一种通过亚基定性、定量螺旋藻中藻蓝蛋白的方法

技术领域

本发明涉及螺旋藻中藻蓝蛋白定性、定量领域，具体为一种通过亚基定性、定量螺旋藻中藻蓝蛋白的方法。

背景技术

藻蓝蛋白是藻胆蛋白的一种，由呈蓝色的藻蓝素(藻胆素)与可溶性蛋白结合而成，藻胆蛋白作为蓝藻、红藻、隐藻和甲藻中存在的一种具有光合作用的辅助色蛋白，是由载体蛋白和生色团辅基组成。载体蛋白和生色团通过硫醚键链接，每分子藻蓝素含2条肽链(α和β),每条肽链含1个或多个共价键连接的发色团；藻蓝蛋白作为一种天然着色剂被广泛应用在化妆品、饮料、冰淇淋、口香糖和乳制品中。

现在所运用藻蓝蛋白的测定方法都为测定总蛋白含量，并不能单独定量、定性藻蓝蛋白，其他电泳方法并未用过双条带定性，为此提供一种通过亚基定性、定量螺旋藻中藻蓝蛋白的方法，此方法为首次利用藻蓝蛋白α，β条带特殊性定性；从而达到精准、高效、便捷定性、定量藻蓝蛋白的效果。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种通过亚基定性、定量螺旋藻中藻蓝蛋白的方法，以解决上述背景技术提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种通过亚基定性、定量螺旋藻中藻蓝蛋白的方法，包括以下步骤：

S10：获取标准曲线：

S101：制备不同已知藻蓝蛋白浓度的标准溶液，并独立的与样品制备液1:1混合；

S102：将混合后溶液沸水浴1min，待冷却；

S103：冷却后溶液上载到十二烷基硫酸钠聚丙酰胺凝胶中，每孔10μL并且在中间加样孔加入10μL的非预染蛋白Marker；

S104：设置电流8mA，电泳15min，随后改为16mA，进行至前沿线到达底部绿线；

S105：取出凝胶，用考马斯亮蓝染色液染色40min；

S106：脱色液脱色5min；

S107：净化水洗脱90min；

S108：凝胶成像系统选择考马斯亮蓝模块，白光拍摄分析；

S109：所得条带是分子量为14kDa的β亚基和21kDa的α亚基；

S110：计算所需藻蓝蛋白α亚基条带体积，根据已知浓度与条带体积计算线性关系，验证偏差；

S111：所得标准曲线用于浓度计算；

S20：样品定性、定量；

S201：将蛋白样品液与样品制备液1:1混合；

S202：将混合后溶液沸水浴1min，待冷却；

S203：冷却后溶液上载到12.5％浓度的十二烷基硫酸钠聚丙酰胺凝胶中，每孔10μL，并且在中间加样孔加入10μL的非预染蛋白Marker；

S204：设置电流8mA，电泳15min，随后改为16mA，进行至前沿线到达底部绿线；

S205：取出凝胶，用考马斯亮蓝染色液染色40min；

S206：脱色液脱色5min；

S207：净化水洗脱90min；

S208：凝胶成像系统选择考马斯亮蓝模块，白光拍摄分析；

S209：分析所得条带是否为14kDa的β亚基和21kDa的α亚基，依据此定性为藻蓝蛋白；

S210：计算藻蓝蛋白α亚基条带体积，带入线性关系式，算得蛋白含量。

作为本发明的一种优选技术方案，所述S20中样品的定性和定量是在确定样品为螺旋藻所产蛋白并颜色为蓝色的前提下进行的。

作为本发明的一种优选技术方案，所述S103和S203中的非预染蛋白Marker的分子量低，4.1～66kDa。

本发明的有益效果是：本发明依据α、β亚基条带特征将藻蓝蛋白与其他蛋白鉴别，根据α亚基条带体积计算藻蓝蛋白含量；运用十二烷基硫酸钠聚丙酰胺凝胶电泳方法，通过考马斯亮蓝染色剂，将蛋白染色为可见条带，凝胶成像系统分析藻蓝蛋白α亚基条带发光量与藻蓝蛋白含量的线性关系，最终目的为给螺旋藻提供一种准确、快速、灵敏的定性定量方法。

本发明通过十二烷基硫酸钠聚丙酰胺凝胶电泳技术，染色后，通过α、β双条带相对分子量对藻蓝蛋白定性，比单条带定性更为准确。相较于其他蛋白测定方法，此发明不需分离纯化藻蓝蛋白，可以单一精准测定其含量，相较于其他电泳定量方法，本发明利用α亚基条带体积作为参照条件，比条带总体积为参照条件更加灵敏，准确。

