一种易掉片组织的预处理方法及其多重免疫荧光染色方法

技术领域

本发明属于生物医学类实验病理技术领域，尤其涉及一种易掉片组织的预处理方法及其多重免疫荧光染色方法。

背景技术

目前实验病理技术中，石蜡切片免疫学染色都会经历抗原修复过程，该过程通常会导致易掉片类组织，比如软骨、骨、肌腱等组织切片发生脱落的情况，严重影响组织结构完整性。

近年来兴起的多重免疫荧光染色技术，由于不受抗体种属的限制，可在一张石蜡切片上进行6到8个抗体的共同标记，所以得到广泛应用。该技术主要是源于 Zsuzsanna Tóth 和 Éva Mezey发表的酪氨酸放大技术（Tyramide signal amplification，TSA），其技术流程如图1所示。在多重免疫荧光染色中，抗原修复与微波处理去除抗体的步骤是必须的。随着检测靶点的增加，组织切片就需要多进行一轮的微波处理，在这种处理方式下，软骨、骨、肌腱一类易掉片组织很难保证组织的完整性，所以目前很难开展易掉片组织的多重免疫荧光染色。目前该方法已支持一篇软骨组织研究文章发表（Cellular features oflocalized microenvironments in human meniscal degeneration: a single-celltranscriptomic study，eLife，2022 Dec 22;11:e79585.doi: 10.7554/eLife.79585），该文章是已查阅的第一篇软骨组织进行mIHC染色的报道。骨组织与肌腱组织也已完成mIHC实验，也未见相关技术文献报道。

综上，多重免疫荧光染色（mIHC）技术广泛应用于实验病理技术领域，但该技术除了会经历抗原修复过程，还会进行多次微波处理去除抗体，导致易掉片类组织在mIHC中难以应用。因此，如何将易掉片组织应用到多重免疫荧光染色中，成为人们亟待解决的问题。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种易掉片组织的预处理方法及其多重免疫荧光染色方法，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

根据本发明实施例的第一方面，提供了一种易掉片组织的预处理方法，包括以下步骤：

将组织切片进行捞片，收集切片后用紫外照射1~5min，得到固化切片；

将固化切片进行脱蜡，完成易掉片组织的预处理；

所述捞片采用的水剂中含有油状光敏交联剂。

优选的，所述组织切片来源于软骨、骨或肌腱。

优选的，所述紫外照射的过程中将切片的正反面均进行照射。

优选的，所述脱蜡包括以下步骤：

将固化切片依次采用脱蜡剂、无水乙醇、95~99.99% v/v乙醇、90~95% v/v乙醇和70~90% v/v乙醇进行浸泡。

优选的，所述脱蜡剂选自苯类脱蜡剂、甲苯类脱蜡剂、氯化烃类脱蜡剂或精油类脱蜡剂中的一种或几种。

优选的，所述脱蜡剂的浸泡次数为2~4次；

所述无水乙醇、95~99.99% v/v乙醇、90~95% v/v乙醇和70~90% v/v乙醇的浸泡次数为1~3次。

本发明还提供了上述易掉片组织的预处理方法在组织多重免疫荧光染色中的应用。

本发明还提供了一种易掉片组织多重免疫荧光染色方法，包括以下步骤：

采用上述方法对易掉片组织进行预处理，得到待染样本；

将待染样本依次进行抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、荧光基团孵育、微波处理去除抗体、染色，完成易掉片组织多重免疫荧光染色。

优选的，所述抗原修复具体包括以下步骤：

将待染样本与抗体洗脱液混合，修复2~4min。

优选的，所述修复采用高火条件；

所述高火条件的功率为600~700W。

与现有技术相比，本发明的优点包括：

本发明提供一种易掉片组织的预处理方法及其多重免疫荧光染色方法，所述预处理方法中采用捞片后直接在紫外照射下进行光敏交联的步骤，结合特定的照射时间，使得所获切片牢固，避免多重免疫荧光染色中易掉片类组织容易脱落的问题。

