磷光材料的应用和检测生物组织纤维密度的方法

技术领域

本发明涉及生物工程学技术领域，具体而言，涉及磷光材料的应用和检测生物组织纤维密度的方法。

背景技术

慢性难愈性伤口是一个全球公共卫生问题。作为一种“隐形的流行病”，慢性伤口的发病率在不断增长，而且由于医疗保健费用的增加、人口老龄化以及全球糖尿病和肥胖症发病率的急剧上升，花费在慢性伤口的治疗上的费用正在迅速增加。慢性伤口的护理成本和效果受伤口愈合时间、治疗频率和伤口并发症的影响，而准确的伤口评估对于指导治疗计划至关重要。胶原蛋白是细胞外基质的重要组成部分。在伤口修复过程中，胶原蛋白动态活动包括沉积、成熟和随后的重塑，这些活动中的任何一项出现障碍，都会导致伤口进入慢性不愈合状态。因此，监测和量化愈合伤口中胶原蛋白的动态变化可以作为临床诊断的重要参数。

胶原蛋白可以通过各种技术(如生化和组织学分析，共聚焦显微镜)进行观察或分析；其中，组织学分析已被公认为是可视化胶原纤维形成的黄金标准，但组织学评估手段具有侵入和破坏性。光学影像技术的进步使得在伤口愈合过程中可以无损地监测胶原蛋白的动态变化。由于胶原蛋白具有非中心对称的结构，它在伤口内的再生可以通过二次谐波生成(SHG)显微镜来观察。SHG模式已被广泛用于识别软组织中胶原纤维的卷曲模式和方向。然而，高效的SHG需要理想的相位匹配条件、大的相干长度和均匀的场增强，这些要求限制了SHG检测的深度。

因此，需要无需标记、敏感的、非破坏性的能够实时定量检测蛋白变化的检测方法。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供磷光材料的应用和检测生物组织纤维密度的方法。本发明发现采用特定的磷光材料能够检测生物组织纤维的密度，继而有效检测生物组织的变化，该检测方法无需标记，无创且灵敏度高。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供一种磷光材料在检测生物组织纤维密度中的应用，所述磷光材料为磷光材料与所述生物组织纤维结合后，所述磷光材料的寿命发生改变的磷光探针。

在可选的实施方式中，所述磷光材料是能与生物组织纤维靶向结合的靶向基团、水溶性基团和磷光基团键合形成的磷光探针；

在可选的实施方式中，所述磷光材料选自下述结构式所示的化合物：

其中M选自过渡金属，优选为Ir、Re、Pd和Pt中的任意一种；

优选地，所述生物组织纤维包括结缔组织内的不同纤维组分；优选包括胶原蛋白纤维，弹力纤维及网状纤维更优选为胶原蛋白纤维。

第二方面，本发明提供一种检测生物组织纤维密度的方法，包括：利用磷光材料与待测样品作用，而后激光所述磷光材料，而后根据所述磷光材料的寿命判断所述生物组织纤维的密度，所述磷光材料为磷光材料与所述生物组织纤维结合后，所述磷光材料的寿命发生改变的磷光探针。

在可选的实施方式中，所述磷光材料的寿命通过PLIM成像系统成像后进行曲线拟合。

在可选的实施方式中，所述待测样品包括皮肤伤口，优选为不同修复阶段的伤口。

在可选的实施方式中，激发所述磷光材料的波长包括400-800nm。

在可选的实施方式中，所述磷光材料是能与生物组织纤维靶向结合的靶向基团、水溶性基团和磷光基团键合形成的磷光探针；

在可选的实施方式中，所述磷光材料选自下述结构式所示的化合物：

其中，M为选自过渡金属，优选为Ir、Re、Pd和Pt中的任意一种。

本发明具有以下有益效果：本发明实施例通过采用特定的磷光材料，该磷光材料与生物组织纤维结合后，其寿命会发生改变，继而通过检测磷光材料的寿命的变化，以判断生物组织纤维的密度，该方法无需标记、非破坏性且敏感，容易被病人接纳，并扩大了磷光材料的使用范围。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1提供的检测结果图；

