一种用于治疗肌腱损伤的复合活性成分及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种用于治疗肌腱损伤的复合活性成分及其制备方法和应用，涉及血浆制剂技术领域。

背景技术

富血小板血浆(Platelet rich plasma,PRP)是通过离心法从自体血中提取出来的血小板浓缩物。经研究发现，PRP可以促进骨和软组织的修复，且来源于自体，无免疫排斥反应，对机体损伤较小并且制备方法简单，已经被广泛应用在骨科、口腔颌面外科和整形美容科等多种学科。

肌腱损伤修复主要分为四期：炎症期、修复期(增殖)、第一重塑期(加固)和第二重塑期(成熟)。经研究发现，炎症期和修复期需要更多血管生成，募集更多细胞和生长因子，促进细胞大量增殖和迁移以修复损伤组织；而到重塑期，细胞增殖能力下降，分泌产生细胞外基质，恢复重构组织结构是主要任务，过多的生成血管会影响其结构重构，损害肌腱的生物力学性质。而现有技术中，PRP通过凝血酶或胶原等激活剂完全激活后释放的血小板完全释放物既包括具有促进血管生成作用的生长因子，又包括有抑制血管生成作用的生长因子，导致其对肌腱损伤修复的效果欠佳。

发明内容

本发明提供一种用于治疗肌腱损伤的复合活性成分，基于肌腱损伤修复的不同时期，提供两种包括不同血小板释放物的第一活性成分和第二活性成分，以提高富血小板血浆对肌腱损伤的修复效果。

本发明还提供上述复合活性成分的制备方法和应用。

本发明第一方面提供一种用于治疗肌腱损伤的复合活性成分，包括第一活性成分和第二活性成分，其中：所述第一活性成分包括第一血小板释放物，所述第二活性成分包括第二血小板释放物；

所述第一血小板释放物包括血管内皮生长因子和单核细胞趋化蛋白1，且基于所述第一活性成分的总体积，所述血管内皮生长因子的质量为5-20ng/ml，单核细胞趋化蛋白1的质量为200-600pg/ml；

所述第二血小板释放物包括血管内皮细胞抑制因子，且基于所述第二活性成分的总体积，所述血管内皮细胞抑制因子的质量为10-25ng/ml。

基于肌腱损伤修复不同时期的状态，本发明提供一种包括第一活性成分和第二活性成分的复合活性成分，其中，第一活性成分包括第一血小板释放物：血管内皮生长因子(VEGF)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)，VEGF具有促血管生成的作用，MCP-1能够激活相应的炎症转录因子，从而在炎症期损伤修复中发挥重要作用；第二活性成分包括第二血小板释放物：血管内皮细胞抑制因子(Endostatin)，Endostatin具有抗血管生成的作用，在肌腱修复重塑期中发挥重要的作用。因此，本发明提供的复合活性成分中包括不同的血小板释放物，适用于肌腱修复不同时期，有助于提高肌腱修复效果。

第一活性成分中所含有的血管内皮生长因子(VEGF)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)，以及第二活性成分中所含有的血管内皮细胞抑制因子(Endostatin)均可通过ELISA检测得到。

在一种具体实施方式中，本发明使用不同的激活剂对富血小板血浆进行激活，以释放不同的血小板释放物，具体地，所述第一血小板释放物是通过凝血酶受体PAR1激活血小板后释放得到的；所述第二血小板释放物是通过凝血酶受体PAR4激活血小板后释放得到的。

