第益肽在制备抑制产气荚膜梭菌产品中的应用以及对鸡肠道和肉鸡生产的应用

技术领域

本发明涉及抗菌肽的技术领域，具体涉及第益肽在制备抑制产气荚膜梭菌产品中的应用以及对鸡肠道和肉鸡生产的应用。

背景技术

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,CP)为梭状芽孢杆菌属的一种革兰氏阳性厌氧菌，没有鞭毛，有荚膜，菌体呈卵圆形。产气荚膜梭菌通常以芽孢的形式存在于环境污水、土壤、家禽粪便及肠道内,是人畜共患致病菌。产气荚膜梭菌进入机体后能够分泌多种外毒素和降解酶，侵袭并降解组织从而获取营养物质,进而大量繁殖。产气荚膜梭菌能产生十几种毒素，主要有α、β、ε、ι四种致病毒素，人们根据其产生毒素的基因不同，将产气荚膜梭菌分成A、B、C、D、E五个型，在鸡上分离到的主要是A型和C型。产气荚膜梭菌中的双组分调节系统调节唾液酸酶、透明质酸酶、netB毒素基因和催化酶等毒素的分泌，可引起坏死性肠炎的标志性症状。研究发现，netB毒素与鸡坏死性肠炎直接相关，netB毒素与位于细胞膜中的胆固醇相互作用介导孔隙形成和寡聚化，孔隙的形成破坏了细胞膜并增加了离子的流入，从而导致细胞死亡。所以该菌是引起鸡坏死性肠炎的最主要致病菌。坏死性肠炎的发生与产气荚膜梭菌的增殖和产生致病毒素有关。早期研究表明产气荚膜梭菌α毒素是引起鸡坏死肠炎的最主要的毒素。

鸡坏死性肠炎(NE)是一种发病机制复杂、多种因素影响的肠道疾病，近年来，禽坏死性肠炎频繁发生，严重影响禽养殖业的发展。过去可以通过使用饲用抗生素来预防，得到了较好的控制。但是，抗生素的滥用的现象越来越多，细菌耐药性等问题频繁出现，严重威胁食品安全和人民健康。为此，我国农业农村部发布第194号公告，规定饲料生产企业停止生产含有促生长类药物词料添加剂(中药类除外)的商品饲料。随着饲用促生长抗生素的禁用，家禽中坏死性肠炎发生率随之增加，因此需采取有效措施来减少对家禽养殖业的影响。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供第益肽在制备抑制产气荚膜梭菌产品中的应用，第益肽第益肽是由广东容大生物股份有限公司提供，第益肽用于制备抑制产气荚膜梭菌的产品，从而能肉鸡坏死性肠炎具有良好的预防作用，第益肽产品具有其安全、没有毒副作用的优点。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

第益肽在制备抑制产气荚膜梭菌产品中的应用，第益肽是由广东容大生物股份有限公司提供，由地衣芽孢杆菌产生的抗菌肽。

进一步，所述第益肽的分子量约为4.7kDa，由42个氨基酸组成α-螺旋结构。

进一步，所述产气荚膜梭菌包括标准菌株产气荚膜梭菌、鸡产气荚膜梭菌netB+和鸡A型产气荚膜梭菌。

进一步，所述第益肽用于制备治疗鸡坏死性肠炎的产品。

进一步，所述第益肽用于制备修复鸡十二指肠组织形态和鸡空肠组织形态的产品。

进一步，所述第益肽用于制备提高鸡肠道内有益菌属的相对丰度，降低有害菌数相对丰度的产品。

进一步，所述第益肽用于提高鸡肠道短链脂肪含量的产品。

进一步，所述第益肽用于制备促鸡生长的产品。

进一步，所述产品中第益肽的质量浓度为0.5～2g/L。

进一步，所述产品为饲料添加剂。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

(1)本发明的第益肽是由广东容大生物股份有限公司提供，由地衣芽孢杆菌产生的抗菌肽。该第益肽具有抗菌活性高、稳定性高等特点，本试验结果表明抗菌肽在体外对产气荚膜梭菌有一定的抑制作用。抗菌肽对肉鸡坏死性肠炎具有良好的预防作用，表现在对肉鸡坏死性肠炎发病肉鸡空肠肉眼病变、肠黏膜组织形态结构、肠道菌群及免疫相关mRNA表达均有不同程度的改善；抗菌肽能够显著提高规模化养殖竹丝鸡的生长性能，提高空肠和盲肠绒毛长度，肠绒毛长度与隐窝深度的比值，提高盲肠短链脂肪酸的含量，降低空肠和盲肠梭菌群数量，促进有益菌的繁殖，降低肠球菌等有害菌的相对丰度，促进肠道健康，值得在肉鸡生产中推广应用。

(2)本发明进行了第益肽体外抑制产气荚膜梭菌试验；采用鸡坏死性肠炎模型，以肉眼病变记分、组织切片、荧光定量PCR、菌群高通量测序、转录组测序等科学方法对抗菌肽预防肉鸡坏死性肠炎的效果进行了系统性评价；并进一步开展了竹丝鸡肉鸡的规模化生产试验，采用组织切片、荧光定量PCR、16SrDNA高通量测序、气相色谱等方法，从肠道粘膜组织显微结构、菌群组成、短链脂肪酸含量等方面，证明第益肽能够改善规模化养殖的竹丝鸡的肠道健康水平，显著提高其生产性能。

附图说明

图1为第益肽的二级结构模拟及SDS-PAGE电泳检测图；

图2抑菌圈-牛津杯法的试液加入情况分布图；

图3为抗菌肽体外抑菌试验的各组对产气荚膜梭菌(netB+)菌株的抑菌圈大小；

图4为人工发病模型的解剖病变图；

图5为人工发病模型的菌落形态及镜检图；

图6为产气荚膜梭菌netB基因扩增结果；

图7为人工发病试验的病变评分图；其中，注：C组：人工发病对照组，AM组：阳性药物对照组，KL组：第益肽低剂量组，KM组：第益肽中剂量组，KH组：第益肽高剂量组；

图8为人工发病试验各组十二指肠组织形态图；其中，O组：普通饲料空白对照组，KB：鱼粉饲料空白对照组，C组：人工发病对照组，AM组：阳性药物对照组，KL组：第益肽低剂量组，KM组：第益肽中剂量组，KH组：第益肽高剂量组；