图2为本发明实施例2提供的检测结果图；

图3为本发明实施例3提供的光学检测结果图；

图4为本发明实施例3提供的组织病理学结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

胶原蛋白可以通过各种技术(如生化和组织学分析，共聚焦显微镜)进行观察或分析；其中，组织学分析已被公认为是可视化胶原纤维形成的黄金标准，但组织学评估手段具有侵入和破坏性。光学影像技术的进步使得在伤口愈合过程中可以无损地监测胶原蛋白的动态变化，例如SHG。但是SHG需要理想的相位匹配条件、大的相干长度和均匀的场增强，这些要求限制了SHG检测的深度。

为了能够为生物组织提供更深入和准确的光学检测，许多先进的成像剂已经被开发出来。突出的是，磷光过渡金属探针显示出良好的光学稳定性、大的辐照度和长的发射寿命。磷光过渡金属探针的发射易受氧气淬灭的影响，已被广泛用于通过磷光寿命或强度来量化伤口修复和愈合的氧气浓度。然而，目前还没有关于应用磷光探针对伤口愈合中的胶原蛋白进行量化的报道。

发明人发现在不需要保护性载体或包装的情况下，磷光材料可以轻易地穿透血管并扩散到真皮组织中。渗出后，探针将与胶原纤维结合并稳定下来，磷光探针的磷光寿命会发生改变，因此，本发明实施例通过将磷光材料用于检测生物组织纤维，例如蛋白纤维密度，继而能够定量胶原蛋白。

其中，该磷光材料为磷光材料与所述生物组织纤维结合后，所述磷光材料的寿命发生改变的磷光探针。该磷光材料是能与生物组织纤维靶向结合的靶向基团、水溶性基团和磷光基团键合形成的磷光探针，该键合方式为化学键合。

磷光材料选自下述结构式所示的化合物：

其中M选自过渡金属，优选为Ir、Re、Pd和Pt中的任意一种。

上述Re

本发明实施例采用的上述结构的磷光材料仅仅为举例，并不限于上述磷光材料，且上述磷光材料的制备参照文献Advanced Science 8.20(2021):2102788。

生物组织纤维包括结缔组织内的不同纤维组分；优选为蛋白纤维，蛋白纤维可以是胶原蛋白纤维，也可以是其他蛋白纤维。

具体地，该检测方法步骤如下：

将磷光探针溶解在缓冲盐(例如磷酸盐缓冲盐溶液)中，而后将其应用于待测样品，例如皮肤伤口等生物组织，而后采用适当的照明波长(例如400nm、500nm、800nm、820nm、1000nm以及1100nm等，实际上只要能激发磷光探针的激发波长均可)激发探针，其中探针在与胶原蛋白稳定后表现出强烈的光吸收，测量并描述磷光探针在组织中的磷光寿命，记录磷光寿命并生成随时间变化的曲线，绘制胶原蛋白的空间分布图。

所述磷光材料的寿命通过PLIM成像系统成像后进行曲线拟合。也可以采用其他现有的方式计算磷光材料的磷光寿命。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

本发明实施例采用的磷光材料为下述结构式所示的化合物(下文也描述为Re

实施例1

建立PLIM平台并在体外研究中测试Re

(一)1.PLIM成像系统

磷光寿命和成像由配备有磷光寿命成像系统(SPC-150，Becker&Hickl)的尼康倒置多光子显微镜Eclipse(A1MP+Eclipse Ti-2E，尼康仪器公司，日本)测量。磷光衰减是在57.21微秒的像素停留时间内获得PLIM的。在PLIM成像过程中，帧时间为16.3s，每个区域的整体图像采集时间为2分钟，以收集足够高的光子数来进行正确的曲线拟合。为了计算磷光强度和寿命，数据分析由SPCImage 8.4(Becker&Hickl)软件进行。

(二)2.体外校准

为了观察Re

实施例2

构建伤口愈合小鼠模型，验证Re

(一)伤口愈合小鼠模型

按照报道生成切除性伤口夹板小鼠模型。简而言之，在小鼠背侧脱毛和麻醉(Avertin，250mg/kg)后，用活检器制造两个切除性皮肤伤口，每个伤口直径为5mm，全厚，沿中线两侧。在每个伤口上放置一个圆形空心形状的硅胶片，使伤口位于夹板的中心。使用即时粘接剂将夹板固定在皮肤上，然后用间断缝合来稳定其位置，并先用Tegaderm生物敷料膜覆盖伤口，然后用自粘弹性绷带包扎。

(二)体内验证

为了跟踪活体小鼠的胶原蛋白再生，首先对动物进行麻醉，并通过PLIM平台捕捉和分析图像。在检测之前，将Re

实施例3

判断基于Re

为了证明基于Re

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。