此外，本发明的多重免疫荧光染色方法在抗原修复过程大大缩短了程序时间、提升了处理效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为现有技术中Zsuzsanna Tóth 和Éva Mezey发表的酪氨酸放大技术的流程示意图；

图2为脱蜡复水后，不同烤片时间的实验组染色结果图，其中：图2（a）为烤片0h、也即未烤片直接染色的结果；图2（b）为烤片4-10h的结果；图2（c）为烤片18-24h的结果；

图3为脱蜡复水后，不同光敏交联时间的实验组染色结果图，其中：图3（a）为光敏交联时间照射0s、也即未照射的结果；图3（b）为光敏交联时间照射20s的结果；图3（c）为光敏交联时间照射40s的结果；图3（d）为光敏交联时间照射1min的结果；图3（e）为光敏交联时间照射2min的结果；图3（f）为光敏交联时间照射3min的结果；图3（g）为光敏交联时间照射4min的结果；图3（h）为光敏交联时间照射5min的结果；

图4为首次微波处理后，不同烤片时间的实验组染色结果图，其中：图4（a）为烤片0h、也即未烤片的结果；图4（b）为烤片4-10h的结果；图4（c）为烤片18-24h的结果；

图5为首次微波处理后，不同光敏交联时间的实验组染色结果图，其中：图5（a）为光敏交联时间照射20s的结果；图5（b）为光敏交联时间照射40s的结果；图5（c）为光敏交联时间照射1min的结果；图5（d）为光敏交联时间照射2min的结果；图5（e）为光敏交联时间照射3min的结果；图5（f）为光敏交联时间照射4min的结果；图5（g）为光敏交联时间照射5min的结果；

图6为第2次微波处理后，不同烤片时间的实验组染色结果图，其中：图6（a）为烤片0h、也即未烤片的结果；图6（b）为烤片4-10h的结果；图6（c）为烤片18-24h的结果；

图7为第2次微波处理后，不同光敏交联时间的实验组染色结果图，其中：图7（a）为光敏交联时间照射20s的结果；图7（b）为光敏交联时间照射40s的结果；图7（c）为光敏交联时间照射1min的结果；图7（d）为光敏交联时间照射2min的结果；图7（e）为光敏交联时间照射3min的结果；图7（f）为光敏交联时间照射4min的结果；图7（g）为光敏交联时间照射5min的结果；

图8为第7次微波处理后，不同烤片时间的实验组染色结果，其中：图8（a）为烤片0h、也即未烤片的结果；图8（b）为烤片4-10h的结果；图8（c）为烤片18-24h的结果；

图9为第7次微波处理后，不同光敏交联时间的实验组染色结果，其中：图9（a）为光敏交联时间照射20s的结果；图9（b）为光敏交联时间照射40s的结果；图9（c）为光敏交联时间照射1min的结果；图9（d）为光敏交联时间照射2min的结果；图9（e）为光敏交联时间照射3min的结果；图9（f）为光敏交联时间照射4min的结果；图9（g）为光敏交联时间照射5min的结果；

图10为骨Opal 7色荧光图片①；

图11为骨Opal 7色荧光图片②；

图12为肌腱Opal 4色荧光图片；

图13为肌腱Opal 7色荧光图片。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

本发明实施例的第一方面，提供了一种易掉片组织的预处理方法，包括以下步骤：

将组织切片进行捞片，收集切片后用紫外照射1~5min，得到固化切片；

将固化切片进行脱蜡，完成易掉片组织的预处理；

所述捞片采用的水剂中含有油状光敏交联剂，在捞片过程中油状光敏交联剂自行涂布于切片表面，同时本发明避免了烤片步骤，直接进行特定时长的紫外照射，实现了切片的固化，提升了易掉片组织的稳固性；捞片采用的试剂优选为购自Leica公司的Adhesive-Coated Slide。