图9为人工发病试验各组空肠组织形态图：其中，O组：普通饲料空白对照组，KB：鱼粉饲料空白对照组，C组：人工发病对照组，AM组：阳性药物对照组，KL组：第益肽低剂量组，KM组：第益肽中剂量组，KH组：第益肽高剂量组；

图10为人工发病试验各组空肠产气荚膜梭菌测定的标准曲线；

图11为人工发病试验各组空肠肠道菌群测序的序列长度分布图；

图12为稀释曲线分析图；

图13为空肠样品分组分析图；

图14为空肠菌群Venn图分析图；

图15为门水平菌群Bar图；

图16为属水平菌群Bar图。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

1.本发明的目的和意义

本发明所用抗菌肽产品第益肽具有抗菌活性高、稳定性高等特点，可用作饲料添加剂添加到饲料里。本研究拟从以下三个方面进行研究：首先进行抗菌肽的体外抑菌实验，看抗菌肽是否对引起坏死性肠炎的产气荚膜梭菌有良好的抑制作用；其次，利用肉鸡人工发病模型，观察抗菌肽对发生坏死性肠炎后肉鸡肠道病变及形态结构态、小肠炎症和免疫相关mRNA表达以及肠道菌群变化及netB基因阳性产气荚膜梭菌数量的影响，评估其对坏死性肠炎的防控作用；第三，在肉鸡的规模化养殖试验中评价抗菌肽对肉鸡生产性能的影响，评价指标包括生产性能，肠道结构，肠道菌群等，为抗菌肽应用于肉鸡生产上提供科学依据。

目前关于抗菌肽防治肉鸡坏死性肠炎方面系统研究较少。本发明进行了第益肽体外抑制产气荚膜梭菌试验；采用鸡坏死性肠炎模型，以肉眼病变记分、组织切片、荧光定量PCR、菌群高通量测序、转录组测序等科学方法对抗菌肽预防肉鸡坏死性肠炎的效果进行了系统性评价；并进一步开展了竹丝鸡肉鸡的规模化生产试验，采用组织切片、荧光定量PCR、16SrDNA高通量测序、气相色谱等方法，从肠道粘膜组织显微结构、菌群组成、短链脂肪酸含量等方面，证明第益肽能够改善规模化养殖的竹丝鸡的肠道健康水平，显著提高其生产性能。详细方法如下：

2.材料和方法

2.1试验材料

2.1.1抗菌肽

第益肽由广东容大生物股份有限公司提供，由地衣芽孢杆菌产生，如图1所示，分子量约4.7kDa，由42个氨基酸组成α-螺旋结构。

2.1.2试验菌株

人工感染所采用的试验菌株为型产气荚膜梭菌netB阳性菌株-cpnetBF株，由本实验室分离保存。其它试验菌株为：鸡产气荚膜梭菌(netB基因型)、产气荚膜梭菌ATCC13124、鸡A型产气荚膜梭菌、鹅产气荚膜梭菌、志贺氏菌、肺炎科列伯氏菌、大肠埃希氏菌、鸡沙门氏菌、库氏菌和金黄葡萄球菌。

2.1.3试验动物

人工发病模型试验采用1日龄的817白羽肉鸡公鸡苗，购自广州市江丰实业股份有限公司。规模化养殖试验采用1日龄竹丝鸡苗，由广州市江丰实业股份有限公司提供，并在该公司花都试验场进行规模化养殖。

2.1.4日粮配方

日粮的组成与营养水平见表2。

表2日粮组成和营养水平

注：预混料为每吨饲粮提供微量元素包括：铜6.5g，铁70g，锰60g，锌60g，硒0.4g，碘0.14g；1-20日龄C101多维300g，氯化胆碱1500g；21-35日龄C101多维250g，氯化胆碱1200g；35-60日龄C101多维230g，氯化胆碱1000g。其中每千克C101多维含：维生素A 4000万IU，维生素D

2.2产气荚膜梭菌和梭菌群实时定量PCR方法的建立

2.2.1试验前准备

(1)氨苄青霉素储备液制备：精密称取20mg氨苄青霉素装入200mL已经高压灭菌的蓝口瓶中，再加入无水乙醇至200mL；低温保存备用。

(2)IPTG制备：精密称取100mg IPTG加入已经高压灭菌的2mL EP管，再加入无菌水至2mL；低温保存备用。

(3)X-Gal制备：取40mg X-Gal加入已高压灭菌的2mL EP管中，再加入二甲基甲酰胺溶液至2mL；低温保存备用。

(4)含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB固体琼脂平板的制备：高压灭菌好的100mLLB琼脂培养基，冷却到50℃左右，加入1mL氨苄青霉素储备液，然后倒入平板中制备LB琼脂平板。向铺好的含有氨苄青霉素(50μg/mL，溶剂为无水乙醇)的LB固体琼脂平板中加入16μL的IPTG(50mg/mL溶剂为无菌水)、40μL的X-Gal(20mg/mL，溶剂为二甲基甲酰胺),用涂布棒将溶液涂布均匀，避光在37℃放置1-3h。

2.1.2菌株的培养

将保存在-80℃冰箱冻存管中的鸡产气荚膜梭菌(netB+)和标准菌株产气荚膜梭菌ATCC13124取出，待解冻后，分别吸取100μL接种到FT液体培养基中，40℃厌氧培养18h。

2.1.3核酸DNA的提取

将培养好的菌液使用细菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根，DP302)进行核酸DNA的提取。将获得的DNA放到-20度保存备用。

