一种改良的组织工程膀胱支架材料及其制备方法

技术领域

本发明属于组织工程生物医学材料领域，涉及组织工程膀胱支架材料及其制备方法，具体涉及组织工程膀胱种子细胞的处理和复合纳米材的制备。

背景技术

先天性疾病、创伤、炎症、感染、肿瘤等多种原因均可导致膀胱损伤，多数情况下，最终需要切除重建膀胱。目前,小肠片段替代膀胱组织是膀胱切除手术治疗的主要方法。肠道是吸收物质的，膀胱是排泄物质的，故尿液长期通过肠道排泄可引起代谢紊乱、感染、尿石形成、粘液增多、穿孔甚至恶变。组织工程和干细胞技术为膀胱修复、重建提供了一种全新的治疗模式，它既避免了免疫排斥，又解决了器官来源问题。2006年Atala教授用膀胱功能异常患者自身正常膀胱平滑肌细胞和尿路上皮细胞作为组织工程膀胱的种子细胞，首次在临床上实现了人体大部分组织工程膀胱的再造，展现了人体器官再生的前景。支架、增殖的细胞和生物信号传导是构建组织工程膀胱的三大要素。膀胱支架是组织工程膀胱的一个重要部分，合成材料聚乳酸-羟基乙酸(poly lactic-co-glycolic acid,PLGA)等具有良好的机械力学性能等特点；天然生物材料猪膀胱去细胞基质(bladder acellular matrix,BAM)、胶原、海藻酸钠、壳聚糖等具有良好生物相容性等特点。

目前工程膀胱的支架材料多所采天然-合成两种材料相结合的方式，兼顾两者的优点，经纳米处理可构建优化的工程膀胱支架，供细胞粘附、生长、分化，能大量增殖的种子细胞，是工程膀胱的另一重要部分，细胞可以促进工程膀胱组织的再生。先天性膀胱畸形如膀胱外翻、发育不全等，其输尿管和膀胱组织的平滑肌细胞和尿源上皮细胞可作为工程膀胱的种子细胞，但病变的膀胱细胞不宜作为组织工程膀胱的种子细胞，故病理情况下，如膀胱癌，患者自体正常干细胞是工程膀胱种子的最佳来源。人体骨髓或脂肪干细胞，体内含量丰富，取材简单，二者经定向诱导分化后，可作为工程膀胱理想的平滑肌种子细胞和尿道上皮细胞种子的来源。

目前存在的问题是：PLGA由于其降解速率、微观结构可控，很容易形成三维结构。然而PLGA对细胞粘附力不够。一些单独使用聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)作为支架材料的研究显示移植物出现结石等问题[参见：1.Sharifiaghdas F,Naji M,Sarhangnejad R,et al.Comparing supportive properties of poly lactic-co-glycolic acid(PLGA),PLGA/collagen and human amniotic membrane for human urothelial and smoothmuscle cells engineering.Urol J 2014.11:1620-8.doi.org/10.22037/uj.v11i3.2120；2.Salem SA,Rashidbenam Z,Jasman MH,et al.Incorporation ofSmooth Muscle Cells Derived from Human Adipose Stem Cells on Poly(Lactic-co-Glycolic Acid)Scaffold for the Reconstruction of Subtotally Resected UrinaryBladder in Athymic Rats.Tissue Eng Regen Med.2020Aug；17(4):553-563.doi:10.1007/s13770-020-00271-7]。膀胱去细胞基质((bladder acellular matrix,BAM)，通常被用作组织工程膀胱中的支架材料，单独使用膀胱无细胞基质(BAM)的研究虽然也显示了尿路上皮层和肌束、血管和神经的形成，但是移植物出现皱缩等问题明显[参见3.ZhaoF,Zhou L,Xu Z,et al.Hypoxia-Preconditioned Adipose-Derived EndothelialProgenitor Cells Promote Bladder Augmentation.Tissue Eng Part A.2020Jan；26(1-2):78-92.doi:10.1089/ten.tea.2019.0045；4.Pokrywczynska M,Jundzill A,Rasmus M,et al.Understanding the role of mesenchymal stem cells in urinary bladderregeneration-a preclinical study on a porcine model.Stem Cell ResTher.2018Nov 28；9(1):328.doi:10.1186/s13287-018-1070-3]。BAM空间构象相对致密，不利细胞大量生长，细胞增殖受营养供给限制，不易分化形成组织，BAM不能满足临床大面积手术替代的要求。当使用单一类型的材料时，很难克服其自身的缺陷。因此，现有研究所提供的解决方案在满足临床需求方面并不令人满意。为了弥补单一类型材料的自体缺陷，本发明研究选择了复合生物材料做成临床手术用的补片，该补片可作为损伤组织的替代材料。