本发明中，所述组织切片优选来源于软骨、骨或肌腱，所述紫外照射的过程中优选将切片的正反面均进行照射，每面照射的时间优选为1~2min。

本发明所述脱蜡优选包括以下步骤：将固化切片依次采用脱蜡剂、无水乙醇、95~99.99% v/v乙醇、90~95% v/v乙醇和70~90% v/v乙醇进行浸泡，所述脱蜡剂优选自苯类脱蜡剂、甲苯类脱蜡剂、氯化烃类脱蜡剂或精油类脱蜡剂中的一种或几种，进一步优选为精油类脱蜡剂，所述脱蜡剂的浸泡次数优选为2~4次；所述无水乙醇、95~99.99% v/v乙醇、90~95% v/v乙醇和70~90% v/v乙醇的浸泡次数优选为1~3次。

本发明还提供了上述易掉片组织的预处理方法在组织多重免疫荧光染色中的应用，通过本发明的预处理方法能够避免多重免疫荧光染色中，多次抗原修复与微波处理去除抗体导致易掉片组织很难保证组织完整性的情况。

本发明还提供了一种易掉片组织多重免疫荧光染色方法，包括以下步骤：采用上述方法对易掉片组织进行预处理，得到待染样本；将待染样本依次进行抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、荧光基团孵育、微波处理去除抗体、染色，完成易掉片组织多重免疫荧光染色，所述抗原修复优选具体包括以下步骤：将待染样本与抗体洗脱液混合，修复2~4min，所述抗体洗脱液优选为AbCracker，LOT X1KCJ10A，所述修复优选采用高火条件；所述高火条件的功率为600~700W。

以下结合具体实施例对本发明进行详细论述，以便理解本发明的技术方案。

实施例1

（1）、选取待检测肌腱组织，并对待检测组织进行切片，所述待检测组织切片厚度为3-5μm，备用；

（2）、在步骤（1）完成切片后使用购自Leica公司的Adhesive- Coated Slide进行捞片，之后在紫外照射下进行光敏交联1min；

（3）、脱蜡水化：依次采用TO生物透明剂浸泡两次，无水乙醇浸泡两次，95% v/v乙醇浸泡一次，90% v/v乙醇浸泡一次，80% v/v乙醇浸泡一次，得到脱蜡水化后的组织作为待染样本；

（4）、将待染样本依次进行抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、荧光基团孵育、微波处理去除抗体、染色。

其中，抗原修复采用抗体洗脱液（AbCracker，LOT X1KCJ10A）进行处理，高火（700W）修复3min。

实施例2

（1）、选取待检测骨组织，并对待检测组织进行切片，所述待检测组织切片厚度为3-5μm，备用；

（2）、在步骤（1）完成切片后使用购自Leica公司的Adhesive- Coated Slide进行捞片，之后在紫外照射下进行光敏交联2min；

（3）、脱蜡水化：依次采用TO生物透明剂浸泡两次，无水乙醇浸泡两次，95% v/v乙醇浸泡一次，90% v/v乙醇浸泡一次，80% v/v乙醇浸泡一次，得到脱蜡水化后的组织作为待染样本；

（4）、将待染样本依次进行抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、荧光基团孵育、微波处理去除抗体、染色，也即多重荧光染色。

其中，抗原修复采用抗体洗脱液（AbCracker，LOT X1KCJ10A）进行处理，高火（700W）修复3min。

最终的染色结果如图10和图11所示，结果显示组织完整，未掉片。

实施例3

（1）、选取待检测软骨组织，并对待检测组织进行切片，所述待检测组织切片厚度为3-5μm，备用；

（2）、在步骤（1）完成切片后使用购自Leica公司的Adhesive- Coated Slide进行捞片，之后在紫外照射下进行光敏交联3min；

（3）、脱蜡水化：依次采用TO生物透明剂浸泡两次，无水乙醇浸泡两次，95% v/v乙醇浸泡一次，90% v/v乙醇浸泡一次，80% v/v乙醇浸泡一次，得到脱蜡水化后的组织作为待染样本；

