560

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Ile

65707580

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

859095

Tyr Cys Ala Arg Ala Ser Phe Tyr Tyr Asp Gly Lys Val Leu Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

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<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

202530

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

354045

Ala Leu Ile Arg Asn Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Thr Ala

505560

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser

65707580

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

859095

Tyr Cys Ala Arg Ala Ser Phe Tyr Tyr Asp Gly Lys Val Leu Ala Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mu 12F3 vL

<400> 17

Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 1015

Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

202530

Ile Ala Trp Tyr Gln Tyr Lys Thr Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile

354045

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505560

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro

65707580

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859095

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 18

<211> 95

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> mu IGKV19-93.01 - 最接近的鼠种系V基因

<400> 18

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 1015

Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

202530

Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile

354045

His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

505560

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro

65707580

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Leu

859095

<210> 19

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hu IGKV1-33.01/hIGKJ2.01

<400> 19

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 1015

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

202530

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

354045

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

505560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65707580

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Tyr

859095

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 20

<211> 95

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hu IGKV1D-43.01

<400> 20

Ala Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 1015

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Trp Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr

202530

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Lys Ala Pro Lys Leu Phe Ile

354045

Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

505560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65707580

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro

859095

<210> 21

<211> 95

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hu IGKV1-16.01

<400> 21

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 1015

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr

202530

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

354045

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

505560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65707580

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro

859095

<210> 22

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> h12F3 vL1

<400> 22

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 1015

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

202530

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

354045

Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

505560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65707580

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Tyr Thr

859095

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 23

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> h12F3 vL2

<400> 23

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 1015

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

202530

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

354045

Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

505560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65707580

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Tyr Thr

859095

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 24

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> h12F3 vL3

<400> 24

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 1015

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

202530

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

354045

Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

505560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65707580

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Tyr Thr

859095

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 25

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> h12F3 vLA

<400> 25

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 1015

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

202530

Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

354045

Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

505560

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65707580

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Tyr Thr

859095

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 26

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> h12F3 vLB

<400> 26

Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 1015

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

202530

Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

354045

His Tyr Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

505560

Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65707580

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Tyr Thr

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Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

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290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

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435 440 445

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202530

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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<400> 51

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202530

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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202530

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Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

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<210> 53

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> h12F3 LI 轻链

<400> 53

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

202530

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65707580

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100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

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130 135 140

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Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

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195 200 205

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<210> 54

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hIgG1 重链恒定结构域

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202530

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

354045

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

505560

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65707580

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

859095

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100 105 110

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115 120 125

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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

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195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 55

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> hIgG κ轻链恒定结构域

<400> 55

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202530

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

354045

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

505560

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65707580

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

859095

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 56

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HF, HG CDR 1, Kabat

<400> 56

Asp Tyr Tyr Met Ser

1 5

<210> 57

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HG CDR 2, Kabat

<400> 57

Leu Ile Arg Asn Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Thr Ala Ser

1 5 1015

Val Lys Gly

<210> 58

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HF, HG CDR 3, Kabat

<400> 58

Ala Ser Phe Tyr Tyr Asp Gly Lys Val Leu Ala Tyr

1 5 10

<210> 59

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HF CDR 2, Kabat

<400> 59

Leu Ile Arg Asn Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser

1 5 1015

Val Lys Gly

<210> 60

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HF, HG CDR 1, IMGT

<400> 60

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr

1 5

<210> 61

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HF, HG CDR 2, IMGT

<400> 61

Ile Arg Asn Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Thr

1 5 10

<210> 62

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HF, HG CDR 3, IMGT

<400> 62

Ala Arg Ala Ser Phe Tyr Tyr Asp Gly Lys Val Leu Ala Tyr

1 5 10

<210> 63

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LF CDR 1, Kabat

<400> 63

Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 64

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LF CDR 2, Kabat

<400> 64

Tyr Thr Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 65

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LD, LF CDR 3, Kabat

<400> 65

Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Tyr Thr

1 5

<210> 66

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LD CDR 1, Kabat

<400> 66

Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala

1 5 10

<210> 67

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LD CDR 2, Kabat

<400> 67

Tyr Thr Ser Ser Leu Gln Pro

1 5

<210> 68

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LD, LF CDR 1, IMGT

<400> 68

Gln Asp Ile Asn Lys Tyr

1 5

<210> 69

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LD, LF CDR 2, IMGT

<400> 69

Tyr Thr Ser

1

<210> 70

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LD, LF CDR 3, IMGT

<400> 70

Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Tyr Thr

1 5

<210> 71

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> h12F3 vHG 核酸序列

<400> 71

gaggtgcagc tggtggagtc cggaggagga ctggtgcagc ccggtcgttc tttaaggctg 60

agctgcacag ccagcggctt caccttcacc gactactaca tgtcttgggt gaggcaagct 120

cccggtaagg gactggagtg gctggcttta attcgtaaca aggccaccgg ctacaccacc 180

gagtacaccg cctccgtgaa gggtcgtttc accatctctc gtgacaacag caagtccatt 240

ttatatttac agatgaactc tttaaagacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgctcgt 300

gcctcctttt actacgacgg caaggtgctg gcctactggg gccaaggtac tttagtgacc 360

gtgtcctcc 369

<210> 72

<211> 319

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> h12F3 vLF 核酸序列

<400> 72

gacacccaga tgacccagtc cccttcctct ttatccgctt ccgtgggaga tcgtgtgacc 60

atcacttgtc aagcttccca agatatcaac aagtacctgg cttggtacca gtacaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatccactac acctcctctt tacagtccgg agtgccttct 180

cgtttctccg gctccggaag cggtcgtgac tacaccttca ccatctcctc tttacagccc 240

gaggacatcg ctacctacta ctgtttacag tacgacaatt tatacacctt cggccaaggt 300

accaagctgg agatcaagc 319

<210> 73

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> h12F3 表位--ALPP

<400> 73

Leu Asp Pro Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe Glu Pro Gly Asp

1 5 1015

Met Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp Ser Thr Leu Asp Pro Ser Leu Met

202530

Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Arg Leu Leu Ser

3540

<210> 74

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> h12F3 表位-ALPPL2

<400> 74

Leu Asp Pro Ser Val Thr His Leu Met Gly Leu Phe Glu Pro Gly Asp

1 5 1015

Met Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp Ser Thr Leu Asp Pro Ser Leu Met

202530

Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Leu Leu Leu Ser

3540