本发明第二方面提供一种上述任一所述的复合活性成分的制备方法，包括如下步骤：

制备得到富血小板血浆；

将所述富血小板血浆与凝血酶受体PAR1混合均匀，释放血小板中的第一血小板释放物，得到第一活性成分；

将所述富血小板血浆与凝血酶受体PAR4混合均匀，释放血小板中的第二血小板释放物，得到第二活性成分。

在一种具体实施方式中，将所述富血小板血浆与凝血酶受体PAR1混合均匀，释放血小板中的第一血小板释放物，得到第一活性成分，具体包括如下步骤：

将包括富血小板血浆和凝血酶受体PAR1的混合物在20-30℃下静置25-45min，随后离心，取上清液得到第一活性成分。

在一种具体实施方式中，将所述富血小板血浆与凝血酶受体PAR4混合均匀，释放血小板中的第二血小板释放物，得到第二活性成分，具体包括如下步骤：

将包括富血小板血浆和凝血酶受体PAR4的混合物在20-30℃下静置25-45min，随后离心，取上清液得到第二活性成分。

在一种具体实施方式中，基于包括富血小板血浆和凝血酶受体PAR1的混合物的总体积，所述凝血酶受体PAR1的浓度为10-50μM。

在一种具体实施方式中，基于包括富血小板血浆和凝血酶受体PAR4的混合物的总体积，所述凝血酶受体PAR4的浓度为20-60μM。

本发明第三方面提供上述任一所述的复合活性成分在制备治疗肌腱损伤的药物中的应用。

在一种具体实施方式中，所述第一活性成分适用于炎症期和修复期，所述第二活性成分适用于重塑期。

本发明提供一种包括第一活性成分和第二活性成分的复合活性成分，其中，第一活性成分包括第一血小板释放物血管内皮生长因子(VEGF)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)，VEGF具有促血管生成的作用，MCP-1能够激活相应的炎症转录因子，从而在炎症期损伤修复中发挥重要作用；第二活性成分包括第二血小板释放物血管内皮细胞抑制因子(Endostatin)，Endostatin具有抗血管生成的作用，在肌腱修复重塑期中发挥重要的作用。因此，本发明提供的复合活性成分中包括不同的血小板释放物，适用于肌腱修复不同时期，有助于提高肌腱修复效果。

附图说明

图1为注射实施例1提供的复合活性成分后兔髌腱损伤修复的病理切片；

图2为注射实施例2提供的复合活性成分后兔髌腱损伤修复的病理切片；

图3为注射实施例3提供的复合活性成分后兔髌腱损伤修复的病理切片；

图4为注射对比例1提供的组合物后兔髌腱损伤修复的病理切片；

图5为注射PBS缓冲液后兔髌腱损伤修复的病理切片。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种复合活性成分，包括第一活性成分和第二活性成分，其中：第一活性成分包括第一血小板释放物，第二活性成分包括第二血小板释放物；

第一血小板释放物包括血管内皮生长因子VEGF和单核细胞趋化蛋白1MCP-1，且基于第一活性成分的总体积，血管内皮生长因子VEGF质量为5ng/ml，单核细胞趋化蛋白1MCP-1的质量为200pg/ml。

第二血小板释放物包括血管内皮细胞抑制因子Endostatin，且基于第二活性成分的总体积，血管内皮细胞抑制因子Endostatin的质量为10ng/ml。

上述活性成分的制备方法包括如下步骤：

步骤1、收集人静脉血10-20ml，然后与ACD抗凝剂按照重量比6：1进行混合，混合均匀后在500g的条件下离心10min，取上清液于新管中，并于2000g离心10min，丢去离心后大部分上清液即贫血小板血浆(PPP)，将剩余样本轻轻重悬所得即为PRP，PRP的浓度为10

步骤2、将获得的PRP与PAR1激活剂混合均匀，其中PAR1激活剂的终浓度为10μM，将PRP与PAR1激活剂的混合物的在室温下静置30min，在500g条件下离心5min，取上清液得到第一活性成分。

步骤3、将获得的PRP与PAR4激活剂混合均匀，其中PAR4激活剂的终浓度为20μM，将PRP与PAR4激活剂的混合物的在室温下静置30min，在500g条件下离心5min，取上清液得到第二活性成分。

实施例2

本实施例提供一种复合活性成分，包括第一活性成分和第二活性成分，其中：第一活性成分包括第一血小板释放物，第二活性成分包括第二血小板释放物；

第一血小板释放物包括血管内皮生长因子VEGF和单核细胞趋化蛋白1MCP-1，且基于第一活性成分的总体积，血管内皮生长因子VEGF质量为10ng/ml，单核细胞趋化蛋白1MCP-1的质量为300pg/ml。