（4）、将待染样本依次进行抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、荧光基团孵育、微波处理去除抗体、染色。

其中，抗原修复采用抗体洗脱液（AbCracker，LOT X1KCJ10A）进行处理，高火（700W）修复3min。

实施例4

（1）、选取待检测肌腱组织，并对待检测组织进行切片，所述待检测组织切片厚度为3-5μm，备用；

（2）、在步骤（1）完成切片后使用购自Leica公司的Adhesive- Coated Slide进行捞片，之后在紫外照射下进行光敏交联4min；

（3）、脱蜡水化：依次采用TO生物透明剂浸泡两次，无水乙醇浸泡两次，95% v/v乙醇浸泡一次，90% v/v乙醇浸泡一次，80% v/v乙醇浸泡一次，得到脱蜡水化后的肌腱组织作为待染样本；

（4）、将待染样本依次进行抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、荧光基团孵育、微波处理去除抗体、染色，也即多重荧光染色。

其中，抗原修复采用抗体洗脱液（AbCracker，LOT X1KCJ10A）进行处理，高火（700W）修复3min。

最终的染色结果如图12和图13所示，结果显示组织完整，未掉片。

实验例1

1.基于实施例1的步骤，其他条件保持不变，将其中的个别条件进行替换，设计为以下对照实验，操作方法分别如下：

对照（1）石蜡切片后，直接进行脱蜡水化，待染（脱蜡水化步骤与实施例1相同）；

对照（2）石蜡切片后，烤片4-10h，进行脱蜡水化，待染（脱蜡水化步骤与实施例1相同）。

对照（3）石蜡切片后，延长烤片时间至18-24h，进行脱蜡水化，待染（脱蜡水化步骤与实施例1相同）。

对照（4）将光敏交联时间分别替换为0、20s、40s、1min、2min、3min、4min、5min。

为了直观展示出组织在免疫荧光多染实验中完整性，模拟实验步骤中最容易造成脱片的微波处理实验条件，其中，首次微波处理16min，之后的每次处理微波加热至沸腾即停止加热。

将各组中，脱蜡水化后的样本按照如下步骤处理：

①抗原修复：微波高火700W，16min（实施例1替换为采用抗体洗脱液（AbCracker，LOT X1KCJ10A）进行处理，高火700W修复3min）；

②冷却至室温，洗掉修复液、封闭，RT，10min；

③用一抗进行孵育、PBS洗5次，2min/次；

④用二抗进行孵育，RT，10min；

⑤采用PBS洗5次，2min/次；

⑥采用Opal荧光素孵育，RT，10min；

⑦采用PBS洗5次，2min/次；

⑧加入抗体洗脱液，微波至沸腾；

⑨重复步骤②~⑧，至经历第7次微波至沸腾，冷却至室温，洗去洗脱液；

⑩DAPI染色，封片。

本发明分别在脱蜡复水后以及每次微波处理后对组织进行HE染色，通过全景采图，分别记录了以下四个阶段：①脱蜡复水后、②首次微波处理、③第2次微波处理、④第7次微波处理后的结果。

