一种测定广藿香叶中挥发油含量的方法

技术领域

本发明涉及药物检测技术领域，尤其涉及一种测定广藿香叶中挥发油含量的方法。

背景技术

广藿香是多年生芳香草本或半灌木，产地分布广泛，在印度、马来西亚和菲律宾均有种植，在我国广东、海南、广西、福建等地广为栽培。广藿香中含有丰富的挥发油，在改善胃肠功能、缓解咳嗽、舒缓神经、驱虫杀菌和改善皮肤问题等具有显著的功效。2020版《中国药典》规定百秋李醇为广藿香的质量评价指标，且目前的文献研究也大多集中于该成分，但由于广藿香中的化学成分众多，现有评价方法会导致广藿香的质量参差不齐。因此，如何提供一种更全面的评价广藿香药材质量的方法成为了本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种测定广藿香叶中挥发油含量的方法。其目的是解决现有评价方法会导致广藿香的质量参差不齐的技术问题。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种测定广藿香叶中挥发油含量的方法，所述挥发油包括百秋李醇、β-榄香烯、β-石竹烯、石竹素和金合欢醇；

该方法包括以下步骤：

S1、将百秋李醇、β-榄香烯、β-石竹烯、石竹素和金合欢醇分别与乙酸乙酯混合得到储备液；

S2、将各个储备液混合得到对照品溶液，对不同浓度的对照品溶液分别进行GC-MS分析，以挥发油的峰面积为纵坐标，以挥发油的浓度为横坐标，绘制标准曲线；以信噪比S/N＝10时挥发油的浓度为最低定量限；

S3、将广藿香叶粉与乙酸乙酯混合后，顺次进行超声提取、定容、离心、过滤即得供试品溶液，对供试品溶液进行GC-MS分析，在标准曲线上读取挥发油的浓度。

进一步的，所述步骤S1中，储备液的浓度独立的为0.5～2mg/mL。

进一步的，所述步骤S2中，在对照品溶液中，百秋李醇的浓度为120～160μg/mL，β-榄香烯的浓度为20～30μg/mL，β-石竹烯的浓度为35～45μg/mL，石竹素的浓度为90～100μg/mL，金合欢醇的浓度为75～85μg/mL。

进一步的，所述步骤S2中，不同浓度的对照品溶液共9个浓度，包括初始浓度以及依次将对照品溶液稀释2倍、2倍、2倍、2.5倍、2倍、2.5倍、2倍和2倍。

进一步的，所述步骤S3中，广藿香叶粉的粒径≥10目；供试品溶液的浓度为0.01～0.1g/mL。

进一步的，所述步骤S3中，超声提取的功率为200～400W，频率为30～50KHz，时间为30～50min。

进一步的，所述步骤S3中，离心的转速为10000～20000r/min，离心的时间为10～20min。

进一步的，所述步骤S2和步骤S3中，GC-MS的色谱条件独立的为：

色谱柱为HP5-MS(0.25μm×0.25mm×30m)毛细管色谱柱；载气为氦气，纯度≥99.99％；分流模式的分流比为20：1；流速为1.0～2.0mL/min；进样量为0.5～2μL；进样口温度为240～280℃；色谱柱温度程序：起始温度为140℃；以2℃/min升温至150℃；然后以12℃/min升温至180℃，保持2min。

进一步的，所述步骤S2和步骤S3中，GC-MS的质谱条件独立的为：

离子源为EI源；扫描模式为Scan监测模式；扫描范围为m/z 35～500；检测器电压为1.3kV；离子源温度为200～250℃；接口温度为220～260℃；溶剂延迟为2.5min。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明的技术方案具有简便、灵敏度高、分析速度快、专属性强等优势，从而能够更加全面、准确地用于广藿香药材的质量控制，以解决现有评价方法会导致广藿香的质量参差不齐的技术问题。

附图说明

图1为实施例2的GC-MS TIC图。

具体实施方式

本发明提供了一种测定广藿香叶中挥发油含量的方法，所述挥发油包括百秋李醇、β-榄香烯、β-石竹烯、石竹素和金合欢醇；

该方法包括以下步骤：

S1、将百秋李醇、β-榄香烯、β-石竹烯、石竹素和金合欢醇分别与乙酸乙酯混合得到储备液；

S2、将各个储备液混合得到对照品溶液，对不同浓度的对照品溶液分别进行GC-MS分析，以挥发油的峰面积为纵坐标，以挥发油的浓度为横坐标，绘制标准曲线；以信噪比S/N＝10时挥发油的浓度为最低定量限；

