外周血白细胞联合标志物在制备原发性胆管癌检测产品中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和医学诊断领域，具体涉及外周血白细胞联合标志物在制备原发性胆管癌检测产品中的应用。

背景技术

原发性胆管癌(Cholangiocarcinoma，CCA)起源于肝内胆管和肝外胆管的上皮细胞，是一类具有高度异质性、侵袭性的恶性肿瘤；根据肿瘤生长部位不同，CCA又可以分为肝内胆管癌、肝门部胆管癌、以及远端胆管癌，其中肝内胆管癌占原发性肝癌的10％～15％。近30年内，CCA的发病率在全世界范围内呈明显上升趋势，CCA发病隐匿，极易侵犯肝脏周围器官、组织和神经，易造成远端转移，大部分病人确诊时通常已处于晚期，缺乏有效治疗方法；而在早期便进行手术干预的CCA患者，患者5年内生存率高达80％。因此针对于CCA的早期检测是十分有必要的。

目前CCA的检测主要还是依赖于影像学、血清CEA、CA19-9和CA125等传统血清标志物，灵敏性、特异性十分有限。因此，临床上亟需开发一类新型、快捷的生物标志物用于早期原发性胆管癌的检测。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了外周血白细胞联合标志物在制备原发性胆管癌检测产品中的应用，基于检测外周血白细胞联合标志物用于原发性胆管癌早期筛查，具有特异性好、灵敏度高、成本低的显著优势。

本发明的第一个目的是提供一种原发性胆管癌的外周血白细胞联合标志物，其中外周血白细胞联合标志物为来源于外周血白细胞RNA的CYP27A1、KYNU、MAFB以及PTGDS。

本发明的第二个目的是提供上述外周血白细胞联合标志物作为原发性胆管癌辅助诊断指标的应用。

本发明的第三个目的是提供一种原发性胆管癌诊断制剂，包括上述外周血白细胞联合标志物。

本发明的第四个目的是提供上述外周血白细胞联合标志物在制备早期原发性胆管癌检测试剂盒中的应用。

本发明的第五个目的是提供用于检测上述外周血白细胞联合标志物的引物，包括：

CYP27A1 F：5′-GCCTTGTTCAGAACCCTTCAG-3′(SEQ ID NO：1)，

CYP27A1 R：5′-ATTCCACTCACTTCCAACATTTCC-3′(SEQ ID NO：2)；

KYNU F：5′-AGTCACAACTACAACTTCACGG-3′(SEQ ID NO：3)，

KYNU R：5′-CCAACATAACAACCCTTCGC-3′(SEQ ID NO：4)；

MAFB F：5′-TGTAGCATCTCAAATCCATCTG-3′(SEQ ID NO：5)，

MAFB R：5′-ACACCACCAAGAACTCTTCC-3′(SEQ ID NO：6)；

PTGDS F：5′-CGTTGCTGTGATTCTGTTGG-3′(SEQ ID NO：7)，

PTGDS R：5′-AGTGTCTGATCTCCTAACCACC-3′(SEQ ID NO：8)。

优选地，还包括内参引物序列：

HPRT1 F：5′-GAGAACTACAAATCCCAACAAAGC-3′(SEQ ID NO：9)，HPRT1 R：5′-CGTCATTACAATAGCTCTTCAGTC-3′(SEQ ID NO：10)。

本发明的第六个目的是提供检测或诊断原发性胆管癌的CCA检测试剂盒，包括：特异性检测人外周血白细胞CYP27A1、KYNU、MAFB、PTGDS的检测试剂。

优选地，所述检测试剂包括上述引物。

本发明的优点和有益效果如下：

1.基于检测外周血白细胞(White blood cell，WBC)RNA水平变化来构建的早筛模型能够在肿瘤形成的初期便可以进行特异性的检测。

2.外周血白细胞联合标志物是一种液体活检生物标志物，更为灵敏、稳定、无创，且需要的样本量较少，患者更容易接受，其成功开发有助于胆管癌的诊断。

3.原发性胆管癌的发病因素复杂，本发明基于检测多个外周血白细胞联合标志物相较于单一的分子标志物，可一定程度上减少因单一指标个体表达差异导致的误差，使结果更加准确。