附图说明：

图1：为本发明的方法获取标准曲线的流程图；

图2：为本发明的方法样品定性、定量的流程图；

图3：为本发明实施例1浓度与条带体积计算线性图；

图4：为本发明实施例2加样体积与条带体积计算线性关系线性图

图5：为本发明实施例3分析市面含藻蓝蛋白产品电泳图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

实施例1：

S01：制备1.0mg/mL、1.2mg/mL、1.4mg/mL、1.6mg/mL、2.0mg/mL标准溶液，并独立的与样品制备液1:1混合；

S02：将混合后溶液沸水浴1min，待冷却；

S03：冷却后溶液上载到12.5％浓度的十二烷基硫酸钠聚丙酰胺凝胶中，每孔10μL，并且在中间加样孔加入10μL的Marker(非预染蛋白Marker，低分子量，4.1～66kDa；生工生物工程股份有限公司)；

S04：设置电流为8mA，电泳15min，随后变为16mA，进行至前沿线到达底部绿线；

S05：取出凝胶，用考马斯亮蓝染色液染色40min；

S06：脱色液脱色凝胶5min；

S07：净化水洗脱凝胶90min；

S08：凝胶成像系统选择考马斯亮蓝模块，白光拍摄分析所得凝胶；

S09：所得条带为14kDa的β和21kDa的α亚基；

S10：计算所需藻蓝蛋白α亚基条带体积，根据已知浓度与条带体积计算线性关系为y＝57519514.4286x-36838946.8095，R

实施例2：

S01：制备3.2mg/ml标准液1ml，与样品制备液1：1混合；

S02：将混合后溶液沸水浴1min，待冷却；

S03：冷却后溶液上载到12.5％浓度的十二烷基硫酸钠聚丙酰胺凝胶中，从第一个加样孔依次加入4μl，8μl，10μl，12μl，16μl，20μl并且在中间加样孔加入10μL的Marker(非预染蛋白Marker，低分子量，4.1～66kDa；生工生物工程股份有限公司)；

S04：设置电流为8mA，电泳15min，随后变为16mA，进行至前沿线到达底部绿线；

S05：取出凝胶，用考马斯亮蓝染色液染色40min；

S06：脱色液脱色凝胶5min；

S07：净化水洗脱凝胶90min；

S08：凝胶成像系统选择考马斯亮蓝模块，白光拍摄分析所得凝胶；

S09：所得条带为14kDa的β和21kDa的α亚基；

S10：计算所需藻蓝蛋白α亚基条带体积，根据已知加样体积与条带体积计算线性关系为y＝2,741,122.3250x+23,583,611.1000R

实施例3：

S01：选取市面含有藻蓝蛋白的产品，分别取10μL并与样品制备液1:1混合；

S02：将混合后溶液沸水浴1min，待冷却；

S03：冷却后溶液上载到12.5％浓度的十二烷基硫酸钠聚丙酰胺凝胶中，每孔10μL，并且在中间加样孔加入10μL的Marker(非预染蛋白Marker，低分子量，4.1～66kDa；生工生物工程股份有限公司)；

S04：设置电流为8mA，电泳15min，随后变为16mA，进行至前沿线到达底部绿线；

S05：取出凝胶，用考马斯亮蓝染色液染色40min；

S06：脱色液脱色凝胶5min；

S07：净化水洗脱凝胶90min；

S08：凝胶成像系统选择考马斯亮蓝模块，白光拍摄分析所得凝胶；

S09：判断所得条带为14kDa的β和21kDa的α亚基；

S10：分析一个样品的α亚基条带体积为28,494,875，根据y＝2,741,122.3250x+23,583,611.1000R

本发明依据α、β亚基条带特征将藻蓝蛋白与其他蛋白鉴别，根据α亚基条带体积计算藻蓝蛋白含量；运用十二烷基硫酸钠聚丙酰胺凝胶电泳方法，通过考马斯亮蓝染色剂，将蛋白染色为可见条带，凝胶成像系统分析藻蓝蛋白α亚基条带发光量与藻蓝蛋白含量的线性关系，最终目的为给螺旋藻提供一种准确、快速、灵敏的定性定量方法。

本发明通过十二烷基硫酸钠聚丙酰胺凝胶电泳技术，染色后，通过α、β双条带相对分子量对藻蓝蛋白定性，比单条带定性更为准确。相较于其他蛋白测定方法，此发明不需分离纯化藻蓝蛋白，可以单一精准测定其含量，相较于其他电泳定量方法，本发明利用α亚基条带体积作为参照条件，比条带总体积为参照条件更加灵敏，准确。

以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。