S3、将广藿香叶粉与乙酸乙酯混合后，顺次进行超声提取、定容、离心、过滤即得供试品溶液，对供试品溶液进行GC-MS分析，在标准曲线上读取挥发油的浓度。

在本发明中，所述步骤S1中，储备液的浓度独立的为0.5～2mg/mL，优选为0.8～1.5mg/mL，进一步优选为1.0mg/mL。

在本发明中，所述步骤S2中，在对照品溶液中，百秋李醇的浓度为120～160μg/mL，优选为140～155μg/mL，进一步优选为150μg/mL；β-榄香烯的浓度为20～30μg/mL，优选为22～26μg/mL，进一步优选为25μg/mL；β-石竹烯的浓度为35～45μg/mL，优选为37～42μg/mL，进一步优选为40μg/mL；石竹素的浓度为90～100μg/mL，优选为94～99μg/mL，进一步优选为98μg/mL；金合欢醇的浓度为75～85μg/mL，优选为78～82μg/mL，进一步优选为80μg/mL。

在本发明中，所述步骤S2中，不同浓度的对照品溶液共9个浓度，包括初始浓度以及依次将对照品溶液稀释2倍、2倍、2倍、2.5倍、2倍、2.5倍、2倍和2倍。

在本发明中，所述步骤S3中，广藿香叶粉的粒径≥10目，优选为≥15目，进一步优选为≥20目；供试品溶液的浓度为0.01～0.1g/mL，优选为0.04～0.06g/mL，进一步优选为0.05g/mL。

在本发明中，所述步骤S3中，超声提取的功率为200～400W，优选为250～350W，进一步优选为300W；频率为30～50KHz，优选为35～45KHz，进一步优选为40KHz；时间为30～50min，优选为35～45min，进一步优选为40min。

在本发明中，所述步骤S3中，离心的转速为10000～20000r/min，优选为12000～16000r/min，进一步优选为14000r/min；离心的时间为10～20min，优选为12～18min，进一步优选为12～14min。

在本发明中，所述步骤S2和步骤S3中，GC-MS的色谱条件独立的为：

色谱柱为HP5-MS(0.25μm×0.25mm×30m)毛细管色谱柱；载气为氦气，纯度≥99.99％；分流模式的分流比为20：1；流速为1.0～2.0mL/min，优选为1.2～1.8mL/min，进一步优选为1.4～1.6mL/min；进样量为0.5～2μL，优选为0.8～1.5μL，进一步优选为1.0μL；进样口温度为240～280℃，优选为250～270℃，进一步优选为260℃；色谱柱温度程序：起始温度为140℃；以2℃/min升温至150℃；然后以12℃/min升温至180℃，保持2min。

在本发明中，所述步骤S2和步骤S3中，GC-MS的质谱条件独立的为：

离子源为EI源；扫描模式为Scan监测模式；扫描范围为m/z 35～500；检测器电压为1.3kV；离子源温度为200～250℃，优选为220～240℃，进一步优选为230℃；接口温度为220～260℃，优选为230～250℃，进一步优选为240℃；溶剂延迟为2.5min。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明实施例使用的广藿香叶的产地及批号如表1所示。

表1实施例使用的广藿香叶的来源信息表

实施例1

分别称取β-榄香烯、β-石竹烯、石竹素、百秋李醇和金合欢醇，加乙酸乙酯定容至10mL，分别配制成1mg/mL的储备液，在4℃的冰箱储存备用。

上述原料的来源及批号如下：百秋李醇(批号：DSTDB004102)、β-榄香烯(批号：DSTDL026701)、β-石竹烯(批号：DSTDS009501)、石竹素(批号：DSTDS021001)购自成都德思特生物技术有限公司；金合欢醇(批号：M27GS143435)购自上海源叶生物科技有限公司；乙酸乙酯(分析纯)由天津市康科德科技有限公司提供。

将各个储备液混合，用乙酸乙酯调控配制成β-榄香烯浓度为25μg/mL，β-石竹烯浓度为40μg/mL，石竹素浓度为98μg/mL，百秋李醇浓度为150μg/mL，金合欢醇浓度为80μg/mL的对照品溶液，然后再用乙酸乙酯将对照品溶液依次稀释2倍、2倍、2倍、2.5倍、2倍、2.5倍、2倍和2倍得到9个不同浓度的对照品溶液，取各个对照品溶液1μL进行GC-MS分析，以挥发油的峰面积为纵坐标(Y)，以挥发油的浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线；在对对照品溶液逐步稀释时，以信噪比S/N＝10时挥发油的浓度为最低定量限(LLOQ)，结果见表2。

表2不同挥发油的标准曲线回归方程、最低定量限

将批次1的广藿香叶用粉碎机粉碎后过10目筛，然后称取0.5g广藿香粗粉置于10mL容量瓶中，加乙酸乙酯定容至刻度，超声(功率300W，频率40KHz)提取40min，取出放至室温，补足至刻度，取1mL该溶液，在14000r/min下离心10min，取上清液用0.22μm有机微孔滤膜过滤，续滤液即为供试品溶液，将供试品溶液进行GC-MS分析，在标准曲线上读取挥发油的浓度。