发明内容

本发明的任务是提供一种改良的组织工程膀胱支架材料及其制备方法。

实现本发明的技术方案是：

本发明提供的改良的组织工程膀胱支架材料的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、制备猪膀胱黏膜层材料：将猪膀胱置于水龙头流水下冲洗干净，剥离出猪膀胱黏膜层，经HE、Trichrome和DAPI染色检测基本无细胞，得猪膀胱黏膜；

步骤二、制备纳米微粒：将壳聚糖(100-200万KDa)、海藻酸钠分别与合成材料聚乳酸-乙醇酸(PLGA,75/25)形成两种纳米初乳，再交联这两种纳米初乳，形成纳米微粒，纳米微粒颗粒直径在100nm到400nm之间的供后续使用；

步骤三、制备供修补手术用的补片：将步骤一制得的猪膀胱黏膜、步骤二制得的纳米微粒与鼠尾I型胶原和生长因子组合成供修补手术用的用作支架材料的补片。

上述步骤三中所述的将步骤一制得的猪膀胱黏膜、步骤二制得的纳米微粒与鼠尾I型胶原和生长因子组合成供修补手术用的用作支架材料的补片的具体方法是：

将200μLPLGA/壳聚糖-PLGA/海藻酸交联的纳米微粒(0.1g/mL，预混于10×DMEM中)、140μL FBS(胎牛血清，Gibco)和60μL生长因子(20μL 1μg/mL PDGF-BB、20μL 1μg/mLVEGF和20μL 1μg/mL TGF)加入到0.7mL无菌I型胶原(3.65mg/mL)中，并用40μL 1M氢氧化钠中和，把所有材料放在冰上，将混合溶液立即放于培养皿中，并置于培养箱中于37℃，5％CO2条件下2小时，使补片凝胶化，为了形成具有足够机械强度的果冻状补片，从上到下逐层沉积以下材料：薄纸、尼龙网、水合补片、再水合2cm×2cm BSM、另一层尼龙网和另一层薄纸，然后在凝胶顶部施加静态压缩应力1-2分钟以挤出水分，即制得供修补手术用的用作支架材料的补片。

制备大面积修补手术用的用作支架材料的补片，需要在制得的用作膀胱支架材料的补片上接种经含鼠尾I型胶原的培养基混悬的体外扩增或诱导分化的工程膀胱平滑肌样细胞和尿路上皮样细胞，再在体外37培养24小时左右，即制得供较大面积修补手术用的用作支架材料的补片。所述的经含鼠尾I型胶原的培养基混悬的体外扩增或诱导分化的工程膀胱平滑肌样细胞和尿路上皮样细胞的制备方法是：将从膀胱未病变患者自身膀胱或尿道组织分离出的平滑肌细胞和尿路上皮细胞，分别在体外大量扩增；或将从膀胱癌等组织病变患者骨髓或脂肪分离出的干细胞，用TGF-β1和PDGF-BB诱导平滑肌细胞，用正常尿路细胞条件培养基诱导尿路细胞；将体外扩增或诱导分化的工程膀胱平滑肌样细胞或尿路上皮样细胞两种种子细胞，按每毫升105-7个细胞/ml的浓度混悬于含鼠尾I型胶原的培养基中，接种在用作支架材料的补片上，再在体外于37℃培养24小时左右，即得到经含鼠尾I型胶原的培养基混悬的体外扩增或诱导分化的工程膀胱平滑肌样细胞或尿路上皮样细胞。

小面积的修补可以直接将补片替代损伤的膀胱或尿道组织，随自身正常细胞的迁移可以形成功能正常的组织(见图7-9)。大面积的修补，需将体外扩增或诱导分化的工程膀胱平滑肌样细胞和尿路上皮样细胞两种种子细胞分别按每毫升105-7个细胞/ml的浓度混悬于含鼠尾I型胶原的培养基中，分别接种在上述用作膀胱支架材料的补片上，再体外37培养24小时左右,即可移植到动物损伤的膀胱或损伤的尿道组织。