2.HE染色结果

（1）各组脱蜡复水后，经历了不同烤片时间的实验组染色结果如图2所示，其中：

图2（a）为烤片0h、也即未烤片直接染色的结果；

图2（b）为烤片4-10h的结果；

图2（c）为烤片18-24h的结果；

（2）各组脱蜡复水后，经历了不同光敏交联时间的实验组，染色结果如图3所示，其中：

图3（a）为光敏交联时间照射0s、也即未照射的结果；

图3（b）为光敏交联时间照射20s的结果；

图3（c）为光敏交联时间照射40s的结果；

图3（d）为光敏交联时间照射1min的结果；

图3（e）为光敏交联时间照射2min的结果；

图3（f）为光敏交联时间照射3min的结果；

图3（g）为光敏交联时间照射4min的结果；

图3（h）为光敏交联时间照射5min的结果；

（3）各组首次微波处理后，经历了不同烤片时间的实验组，染色结果如图4所示，其中：

图4（a）为烤片0h、也即未烤片的结果；

图4（b）为烤片4-10h的结果；

图4（c）为烤片18-24h的结果；

（4）各组首次微波处理后，经历了不同光敏交联时间的实验组，染色结果如图5所示，其中：

图5（a）为光敏交联时间照射20s的结果；

图5（b）为光敏交联时间照射40s的结果；

图5（c）为光敏交联时间照射1min的结果；

图5（d）为光敏交联时间照射2min的结果；

图5（e）为光敏交联时间照射3min的结果；

图5（f）为光敏交联时间照射4min的结果；

图5（g）为光敏交联时间照射5min的结果；

（5）各组第2次微波处理后，经历了不同烤片时间的实验组，染色结果如图6所示，其中：

图6（a）为烤片0h、也即未烤片的结果；

图6（b）为烤片4-10h的结果；

图6（c）为烤片18-24h的结果；

（6）各组第2次微波处理后，经历了不同光敏交联时间的实验组，染色结果如图7所示，其中：

图7（a）为光敏交联时间照射20s的结果；

图7（b）为光敏交联时间照射40s的结果；

图7（c）为光敏交联时间照射1min的结果；

图7（d）为光敏交联时间照射2min的结果；

图7（e）为光敏交联时间照射3min的结果；

图7（f）为光敏交联时间照射4min的结果；

图7（g）为光敏交联时间照射5min的结果；

（7）各组第7次微波处理后，经历了不同烤片时间的实验组，染色结果如图8所示，其中：

图8（a）为烤片0h、也即未烤片的结果；

图8（b）为烤片4-10h的结果；

图8（c）为烤片18-24h的结果；

（8）各组第7次微波处理后，经历了不同光敏交联时间的实验组，染色结果如图9所示，其中：

图9（a）为光敏交联时间照射20s的结果；

图9（b）为光敏交联时间照射40s的结果；

图9（c）为光敏交联时间照射1min的结果；

图9（d）为光敏交联时间照射2min的结果；

图9（e）为光敏交联时间照射3min的结果；

图9（f）为光敏交联时间照射4min的结果；

图9（g）为光敏交联时间照射5min的结果；

3.染色结果解释

由于本发明采用的样品为肌腱组织的连续石蜡切片，初始状态极为接近，能够更好的体现出不同实验条件的对照效果。

由图2、图4、图6和图8可知，现有技术中的常规使用的：石蜡切片后直接进行脱蜡水化、以及石蜡切片后烤片4-10h再进行脱蜡水化的方法均不能避免易掉片组织的掉片现象，无法保留完整组织结构，随着微波处理次数的增加、组织掉片情况也愈发严重；同时由图3、图5、图7和图9中，采用1~4min紫外交联时间的本发明方案结果（各图中的图c~图f）可知，本发明提供的方案能够保留完整组织结构，不会随着微波处理次数的增加而掉片。

并且还可知：现有技术一般会增加烤片时间来防止组织掉片，但这一方法并不适用于肌腱、骨、软骨这一类易掉片组织上，图2、图4、图6和图8四组图片中均能够体现：烤片时间的增加并不能减少组织掉片。

由图3、图5、图7和图9可知，本发明中利用紫外交联时间最优时间为1~4min，时间过长或过短均不能保证组织完整性，最适的紫外交联时间与本发明的处理步骤相配合，能够得到最优的防掉片结果，图9显示出，本发明提供的处理方法在第七次微波后仍能保留组织的较好完整性。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。