2.1.4产气荚膜梭菌和梭菌群质粒DNA标准品的制备

(1)PCR产物片段的生成：

产气荚膜梭菌(netB+)：将培养好的没有进行稀释的鸡产气荚膜梭菌(netB+)菌液所提取的核酸进行PCR扩增。引物序列为netB-F如SEQ.ID NO:1所示，netB-R如SEQ.ID NO:2所示。普通PCR反应体系为：Taq PCR Master Mix(2×)12.5μL；Primer F 1.0μL；Primer R1.0μL；核酸DNA 1.0μL；灭菌水9.5μL，Total为25.0μL。

普通PCR反应程序：95℃预变性5分钟1个循环；95℃15s至60℃20s至72℃30s，72℃5分钟；40个循环。

梭菌群：将培养好的没有进行稀释的产气荚膜梭菌ATCC13124菌液所提取的核酸进行PCR扩增。

其中引物序列为clp-F如SEQ.ID NO:3所示，clp-R如SEQ.ID NO:4所示。荧光定量PCR体系为：SYBR Green10μL；Primer F 0.4μL；Primer R 0.4μL；核酸DNA2.0μL；灭菌水7.2μL；Total 20.0μL。

荧光定量PCR反应程序：95℃预变性300s 1个循环；95℃10s至60℃20s至72℃30s，40个循环；溶解曲线95℃15s至60℃60s至97℃1s 1个循环。

(2)对PCR产物采用普通DNA产物纯化试剂盒(北京天根，DP205)进行分离和纯化。

(3)连接：采用PGM-T克隆试剂盒(北京天根，VT302)将目标片段和T载体进行连接混合，连接采用10μL反应体系，将混合反应液置于26℃水浴反应1h或16℃过夜。

(4)转化：将连接到T载体的PCR产物加入到感受态TOP10感受态细胞中,轻弹混匀，冰浴30min，然后立即放入42℃水浴锅中水浴90s，结束后将其置于冰浴2-3min，加入预热的37℃的LB肉汤液体培养基300μL，37℃条件下以150rpm震荡培养45min，取100μL加入已经制备好的转化平板中(含有相应抗生素)，用涂布棒将菌液涂布均匀，待表面干燥后将平板倒置放入37℃培养12-16h。培养完成后筛选出阳性白班菌落。

2.2.5质粒的提取与浓度测定

(1)将挑取出较好白斑进行采用普通质粒小提试剂盒(北京天根，DP103)进行质粒的提取，提取步骤为：

1.柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500的平衡液BL,12,000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2.取1-5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm离心1mn,尽量吸除上清。

3.向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1(请先检查是否已加入RNs9A),使用涡旋震荡器彻底悬浮细菌沉淀。

4.向离心管中加入250μL溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

5.向离心管中加入350溶液P3,立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10min。

6.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，12000rpm离心60s,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

7.向吸附柱CP3中加入600l漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12.000rpm离心60s,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

8.重复操作步骤7。

9.将吸附柱CP3放入收集管中，12000pm(～13,400×g)离心2min,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。置于室温放置数分钟，彻底地晾干残留的漂洗液。

10.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加100μL洗脱缓冲液EB,室温放置2min,12000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

(2)质粒DNA标准品浓度的测定：采用紫外可见分光光度计测定DNA的OD值以及质粒标准品的浓度和纯度。利用公式：拷贝数＝(6.02×10

随后以拷贝数Lg值为横坐标，以Ct值为纵坐标，绘制绝对定量标准曲线。

2.2.6产气荚膜梭菌和梭菌群实时定量PCR的方法学验证

(1)特异性和灵敏度验证：分别提取产气荚膜梭菌标准株、鸡产气荚膜梭菌临床株，鹅产气荚膜梭菌临床株，大肠埃希氏菌临床株，鸡沙门氏菌临床株，金黄葡萄球菌临床株以及志贺氏菌临床株的基因组DNA，进行荧光定量PCR的检测，对该反应体系的特异性进行验证。

(2)重复性验证：通过取3个数量级标准品质粒加入荧光定量PCR反应体系，每个数量级重复3个反应孔，以此来测试仪器的重复性。

(3)准确性验证:

将上述培养好的菌液依次的进行10的梯度稀释，取10个空的高压灭菌的2mLep管中加入900μL的FT液体培养基，后在原液中用移液枪取100μL菌液加入到盛有900μL FT液体培养基的ep管中，震荡反复吹打使其混合均匀，按照这种操作，依次制备10

同时将上述培养好的三个浓度梯度菌液进行核酸DNA的提取，根据所建立的荧光定量PCR反应体系进行荧光定量PCR检测，利用公式：准确性＝(实测值-标准质粒模板浓度值)/标准质粒模板浓度值来评价所建立方法测定细菌数的准确性。

2.3盲肠内容物短链脂肪酸含量检测方法的建立

2.3.1混合标准品溶液的配制

(1)十万分之一天平开机预热半小时。

(2)6种短链脂肪酸标准品储备液的配制：标记好各个10mL容量瓶。将容量瓶放到天平上，清零，用100μL移液枪吸取标准品滴加其中，精密称取40mg,向容量瓶中加入乙酸乙酯，至刻度线下1—2cm处改用胶头滴管滴至与凹液面平直，定容到10mL，分别配制成约4mg/mL的乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸标准品储备液。

(3)乙基丁酸标准品贮备液的配制：精密称取10mg乙基丁酸至容量瓶中。向容量瓶中加入乙酸乙酯，至刻度线下1—2cm处改用胶头滴管滴至与凹液面平直，定容到10mL，配制成1mg/mL贮备液。取2mL内标贮备液加至10mL容量瓶中，加乙酸乙酯定容到10mL，此为内标使用液(200μg/mL 2-乙基丁酸)。

(4)用移液管分别精密量取不同体积的标准储备液，配制成混合标准品溶液，其中，各标准储备液如下：4mL浓度为1600μg/mL的乙酸，2mL浓度为800μg/mL的丙酸，2mL浓度为800μg/mL的丁酸，0.5mL浓度为200μg/mL的异丁酸，0.5mL浓度为200μg/mL的戊酸，0.5mL浓度为200μg/mL的异戊酸。

(5)梯度稀释：将混合标准品溶液用乙酸乙酯梯度稀释成不同浓度，用移液管吸取5mL标准品混合溶液加入另一个10mL容量瓶中，然后用吸取约4mL乙酸乙酯加入到容量瓶中，最后用胶头滴管吸取乙酸乙酯至刻度线。稀释梯度见表8。

表8混合标准品稀释梯度

2.3.2HS－GC气相分析条件

顶空进样器(HS-10)条件：恒温炉温度120℃，样品流路温度140℃，传输线温度160℃；样品瓶加压气压141.1kPa，样品瓶恒温时间10min，样品瓶加压时间1min，GC循环时间22min.