附图说明

图1为本发明实施例中人外周血白细胞差异表达基因的火山图。

图2显示CYP27A1在健康样本(NOR)和胆管癌样本(CCA)中的相对表达水平。

图3显示KYNU在健康样本(NOR)和胆管癌样本(CCA)中的相对表达水平。

图4显示MAFB在健康样本(NOR)和胆管癌样本(CCA)中的相对表达水平。

图5显示PTGDS在健康样本(NOR)和胆管癌样本(CCA)中的相对表达水平。

图6为ROC曲线分析采用外周血白细胞标志物CYP27A1鉴定原发性胆管癌患者的检测结果。

图7为ROC曲线分析采用外周血白细胞标志物KYNU鉴定原发性胆管癌患者的检测结果。

图8为ROC曲线分析采用外周血白细胞标志物MAFB鉴定原发性胆管癌患者的检测结果。

图9为ROC曲线分析采用外周血白细胞标志物PTGDS鉴定原发性胆管癌患者的检测结果。

图10为ROC曲线分析采用外周血白细胞联合标志物(Combination)鉴定原发性胆管癌患者的检测结果。

图11为ROC曲线分析采用传统胆管癌血清标志物糖类抗原19-9(CA19-9)鉴定原发性胆管癌患者的检测结果。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例

一、材料和试剂

1.1人外周血白细胞分离试剂盒(PGB2001，Beyotime，China)、人外周血白细胞RNA提取试剂盒(PGB2002，Beyotime，China)、RNA反转录试剂盒(4368813，ABI，UnitedStates)、Q-PCR试剂盒(11202ES08，Yeasen，China)以及Q-PCR仪检测人外周血白细胞联合标志物。

1.2本发明CYP27A1、KYNU、MAFB、PTGDS基因序列可通过https://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站获知。

1.3样本由杭州师范大学附属医院提供(伦理审批号：2022(E2)-KS-068)。其中原发性胆管癌患者36例，健康对照13例。

二、外周血白细胞的分离

用一次性针筒采集受试者外周血1mL，迅速转入EDTA抗凝管，混匀。

按照人外周血白细胞分离试剂盒(PGB2001，Beyotime，China)操作说明分离白细胞，具体步骤为：

1)向15mL离心管中加入10mL试剂A备用，用1mL带滤芯的枪头吸取1mL抗凝血，沿着管壁缓缓注入15mL离心管中；

2)盖好管盖，上下颠倒5次，静置5分钟，然后再上下颠倒5次，静置5分钟，室温，500g离心5分钟；

3)去废液，加入10mL的B重悬，室温，500g离心5分钟；

4)去废液，向离心管底部白色细胞沉淀中加入700μL试剂C，反复吹打10次至沉淀全部溶解；

5)-80℃保存。

三、外周血白细胞RNA的提取

按照人外周血白细胞RNA提取试剂盒(PGB2002，Beyotime，China)的操作说明书提取人外周血RNA。具体步骤为：

1)将白细胞样本从-80℃冰箱取出，于室温完全解冻；

2)加入280μL DEPC水，漩涡混匀15秒，室温静置10分钟，12000g离心15分钟；

3)离心后，吸取850μL上清液至新1.5mL离心管中，加入5μL的4-溴苯甲醚，漩涡混匀15秒，室温静置5分钟，12000g离心10分钟；

4)离心后，转移700μL上清液至新1.5mL离心管，加入等体积的异丙醇并颠倒混匀20次，-80℃冰箱静置30分钟；

5)取出待完全解冻后12000g离心30分钟；

6)去除上清，加入1mL 75％酒精洗涤1次，12000g离心4分钟；

7)弃上清，通风橱晾干1分钟，加入20μL DEPC水吹打10-20次溶解RNA。四、高通量测序分析人外周血白细胞差异表达基因

提取的RNA经NanoDrop 2000Spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific,Wilmington,DE)检测浓度，并使用Agient2100，LabChip GX(Agilent Technologies,CA,USA)，琼脂糖胶图对完整性进行检测后，采用NEBNext

五、验证外周血白细胞联合标志物对于原发性胆管癌的早筛预测

以CYP27A1、KYNU、MAFB、PTGDS作为检测对象，在36例胆管癌样本和13例健康样本进行验证，并绘制ROC曲线，单独检测结果见图6-9。分析显示，以外周血白细胞中CYP27A1、KYNU、MAFB、PTGDS作为检测联合标志物，在区分CCA组和健康对照组时，其AUC值为1.00(图10)。而以血清学标志物糖类抗原19-9(CA19-9)作为指标的区分CCA组和非CCA患者的AUC仅为0.7806(图11)。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。