本发明提供了一种改良的组织工程膀胱支架材料及其制备方法，该方法利用天然生物材料及合成纳米材料，在组织工程膀胱制备中增加细胞粘附，促进细胞有序形成组织。具体是以猪膀胱黏膜层去细胞基质作为基本的组织工程膀胱支架材料，在猪膀胱黏膜层支架材料基础上，添加了生长因子，鼠尾胶原I型以及PLGA-壳聚糖与PLGA-海藻酸纳交联的纳米粒子乳液，经处理形成纳米材料支架。合成材料PLGA因其良好的机械性能等优点，被广泛应用于组织工程，但是其对细胞粘附力不够。本发明巧妙地将PLGA良好的机械性能、壳聚糖及海藻酸纳有利于细胞粘附生长的性能，与合成材料PLGA组合构成理想的空间，有利于细胞粘附和组织形成，并利用猪膀胱黏膜层富含膀胱细胞分泌因子、鼠尾胶原I型有利于细胞粘附、以及生长因子有利于细胞分化的特性，为组织工程膀胱提供了新的支架来源。本发明提供的组织工程补片揉合了合成材料的韧性和天然材料的细胞相容性，克服了现有技术因使用单一类型材料所导致的不足，本发明选择了复合生物材料做成临床手术用的补片，该补片可作为损伤组织的替代材料，并且接种的是自身细胞，避免了免疫排斥问题，适合临床治疗之应用。

附图说明

图1：猪膀胱黏膜，经HE、Trichrome和DAPI检测猪膀胱细胞残留结果，结果显示猪膀胱细胞基本洗脱干净，几乎检测不到细胞。其中：图1a为H&E染色，结果显示猪膀胱细胞基本洗脱干净，几乎检测不到细胞(标尺：100μm)；图1b为Masson Trichrome染色，结果显示猪膀胱细胞基本洗脱干净，几乎检测不到细胞(标尺：100μm)；图1c为DAPI检测，黑色背景中的斑点为检测到的细胞核，说明有极少可忽略的细胞数残留，但不影响实验结果X1000。

图2：显示PLGA/壳聚糖和PLGA/海藻酸钠纳米初乳颗粒直径和zeta电位以及两者交联的空间构象。PLGA/壳聚糖和PLGA/海藻酸钠纳米初乳颗粒直径和zeta电位以及两者交联经扫描电镜检测的空间构象，纳米微粒颗粒直径在100nm到400nm之间可供实验用。其中：图2a：PLGA/壳聚糖的粒径300nm±72，电位39mV±28；图2b：PLGA/海藻酸钠的粒径180nm±49，电位-34mV±27；图2c：PLGA/壳聚糖和PLGA/海藻酸钠，按5：5的比例混合，扫描电镜检测显示纳米微粒颗粒直径在100nm到400nm之间。

图3：供手术修补用的补片，猪膀胱黏膜，纳米微粒与鼠尾I型胶原，与特殊的生长因子组合构成的供手术修补用的补片，体外扩增的平滑肌细胞和尿路上皮细胞。

图4：体外扩增的平滑肌细胞和尿路上皮细胞，人骨髓干细胞诱导分化的平滑肌细胞和尿路上皮细胞PCR产物。其中：图4a：培养到第3代的人尿道平滑肌细胞x100；图4b：培养到第2代的人尿道上皮细胞x100。

图5：人骨髓干细胞诱导分化的平滑肌细胞和尿路上皮细胞的PCR产物，其中：图5a：人骨髓干细胞诱导分化的平滑肌细胞PCR产物,经特异抗体(a-SMA,Desmin,Calponin和MHC单抗，GAPDH为内参对照)检测的结果。1为人膀胱组织提取的平滑肌作为阳性对照，2为培养到第3代的人尿道平滑肌细胞作为阳性对照，3为阴性对照，4，5，6为人骨髓干细胞在不同条件诱导下的膀胱平滑肌样细胞，7为空白对照；图5b：人骨髓干细胞诱导分化的尿路上皮细胞PCR产物,经特异抗体(Up-la,CK-7和CK-13单抗，GAPDH为内参对照)检测的结果,1 2为培养到第2代的人尿路上皮细胞作为阳性对照，2为阴性对照，3,4为人骨髓干细胞在不同条件诱导下的膀胱尿路上皮细胞样细胞，5为空白对照。

图6：供手术修补用的补片，兼具合成材料和天然材料的优点，为人骨髓干细胞诱导分化的平滑肌细胞和尿路上皮细胞的蛋白产物，其中：图6a：人骨髓干细胞诱导分化的平滑肌细胞蛋白产物,经特异抗体(a-SMA,Calponin,Desmin和MHC单抗，β-actin为内参对照)检测的结果：1为人膀胱组织提取的平滑肌作为阳性对照；2为培养到第3代的人尿道平滑肌细胞作为阳性对照；3为阴性对照；4、5、6为人骨髓干细胞在不同条件诱导下的膀胱平滑肌样细胞；图6b：人骨髓干细胞诱导分化的尿路上皮细胞蛋白产物,经特异抗体(Up-la,AE1/AE3和CK-13单抗，β-actin为内参对照)检测的结果：1为培养到第2代的人尿路上皮细胞作为阳性对照；2为阴性对照；3、4为人骨髓干细胞在不同条件诱导下的膀胱尿路上皮细胞样细胞。