GC(SPL1)条件：氢气流量为60mL/min，空气流量为400mL/min，程序升温为初温80℃，以7℃/min升温至150℃，保持1min，以10℃/min升温至180℃,保持1min；进样口温度为220℃；FID检测器温度为300℃，流量30，进样模式为分流，分流比为1：10。

2.3.3短链脂肪酸含量检测方法的方法学验证

(1)标准曲线的建立

将配置好的50μL混和标准品样品加入到顶空瓶中，加入50μL(200μg/mL)2-乙基丁酸作为内标，用压盖器封好瓶口后，放入顶空进样器中进行GC检测。以待测酸的浓度为横坐标，不同浓度下标准品的峰面积与内标物的峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线，并进行拟合得线性回归方程。

(2)精密度试验

精密度实验包括日内精密度及日间精密度，日内精密度是在同一天内，取同一样品每天早、中、晚各GC测定一次，每次设立3组平行重复。日间精密度试验为同一样品连续3d进行GC测定分析，每次设立3组平行重复。通过计算各组短链脂肪酸色谱峰的保留时间和峰面积，从而计算出各组短链脂肪酸的浓度的RSD来判断方法学的精密度是否符合要求。

(3)样品加标回收率试验

取一个肠道内容物样品，测定其中短链脂肪酸含量后，分别在样品中加入低、中、高三种不同浓度的混合标准品溶液，其中低浓度的加入量是样品中原始含量的80％、中浓度的加入量是样品中原始含量的100％、高浓度的加入量是样品中原始含量的120％。加入后检测加标后样品中各种短链脂肪酸的含量，按下列公式计算加标回收率。

样品加标回收率＝(加标试样测定值-初始量)/加标量×100％

2.4试验方法

2.4.1主要溶液和培养基的制备

第益肽溶液的制备：精密称取第益肽样品0.050g、0.100g、0.200g，分别加入3个含100mL的0.1％蛋白胨水的蓝口瓶中，配置成含量为0.5g/L、1g/L、2g/L的溶液，备用；另外精密称取0.005g氨苄西林，加入含100mL的0.1％蛋白胨水的蓝口瓶中配置成0.05g/L的溶液。

试验培养基的制备：

(1)环丝氨酸的配置方法：先将使用到的器具高压灭菌，仪器表面，超净工作台进行消毒。在分析天平上称取D-环丝氨酸粉末1.000g，加10mL蒸馏水溶解。配制为10％的溶液，即0.1g/mL。然后用0.2μm滤膜过滤到无菌容器中，然后分装到2mL离心管中，每管中1.6mL，分装后放入-20℃冰箱进行保存备用。

(2)TSC培养基的制备：精确称取胰

(3)FT培养基的制备：精确称取液体硫乙醇酸盐培养基粉末(FT)11.72g，加入烧杯中，再加入蒸馏水400mL，加热搅拌使其充分溶解，121℃高压灭菌20min，备用。

(4)庖肉培养基的制备:将庖肉牛肉粒分装到20mL样品瓶中，每个样品瓶中不能超过体积的三分之一；另外精确称取液体硫乙醇酸盐粉末50g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，溶解后分装到20mL样品瓶中，然后121℃高压灭菌15min，备用。

产气荚膜梭菌悬浊液的制备：(1)取产气荚膜梭菌保存菌株接入FT液体培养基，42℃厌氧培养16h复苏，将复苏后的菌株传代2-3代后，取100μL加入含FT灭菌液体培养基的15mL离心管中，42℃厌氧培养16h；(2)使用麦氏比浊管，以生理盐水调整其浑浊度，最终使菌液浓度调整至10

2.4.2抑菌圈-牛津杯法

(1)在一次性培养皿中加入10-15mL的TSC培养基作下层培养基，重复3个平板；

(2)待凝固后，分别在每个平板均匀放置5个牛津杯(6mm)，并将培养好的菌株取1mL与9mL TSC培养基液体(50℃左右)混合后倒入上述放置了牛津杯的一次性培养皿中；

(3)待凝固后，取出牛津杯，此时3个平板中各有5个孔，并编好序号，将第益肽溶液和阳性、阴性对照分别加入其中，3个培养皿以做平行试验，孔中具体加入情况见图2。做3个平行实验。

(4)待静置1-2h后，正置，42℃厌氧培养24h；

(5)观察并测量抑菌圈的大小。抑菌实验结果将按抑菌圈直径大小作为判断敏感度高低的标准，药物敏感试验判断标准如下表9。

表9药物敏感试验判断标准

注：根据同一批次抑菌圈直径允许测试误差为±20％，超过误差则作废的标准，得到平均抑菌圈大小。

2.4.3试验设计

(1)人工发病模型试验：选取一日龄的817肉鸡，饲养到7日龄时，剔除体重过大或过小的鸡苗，随机分为7组，每组12只。分组见表10。从7日龄开始，第益肽各试验组饲料中分别添加不同剂量的第益肽；从17日龄开始，阳性药物对照组饲料中添加氨苄西林直至试验结束；O组、KB组和C组只饲喂基础日粮。从19日龄开始，除O组、KB组外，以产气荚膜梭菌菌液拌料人工感染，每天上午下午各一次，连续三天。22日龄试验结束。具体分组见表10。