第二血小板释放物包括血管内皮细胞抑制因子Endostatin，且基于第二活性成分的总体积，血管内皮细胞抑制因子Endostatin的质量为15ng/ml。

上述活性成分的制备方法可参考实施例1，区别在于：

步骤2中，将获得的PRP与PAR1激活剂混合均匀，其中PAR1的终浓度为25μM，将PRP与PAR1激活剂的混合物的在室温下静置30min，在500g的条件下离心5min，取上清液得到第一活性成分。

步骤3中，将获得的PRP与PAR4激活剂混合均匀，其中PAR4激活剂的终浓度为30μM，将PRP与PAR4激活剂的混合物的在室温下静置30min，在500g的条件下离心5min，取上清液得到第二活性成分。

实施例3

本实施例提供一种复合活性成分，包括第一活性成分和第二活性成分，其中：第一活性成分包括第一血小板释放物，第二活性成分包括第二血小板释放物；

第一血小板释放物包括血管内皮生长因子VEGF和单核细胞趋化蛋白1MCP-1，且基于第一活性成分的总体积，血管内皮生长因子VEGF质量为20ng/ml，单核细胞趋化蛋白1MCP-1的质量为600pg/ml。

第二血小板释放物包括血管内皮细胞抑制因子Endostatin，且基于第二活性成分的总体积，血管内皮细胞抑制因子Endostatin的质量为25ng/ml。

上述活性成分的制备方法可参考实施例1，区别在于：

步骤2中，将获得的PRP与PAR1激活剂混合均匀，其中PAR1的终浓度为50μM，将PRP与PAR1激活剂的混合物的在室温条件下静置30min，在500g的条件下离心5min，取上清液得到第一活性成分。

步骤3中，将获得的PRP与PAR4激活剂混合均匀，其中PAR4激活剂的终浓度为60μM，将PRP与PAR4激活剂的混合物的在室温条件下静置30min，在500g的条件下离心5min，取上清液得到第二活性成分。

对比例1

本对比例提供一种用于治疗肌腱损伤的组合物，同时包括多种血小板释放物，且血小板释放物中血管内皮生长因子(VEGF)的含量为15ng/ml，单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的含量为50pg/ml，血管内皮细胞抑制因子(Endostatin)的含量为20ng/ml。

上述活性成分的制备方法可参考实施例1，区别在于：

将富血小板血浆与凝血酶混合均匀，其中凝血酶的终浓度为10U/ml，将PRP与凝血酶的混合物的在室温下静置30min，在500g的条件下离心5min，取上清液得到组合物。

试验例

选取健康6月龄雌性新西兰大白兔为实验动物，体重1500g～2000g。肌肉注射Ketamine(10mg/kg)和Xylazine(3mg/kg)麻醉后，采用髌韧带中路入路，切除部分髌腱组织(正中1/3)以建立髌腱损伤模型，然后将其分为实验一组、实验二组、实验三组、对照一组和对照二组，每组3只，实验一组-实验三组分别使用实施例1-3提供的复合活性进行注射，具体地：在损伤后的前2周，每周注射1次1ml第一活性成分，在之后的2周，每周注射1次1ml第二活性成分，对照一组在损伤后每周注射1次1ml的对比例1提供的组合物，对照二组在损伤后每周注射1次1ml的PBS缓冲液，4周后分离髌腱组织，固定后制备石蜡切片，然后进行苏木精—伊红染色分析，以评估其对兔髌腱损伤修复的效果。

染色分析结果如图1-5所示，可以看出，注射实施例1-3提供的复合活性成分后损伤肌腱已经大部分修复，胶原纤维排列规则，无可见的血管样和疤痕样组织；而注射对比例1提供的组合物后，胶原纤维排列紊乱，有明显的血管样组织形成；注射PBS缓冲液后，仅有少量的胶原纤维，绝大部分区域仍处于损伤状态。

以上结果表明：在肌腱修复早期注射第一活性成分，而在后期注射第二活性成分，能有效促进肌腱组织的修复，并且效果显著。虽然采用凝血酶激活的PRP同样在修复上能够促进肌腱组织的修复，但是在修复后肌腱组织会产生血管样和疤痕样组织，这会对肌腱组织的生物力学性能有较大的影响。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。