图7：补片经体内8周培养形成膀胱平滑肌束，没有出现皱缩和结石，且呈现膀胱平滑肌束。其中：图7a为Masson Trichrome染色,星号指示补片上形成的膀胱平滑肌束(标尺：50μm)；图7b为a-SMC单抗应用于免疫组化,星号指示补片上形成的膀胱平滑肌束(标尺：50μm)。

图8：补片经体内8周培养，没有出现皱缩和结石，且快速呈现尿路上皮层。其中：8a为Masson Trichrome染色,箭头指示补片上形成的尿路上皮层(标尺：50μm)；8b为ck-13单抗应用于免疫组化,箭头指示补片上形成的尿路上皮层(标尺：50μm)

图9：补片经体内8周培养形成尿路上皮层血管，a-SMC单抗应用于免疫组化,箭头头指示补片上形成的血管(标尺：50μm),补片经体内8周培养，没有出现皱缩和结石，且呈现形成的血管。

图10：图10：术后2、4、8周，假手术组,测试组和对照组最大膀胱容量的数量比较。最大膀胱容量是组织工程膀胱排空尿后，推注生理盐水，在首次发生盐水泄漏时的数值。

具体实施方式

实施例1：制备猪膀胱黏膜层材料

将猪膀胱置于水龙头流水下冲洗干净(无尿味)，剥离出猪膀胱黏膜层，再用dH2O漂洗多次，4℃条件下,系列震荡漂洗:

(1)dH2O震荡漂洗24小时，每8小时换一次dH2O；

(2)0.5％Triton X-100震荡48小时，每8小时换液一次；

(3)dH2O震荡漂洗48小时，每8小时换一次dH2O；

(4)2％的过氧乙酸震荡4小时；

(5)dH2O震荡漂洗48小时，每8小时换一次dH2O；

(6)无菌PBS震荡漂洗至pH7.2-7.4；

(7)剪取小块黏膜，经石蜡包埋横切黏膜组织进行HE、Trichrome、DAPI染色，检测猪细胞脱除状况，余下的膜，于4℃保存备用。显微镜下观察，HE、Trichrome染色结果，荧光显微镜下观察DAPI染色结果，基本无细胞的猪膀胱黏膜供实验用。

实施例2：工程膀胱支架材料的制备

商品途径购买的壳聚糖、海藻酸钠，以及合成材料聚乳酸-乙醇酸(PLGA)，按如下方法处理：PLGA按1％浓度溶解在二氯甲烷溶液，2％壳聚糖和2％海藻酸钠分别溶解在0.2％的醋酸和去离子水中。将1％的PLGA以60ml/每小时分别注入搅拌中的壳聚糖和海藻酸钠中，搅拌8-12小时去除二氯甲烷，12,000rpm离心15分钟收集沉淀物，去离子水洗3次，分别检测PLGA/壳聚糖，PLGA/海藻酸钠的颗粒大小和电位，-80℃冻干。将20％浓度PLGA/壳聚糖和20％PLGA/海藻酸钠，按5：5的比例交联，构成PLGA/壳聚糖-PLGA/海藻酸交联的纳米微粒，然后用20纳米铂涂覆凝胶材料，经扫描电镜检测其空间构象。如此处理后可供实验用。

实施例3.制备供修补手术用的补片

将200μLPLGA/壳聚糖-PLGA/海藻酸交联的纳米微粒(0.1g/mL，预混于10×DMEM中)、140μL FBS(胎牛血清，Gibco)和60μL生长因子(20μL 1μg/mL PDGF-BB、20μL 1μg/mLVEGF和20μL 1μg/mL TGF)加入到0.7mL无菌I型胶原(3.65mg/mL)中，并用40μL 1M氢氧化钠中和，把所有材料放在冰上，将混合溶液立即放于培养皿中，并置于培养箱(37℃，5％CO

实施例4.组织工程膀胱种子细胞的制备

(1)膀胱未病变患者工程膀胱的种子细胞：手术取1mm

(2)膀胱癌等组织病变患者工程膀胱的种子细胞：取骨髓或脂肪分离出干细胞，用TGF-β1和PDGF-BB诱导平滑肌细胞，用正常尿路细胞上清液，作为条件培养基诱导尿路细胞。

(3)将体外扩增或诱导分化的工程膀胱种子细胞按每毫升105-7的浓度混悬于胶原的培养基中，接种在工程膀胱支架复合材料补片上，再体外37℃培养24小时左右，即为可移植到损伤膀胱或损伤尿道上作为组织工程补片使用。