表10试验分组

(2)规模化养殖实验：所有试验用鸡采用笼养模式，1日龄竹丝鸡2889只，分为生产对照组(A组)、第益肽组(B组)和空白对照组(C组)三个组，每个组中有3个重复，每个重复平均321只鸡。各阶段饲料使用情况：1-20日龄，111B小鸡料，21-35日龄，112B中鸡料，36日龄-出栏，118B大鸡料。具体分组情况如表11：

表11添加剂添加情况表

2.4.4饲养管理

(1)人工发病模型试验：试验前1周，全面清理鸡舍，先用火焰消毒笼舍、地面，再用甲醛熏蒸消毒。饲养开始后，室内温度保持在32℃左右，之后每周降2-3℃直至降到室温。每天早晚各喂一次，观察温度、湿度、饮水和采食情况。试验采用笼养方式，1～14日龄饲喂基础日粮；15～22日龄时，除普通饲料空白对照组(O组)外，其他组在基础日粮中加入鱼粉，鱼粉和基础日粮的比例为1：1。

(2)规模化养殖实验：采用笼养模式，试验时间为肉鸡的整个饲养周期。1-35日龄时，在育雏舍饲喂，密度为每平方50只；35日龄后转移至育成舍，每笼2只鸡。所有鸡只均按公司日常管理程序进行饲养管理和免疫，自由采食，由乳头式饮水器供水，试验期间由每天观察鸡的健康状况，登记各组每天各组鸡死淘数和饲料消耗量。

2.4.5病变记分

22日龄时，所有鸡脱颈处死，逐个剖检观察，记录小肠病变，病变按以下标准进行评分：

表12坏死性肠炎病变记分标准

2.4.6样品和数据的采集

(1)人工发病模型试验：

22日龄时，分别从各组中随机抽取6只鸡，解剖后取其十二指肠肠段、空肠肠段各约1cm，用4％的多聚甲醛进行固定并编号。取出小肠，分然后再剪开空肠，取肠道内的内容物放入2mL灭菌离心管内，分装成2管，过液氮后，放入-80℃冰箱保存备用。小肠用Hanks液漂洗干净内容物后，放置在冰上的无菌培养皿中，用玻片轻轻刮取肠黏膜，放入离心管中，-80℃保存。

(2)规模化养殖试验：

55日龄时统计生长性能相关数据，包括每组合格鸡(活体体重＞1.3kg)体重、合格存活个体数、死淘数以及饲料消耗，计算肉鸡的合格品出栏率、平均日采食量、平均体重以及料肉比等。合格品出栏率＝合格活体数/总饲养数×100％。

20、35和55日龄时，分别从各组的每个平行重复小组中随机抽取6只鸡，脱颈处死，取空肠肠段和盲肠肠段(各约1cm)用4％的多聚甲醛进行固定并编号。将盲肠肠段剪开，取肠道内的内容物放入2mL灭菌离心管内并分别编号，干冰中暂存，回实验室后移至-80℃保存。剪开空肠和盲肠，分别取小肠和盲肠的肠道内的内容物放入2mL灭菌离心管内(其中在20和35日龄时小肠和盲肠内容物各取一管，55日龄时各取两管)并编号，过液氮后，干冰中暂存，回实验室后放入-80℃保存。

2.4.7肠道组织形态测定

(1)将用4％的多聚甲醛固定好的样本修剪、脱水后，进行石蜡包埋与切片机切片。

(2)处理好后的石蜡切片进行脱蜡处理，依此放入二甲苯Ⅰ20min，二甲苯Ⅱ20min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，75％酒精5min，然后用自来水冲洗干净。

(3)苏木素染色：将切片放入苏木素染液中浸泡3～5min，取出用自来水洗干净，用分化液分化和返蓝液返蓝，最后再次用自来水冲洗干净。

(4)伊红染色：将切片依次放入85％和95％浓度梯度的酒精中各脱水5min，然后放入伊红染液中浸泡5min。

(5)脱水封片：将染色完毕的切片依次放入无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，无水乙醇Ⅲ5min，二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min，最后用中性树胶进行封片。

(6)显微镜镜检和图像采集分析：用Nikon Eclipse E100光学显微镜进行镜检，选取目标区域进行20倍成像。之后用Image-Pro Plus 6.0分析软件，以毫米作为标准单位，对每个样品切片中5根肠绒毛高度和隐窝深度进行测量。

2.4.8内容物中产气荚膜梭菌和梭菌群数量的测定

将采取的空肠内容物用天平精密称取200mg，采用粪便基因组DNA提取试剂盒(北京天根，DP328)进行核酸DNA的提取：

1.称取粪便样本180-220mg至2mL离心管中，并将管子置于冰上。

2.向样本中加入500μL缓冲液SA,100μL缓冲液SC,15μL Proteinase K,0.25g的研磨珠间歇振荡1min至样本充分混匀。

3.95℃孵育15min,孵育期间震荡2-3次。

4.涡旋15s,12000rpm离心3min,转移上清液至新的离心管中，加入10μL的RNaseA,震荡混匀后室温放置5min。

5.加入200μL缓冲液SH,震荡混匀，置冰上5min.

6.12000rpm离心3min.

7.将上一步所得上清液转移至新的1.5mL离心管，加入等体积缓冲液GFA(使用前请先检查是否已加入异丙醇)。

8.将上一步所得溶液加入到一个吸附柱CR2中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30sec,倒掉废液，将吸附柱CR2放入收集管中。

9.向吸附柱CR2中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s,倒掉废液，将吸附柱CR2放入收集管中。

10.向吸附柱CR2中加入700μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s,倒掉废液，将吸附柱CR2放入收集管中。

11.重复操作步骤10。

12.将吸附柱CR2放回收集管中，12000rpm离心2min,倒掉废液。将吸附柱

CR2置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

13.将吸附柱CP2置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μL洗脱缓冲液TB,室温放置2min,12000rpm离心2min将溶液收集到离心管中。

随后根据所建立的荧光定量PCR反应体系进行荧光定量PCR检测，随后根据Ct值计算出相对应的细菌数量Lg值。

2.4.9肠道菌群高通量的测定

(1)样品DNA抽提与16SrDNA测序：

采用粪便基因组DNA提取试剂盒(步骤同上)对采取的另一管空肠道内容物进行核酸DNA的提取，检测提取所得DNA的纯度，浓度之后。根据细菌16SrDNA的V3-V4可变区进行引物设计。