本实施例所使用的GC-MS的色谱条件为：

色谱柱为HP5-MS(0.25μm×0.25mm×30m)毛细管色谱柱；载气为氦气，纯度≥99.99％；分流模式的分流比为20：1；流速为1.8mL/min；进样量为1μL；进样口温度为260℃；色谱柱温度程序：起始温度为140℃；以2℃/min升温至150℃；然后以12℃/min升温至180℃，保持2min。

GC-MS的质谱条件为：

离子源为EI源；扫描模式为Scan监测模式；扫描范围为m/z 35～500；检测器电压为1.3kV；离子源温度为230℃；接口温度为240℃；溶剂延迟为2.5min。

实施例2

用批次2的广藿香叶代替批次1，其余步骤与实施例1相同。

图1为本实施例的GC-MS TIC图，由图1可得，混合对照品溶液(图1A)和批次2的广藿香叶(图1B)中5种化学成分之间互不干扰，各化学成分的色谱峰对称性良好，分离度高。

实施例3

用批次3的广藿香叶代替批次1，其余步骤与实施例1相同。

实施例4

用批次4的广藿香叶代替批次1，其余步骤与实施例1相同。

实施例5

用批次5的广藿香叶代替批次1，其余步骤与实施例1相同。

实施例6

用批次6的广藿香叶代替批次1，其余步骤与实施例1相同。

实施例7

用批次7的广藿香叶代替批次1，其余步骤与实施例1相同。

实施例8

用批次8的广藿香叶代替批次1，其余步骤与实施例1相同。

实施例9

用批次9的广藿香叶代替批次1，其余步骤与实施例1相同。

实施例10

用批次10的广藿香叶代替批次1，其余步骤与实施例1相同。

实施例11

用批次11的广藿香叶代替批次1，其余步骤与实施例1相同。

实施例12

用批次12的广藿香叶代替批次1，其余步骤与实施例1相同。

实施例1～12的测定结果如表3所示。

表3不同批次藿香叶中5种化学成分的含量(μg/g，n＝3)

精密度测试：

精密度(日内)：按照实施例2的方法，将供试品溶液连续进样6次，记录各化学成分的峰面积，分别计算5种化学成分含量的RSD值，结果见表4。

表4化学成分的日内精密度(n＝6)

由表4可得，本发明提供的检测方法的日内精密度良好。

精密度(日间)：按照实施例2的方法，将供试品溶液重复进样2次，连续进样3天，记录各化学成分的峰面积，分别计算5种化学成分含量的RSD值，结果见表5。

表5化学成分的日间精密度(n＝6)

由表5可得，本发明提供的检测方法的日间精密度良好。

重复性测试：

将实施例2的测定方法重复6次，分别计算5种化学成分含量的RSD值，结果见表6。

表6化学成分的重复性(μg/g，n＝6)

由表6可得，本发明提供的检测方法的重复性较好。

稳定性测试：

按照实施例2的测试方法，每间隔3个小时进样一次，共进样6次，记录各化学成分的峰面积，考察室温条件下的稳定性，计算其RSD值，结果见表7。

表7化学成分的稳定性(n＝6)

由表7可得，广藿香叶中的5种化学成分在室温放置15h条件下均稳定。加样回收率实验：

分别称取β-榄香烯、β-石竹烯、石竹素、百秋李醇和金合欢醇，加乙酸乙酯定容至10mL配制成储备液，其中，β-榄香烯、β-石竹烯、石竹素和金合欢醇的浓度均为1mg/mL，百秋李醇的浓度为10mg/mL，在4℃的冰箱储存备用。

上述原料的来源及批号如下：百秋李醇(批号：DSTDB004102)、β-榄香烯(批号：DSTDL026701)、β-石竹烯(批号：DSTDS009501)、石竹素(批号：DSTDS021001)购自成都德思特生物技术有限公司；金合欢醇(批号：M27GS143435)购自上海源叶生物科技有限公司；乙酸乙酯(分析纯)由天津市康科德科技有限公司提供。

将批次2的广藿香叶用粉碎机粉碎后过10目筛，然后称取0.25g广藿香粗粉置于10mL容量瓶中，加乙酸乙酯定容至刻度，超声(功率300W，频率40KHz)提取40min，取出放至室温，补足至刻度，取1mL该溶液，在14000r/min下离心10min，取上清液用0.22μm有机微孔滤膜过滤，续滤液即为供试品溶液，在4℃的冰箱储存备用。

取β-榄香烯储备液14μL、β-石竹烯储备液23μL、石竹素储备液43μL、金合欢醇储备液4μL和百秋李醇储备液118μL加入到供试品溶液中，用甲醇定容至10mL，然后进行GC-MS分析，在标准曲线上读取挥发油的浓度，并做5组平行实验，实验结果见表8。

表8化学成分的加样回收率(μg，n＝6)

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。