引物序列：338F如SEQ.ID NO:5所示和806R如SEQ.ID NO:6所示，并且进行PCR扩增测序。

PCR反应体系：20μL，其中包括4μL 5XFastPfu缓冲液，2μL 2.5mMdNTPs，0.4μL的上游引物，0.4μL的下游引物，0.4μL FastPfu聚合酶，0.2μLBSA，10ng模板DNA及ddH2O。PCR反应参数为：95℃预热3min。然后95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，循环35次。之后72℃延伸10min。全部样本按照正式实验条件进行，每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收PCR产物，随后进行洗脱；最后用2％琼脂糖电泳进行检测。PCR扩增产物检测合格后送至上海美吉生物有限公司进行基因测序。

(2)测序数据分析：

利用Illumina测序得到的PEreads根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，随后进行OTU聚类分析和物种分类学分析，基于OTU聚类分析可以进行多种多样性指数分析，从而对测序深度的检测；基于分类学分析可以在各个水平上进行菌群结构的统计分析。在上述两项分析的基础上，对多样本的菌群组成进行一系列深入的统计学和可视化分析。

2.4.10空肠黏膜免疫相关mRNA表达基因的测定

(1)组织RNA的提取：

RNA浓度以及纯度的检测：以配置好的无RNA酶的水作为参照，取1μL提取的总RNA于微量分光光度计测定浓度，OD260/OD280比值应在1.8-2.0之间；RNA总量≥1μg，浓度≥35ng/ΜL。

(2)转录组测序分析:

核酸RNA检验合格后，利用Oligo磁珠分离出mRNA并对其片段大小进行筛选和纯化，随后再以mRNA为模板合成双链cDNA，并对双链cDNA末端进行修复。最后使用IIllumina平台进行转录组测序，利用Cutadap软件对数据进行质控，使用TPM值作为基因表达量。

(3)逆转录与荧光定量PCR验证：

使用2-ΔΔCt法分析相关细胞因子的表达，目的基因的相对表达以鸡ACTB作为内参基因。荧光定量PCR所用基因引物序列如下：ACTB-F如SEQ.ID NO:7所示，ACTB-R如SEQ.IDNO:8所示，ACTB基因的产物大小为169bp；IL-7-F如SEQ.ID NO:9所示，IL-7-R如SEQ.ID NO:10所示，IL-7基因的产物大小为126bp；CXCL13-F如SEQ.ID NO:11所示，CXCL13-R如SEQ.IDNO:12所示，CXCL13基因的产物大小为107bp；WNT-4F如SEQ.ID NO:13所示，WNT-4-R如SEQ.ID NO:14所示，WNT-4基因的产物大小为125bp；CRTAM-F如SEQ.ID NO:15所示，CRTAM-R如SEQ.ID NO:16所示，CRTAM基因的产物大小为127bp；IL8-F如SEQ.ID NO:17所示，IL8-R如SEQ.ID NO:18所示，IL8基因的产物大小为117bp；C1QC-F如SEQ.ID NO:19所示，C1QC-R如SEQ.ID NO:20所示，C1QC基因的产物大小为124bp；NR1D1-F如SEQ.ID NO:21所示，NR1D1-R如SEQ.ID NO:22所示，NR1D1基因的产物大小为107bp；IRF5-F如SEQ.ID NO:23所示，IRF5-R如SEQ.ID NO:24所示，IRF5基因的产物大小为138bp；RELA-F如SEQ.ID NO:25所示，RELA-R如SEQ.ID NO:26所示，RELA基因的产物大小为142bp；IFN-A-F如SEQ.ID NO:27所示，IFN-A-R如SEQ.ID NO:28所示，IFN-A基因的产物大小为111bp。

2.4.11肠道内容物短链脂肪酸含量的测定

(1)肠道内容物样品前处理：将保存于-80℃冰箱的肠道内容物样品放置于冰上解冻30min，用十万分之一分析天平准确称取200mg鸡盲肠内容物，于2mL离心管中，向离心管中加入500μL纯水，10000rpm离心30s；取出后用涡旋混合器振荡混匀3min，再在4℃、12000rpm离心10min；取上清液于一新的2mL离心管中，加入100μL25％的偏磷酸溶液，振荡混匀2min，冰浴10min，4℃、12000rpm离心10min；取上清液于新的2mL离心管中，加入500μL乙酸乙酯，振荡混匀3min，4℃、12000rpm离心10min，取上清液，待气相色谱(GC)检测。

(2)取上述处理好的上清液50μL于顶空瓶中，加入50μL(200μg/mL)2-乙基丁酸作为内标，用压盖器封好瓶口后，放入顶空进样器中进行GC检测。

2.4.12统计学方法

本实验中的数据采用SPSS26软件进行统计学分析，使用Graphpad prism 8进行作图。方差分析使用单因素方差分析，多重比较采用LSD法，P<0.05表示差异显著；P>0.05表示没有显著性差异。

3结果与分析

3.1抗菌肽体外抑菌试验结果及分析

不同浓度的第益肽溶液及氨苄西林阳性药物对产气荚膜梭菌(netB+)菌株的抑菌作用结果见图3。

抑菌圈大小见表14。从表中可看出，随着第益肽浓度的逐渐增加，对产气荚膜梭菌菌株的抑菌圈直径逐渐增大，抑菌活性逐渐增强。但三种不同浓度的第益肽溶液对产气荚膜梭菌菌株的敏感程度均为低敏；而氨苄西林阳性药物对产气荚膜梭菌菌株的敏感程度为高敏。

表14各组抑菌圈大小

3.2人工发病模型试验结果及分析

3.2.1人工发病模型成立

普通饲料空白对照组(O组)与鱼粉饲料空白对照组(KB组)的肉鸡外观和行为观察正常，剖检均没有观察到包括鸡小肠黏膜在内的任何病变，说明实验鸡在饲养过程中没有受到意外感染。人工发病对照组(C组)可见典型的小肠坏死灶，坏死性肠炎特征病变明显，病变记分在所有组中最高；阳性药物对照组(AM组)和第益肽高中低剂量组显著改善了病变，病变记分显著降低。说明本试验鸡坏死性肠炎人工发病成立。病变见图4。

蘸取病变部位的棉拭子在TSC培养基上划线，典型菌落颜色呈黑色、形状呈圆形、表面光滑；镜检显示菌株两端钝圆、粗大。菌落形态及镜检见图5。

使用netB基因的特异性引物进行PCR扩增，均显示384bp大小的条带，与预期目标片段大小一致，鉴定为产气荚膜梭菌netB基因阳性型产气荚膜梭菌。结果见图6。

3.2.2人工发病试验各组病变记分结果

产生的病变记分如表15所示，由表可知，人工发病对照组(C组)的平均病变记分显著高于其他各组，即阳性药物对照组(AM组)、第益肽高中低剂量组均有显著预防效果(P＜0.05)。而第益肽高中低剂量组与阳性药物对照组之间的病变平均分差异不显著(P＞0.05)。各组平均病变记分见图7。

表15病变记分结果

注：单因素方差分析检测各组间差异性，标注相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，标注不同字母表示差异显著(P＜0.05)。

3.2.3人工发病试验各组十二指肠组织形态变化

各组十二指肠组织形态由图8所示。

由图8可知，人工发病组的十二指肠局部粘膜变矮，较多的肠绒毛消失，表面变平，粘膜上皮脱落；对应的固有层腺体明显减少分布稀疏，可见大量的淋巴细胞和散在的嗜酸性粒细胞浸润。第益肽各剂量组的十二指肠少量的黏膜上皮细胞脱落；肠腺丰富，肌层肌纤维着色均匀，形态正常；未见明显的炎性细胞浸润。

十二指肠绒毛长度、隐窝深度及其比值见表16。由表16可知，普通饲料空白对照组(O组)和鱼粉饲料空白对照组(KB组)肠绒毛长度显著高于其他5组；第益肽高中低剂量组和阳性药物对照组(AM组)肠绒毛长度显著高于人工发病对照组(C组)(P＜0.05)；第益肽低剂量组(KL组)肠绒毛长度显著高于第益肽高剂量组(KH组)和阳性药物对照组(AM组)(P＜0.05)。

普通饲料空白对照组(O组)、鱼粉饲料空白对照组(KB组)、第益肽低剂量组(KL组)和第益肽中剂量组(KM组)肠隐窝深度显著高于第益肽高剂量组(KH组)、阳性药物对照组(AM组)以及人工发病对照组(C组)(P＜0.05)。

阳性药物对照组(AM组)和第益肽高中低剂量组肠绒毛长度与肠隐窝深度比值显著高于人工发病对照组(C组)(P＜0.05)；普通饲料空白对照组(O组)和鱼粉饲料空白对照组(KB组)肠绒毛长度与隐窝深度比值显著高于第益肽中剂量组(KM组)和第益肽低剂量组(KL组)(P＜0.05)。

表16十二指肠肠绒毛长度、肠隐窝深度及其比值

注：单因素方差分析检测各组间差异性，标注相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，标注不同字母表示差异显著(P＜0.05)。

3.2.4人工发病试验各组空肠组织形态变化

各组空肠组织形态由图9所示。

由图9可知，人工发病组的十二指肠局部粘膜变矮，较多的肠绒毛消失，表面变平，粘膜上皮脱落；对应的固有层腺体明显减少分布稀疏，可见大量的淋巴细胞和散在的嗜酸性粒细胞浸润。第益肽各剂量组的十二指肠少量的黏膜上皮细胞脱落；肠腺丰富，肌层肌纤维着色均匀，形态正常；未见明显的炎性细胞浸润。

十二指肠绒毛长度、隐窝深度及其比值见表17。由表17可知，普通饲料空白对照组(O组)和鱼粉饲料空白对照组(KB组)肠绒毛长度显著高于其他5组；第益肽高中低剂量组和阳性药物对照组(AM组)肠绒毛长度显著高于人工发病对照组(C组)(P＜0.05)；第益肽低剂量组(KL组)肠绒毛长度显著高于第益肽高剂量组(KH组)和阳性药物对照组(AM组)(P＜0.05)。

普通饲料空白对照组(O组)、鱼粉饲料空白对照组(KB组)、第益肽低剂量组(KL组)和第益肽中剂量组(KM组)肠隐窝深度显著高于第益肽高剂量组(KH组)、阳性药物对照组(AM组)以及人工发病对照组(C组)(P＜0.05)。

阳性药物对照组(AM组)和第益肽高中低剂量组肠绒毛长度与肠隐窝深度比值显著高于人工发病对照组(C组)(P＜0.05)；普通饲料空白对照组(O组)和鱼粉饲料空白对照组(KB组)肠绒毛长度与隐窝深度比值显著高于第益肽中剂量组(KM组)和第益肽低剂量组(KL组)(P＜0.05)。

表17十二指肠肠绒毛长度、肠隐窝深度及其比值

/>

注：单因素方差分析检测各组间差异性，标注相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，标注不同字母表示差异显著(P＜0.05)。

3.2.5人工发病试验各组空肠产气荚膜梭菌测定方法学建立及验证

(1)标准曲线的建立

通过分光光度计中测所提质粒DNA标准品OD值、质粒标准品的浓度和纯度，计算得质粒DNA标准品拷贝数。

纯度：OD260/OD280＝0.020/0.011＝1.818。浓度：16.363ng/μL。拷贝数：(6.02×10

取10

(2)特异性验证

特异性结果由表18可知，除鸡产气荚膜梭菌(netB+)外，其它菌株Ct值大于30，说明特异性良好。因此，该曲线的Ct值特异性范围在30以下。

表18特异性试验结果

(3)重复性验证

对三种不同数量级模板浓度的质粒标准品加入反应体系中，每个数量级重复三次，从而计算出Ct值之间的相对标准偏差。结果如表19可知，不同重复的相对标准偏差在0.05％-0.40％之间；重复性良好，表明本方法具有较好的精密度，符合检测要求。

表19重复性试验结果

(4)准确性验证

由表20可知，产气荚膜梭菌计数的准确性在-7.98％-6.01％之间，符合检测要求，表明该方法的准确性良好。

表20准确性试验结果

3.2.6人工发病试验各组空肠内容物中产气荚膜梭菌数量的测定

由表21可知，人工发病对照组(C组)肉鸡空肠的产气荚膜梭菌数量Lg值要显著高于阳性药物对照组(AM组)和第益肽高中低剂量组(P＜0.05)；第益肽低剂量组(KL组)的产气荚膜梭菌数量Lg值要显著高于阳性药物对照组(AM组)以及第益肽高剂量组(KH组)(P＜0.05)。

表21空肠产气荚膜梭菌含量的Lg值

注：Ct值与菌数Lg值趋势相反。单因素方差分析检测各组间差异性，标注相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，标注不同字母表示差异显著(P＜0.05)。

3.2.7人工发病试验各组空肠肠道菌群测序结果及分析

(1)空肠样品菌群测序信息统计：

根据图结果显示样品测序序列长度均分布在401bp-440bp之间，且主要分布在421bp-440bp之间，如图11所示。空肠共检测得到的OTU数为474个，其中属于319种，211属，100科，51目，17纲，8门，1界。

(2)稀释曲线分析：

稀释曲线分析如图12所示，随着样本测序深度的增加，表观实际观测到的物种丰度(sobs指数)在OTU水平下不断增加。但是曲线最终都趋于平坦，表示测序深度足够，实际观测到的物种数目能够基本覆盖肠内容物样品内的菌群物种。即所检测数据可信，可以进行后续分析。

(3)α多样性分析：

由表22可知，在空肠的各组样品中，Coverage指数均大于0.998，即各组样品检测覆盖率均达到了99.8％以上，说明检测结果可信。各组样品中，阳性药物对照组(AM组)的Sobs指数显著高于其他各组(P＜0.05)，说明阳性药物对照组(AM组)的菌群丰富度最大。第益肽高剂量组(KH组)的Shannon指数显著高于第益肽低剂量组(KL组)和鱼粉饲料空白对照组(KB组)(P＜0.05)，说明第益肽高剂量组(KH组)的菌群多样性最多。鱼粉饲料空白对照组(KB组)的Simpson指数显著高于其他各组(P＜0.05)，说明鱼粉饲料空白对照组(KB组)的菌群均匀度最大。

表22空肠α多样性指数分析

注：单因素方差分析检测各组间差异性，标注相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，标注不同字母表示差异显著(P＜0.05)。

4讨论

4.1抗菌肽对产气荚膜梭菌的体外抑制作用

抗菌肽作为绿色饲料添加剂以抗菌活性良好、不易产生抗药性、无药物残留等优点而受关注。本试验以产气荚膜梭菌为测试菌株，通过牛津杯法来初步检测研究不同浓度的第益肽溶液对产气荚膜梭菌体外抑菌效果。结果表明，三种不同浓度的第益肽溶液对试验菌株均有不同程度的抑制作用。但结果也发现不同浓度的第益肽溶液对产气荚膜梭菌抑菌效果的敏感程度均较低，为低度敏感；因此在防治坏死性肠炎的过程中，需要在饲料中可能需要添加较长的时间才能起作用。

5 结论与展望

5.1 结论

(1)第益肽在体外对产气荚膜梭菌具有一定的抑制作用，表现为低敏。

(2)人工发病模型试验结果表明，第益肽对肉鸡坏死性肠炎有明显的预防效果。

第益肽可显著减轻鸡坏死性肠炎病变记分，对坏死性肠炎所造成的肉鸡空肠肠道形态结构有明显改善作用，肠绒毛长度与隐窝深度比值明显增高；能显著降低小肠内netB阳性的产气荚膜梭菌的数量；能够提高人工发病鸡空肠肠道菌群中拟杆菌和厚壁菌的比值，提高了有益菌属的相对丰度，降低了有害菌属的相对丰度，对坏死性肠炎所造成肉鸡空肠肠道菌群的紊乱有不同程度的改善作用；还能显著降低IL-7、IL-8等促炎细胞因子的表达，促进α-干扰素的表达，对发病肉鸡肠道的炎症有明显的改善作用。

(3)竹丝鸡规模化生产试验结果表明，第益肽对竹丝鸡有显著的促生长作用，提高了合格品出栏率，降低料肉比。

第益肽对不同日龄的竹丝鸡均可显著提高竹丝鸡空肠和盲肠的肠绒毛长度，降低肠隐窝深度和提高肠绒毛长度与隐窝深度比值；能够显著提高35日龄竹丝鸡盲肠内乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸等短链脂肪酸含量；能够显著降低竹丝鸡空肠和盲肠的梭菌群梭菌数量；显著提高了拟杆菌属等有益菌属的相对丰度，降低了肠球菌属、梭菌属等有害菌属的相对丰度，并且降低空肠和盲肠菌群潜在致病力表型贡献度，促进了肠道健康。

5.2创新点

目前关于抗菌肽防治肉鸡坏死性肠炎方面系统研究较少。本研究的创新之处在于，进行了第益肽体外抑制产气荚膜梭菌试验；采用鸡坏死性肠炎模型，以肉眼病变记分、组织切片、荧光定量PCR、菌群高通量测序、转录组测序等科学方法对抗菌肽预防肉鸡坏死性肠炎的效果进行了系统性评价；并进一步开展了竹丝鸡肉鸡的规模化生产试验，采用组织切片、荧光定量PCR、16SrDNA高通量测序、气相色谱等方法，从肠道粘膜组织显微结构、菌群组成、短链脂肪酸含量等方面，证明第益肽能够改善规模化养殖的竹丝鸡的肠道健康水平，显著提高其生产性能。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。