一种双标签促进人源组蛋白H1.5抗原蛋白及其制备方法

技术领域

本发明涉及医学免疫技术领域，尤其涉及一种双标签促进人源组蛋白H1.5抗原蛋白及其制备方法。

背景技术

抗原是所有能够诱发机体发生免疫应答的物质。其包括细菌，病毒，花粉，蛋白，核酸，等等。抗原的研发在传染病诊断(如新冠病毒，HIV，等)、微生物分类、抗体开发以及疫苗的研究等领域都起着至关重要的意义。在医学领域中，应用最多的是蛋白类抗原，该类抗原的表达是抗原研发的第一步，也是其研究的基础。

由于大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)原核表达系统具有工艺成熟、操作简单、高效、成本低等特点，在抗原蛋白表达中占有十分重要的地位。然而，当原核表达系统表达高级来源蛋白(如人源蛋白/动物源蛋白)的时候存在致命缺陷，经常导致目标蛋白以不可溶的包涵体形式表达，甚至不表达。从而大大地局限了原核表达系统在抗原研发及生产中的应用，同时也增加了抗原研发的难度。

自免性疾病是人体免疫系统对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损伤的疾病。在许多自身免疫性疾病中检测到针对组蛋白的自身抗体(Autoantibodies againsthistones,AHAs)。50-80％的系统性红斑狼疮(SLE)患者的AHA在活动性疾病患者中最高。而组蛋白中H1和H2B是SLE最常见的靶点。此外，AHAs也普遍存在于费尔蒂综合征(Felty’ssyndrome,FS)、类风湿性关节炎和青少年关节炎、硬皮病、系统性硬化症和混合结缔组织疾病中。在约76％的原发性胆汁性肝硬化患者中也观察到AHA(主要针对H1)。因此，组蛋白成为自身免疫性疾病检测试剂的主要原材料。H1.5是人源组蛋白的主要构成之一，对其表达纯化对自身免疫性疾病检测试剂的研发意义重大。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种双标签促进人源组蛋白H1.5抗原蛋白及其制备方法，本发明实现了让人源组蛋白H1.5在E.coli中的高效可溶性表达。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种双标签促进人源组蛋白H1.5抗原蛋白，抗原蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

一种双标签促进人源组蛋白H1.5抗原蛋白的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

(1)序列设计及载体，在人源组蛋白H1.5全长蛋白的N端融合SUMO标签的第二个β折叠到第一个α螺旋的结构域，同时在H1.5的C端融合GST标签的最后三个α螺旋的结构域，得到组合蛋白氨基酸序列，助溶标签将上述氨基酸序列反翻译后得到对应的基因序列，并在基因序列两端分别加上Nde I和Bam HI酶切位点，对该基因序列进行合成并让其连接到E.coli表达载体pET28(a)中的Nde I和Bam HI酶切位点之间；

(2)诱导表达，将合成的载体通过热击转化到E.coli BL21(DE3)中，挑取单克隆于3ml LB(Amp.100ug/ml)中过夜培养；

次日，以1％的接种量转接到两支含3ml LB(Amp.100ug/ml)试管中，37℃，200rpm培养至OD600＝0.5后转入18℃，200rpm培养1h；

取出试管，一支加入3ul无菌水作为阴性对照，另一支加入IPTG至终浓度1mM后于18℃，200rpm培养过夜；

(3)表达验证，将步骤(2)中过夜培养的菌液离心收集(5000rpm，3min)后用1mlPBS缓冲液重悬并超声破碎，破碎液13000rpm离心10min，上清转入新EP管中，用1ml PBS重悬沉淀，将上清与沉淀分别跑12％的SDS-PAGE胶；

(4)纯化，按照步骤(2)重新诱导1L菌液，细胞重悬后用通过超高压均质机破碎，13000rpm离心20min后，上清用于FPLC系统纯化。

优选地，融合SUMO标签、融合GST标签与人源组蛋白H1.5全长蛋白之间通过柔性连接序列SSG连接。

优选地，组合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选地，人源组蛋白H1.5全长蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

优选地，融合SUMO标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选地，融合GST标签的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

一种双标签促进人源组蛋白H1.5抗原蛋白，该抗原蛋白是将如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列在大肠杆菌中表达获得。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明中人源组蛋白H1.5在E.coli中基本不表达，即使在其N端或者C端加上融合标签也未能改善其表达情况，为实现H1.5的表达，本发明中通过在目标蛋白的N端和C端分别加上SUMO和GST标签的某段序列，从而实现了在E.coli中的可溶性表达。

附图说明

为了更具体直观地说明本发明实施例或者现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简要介绍。

图1为一种双标签促进人源组蛋白H1.5抗原蛋白及其制备方法中的蛋白表达检测；

图2为一种双标签促进人源组蛋白H1.5抗原蛋白及其制备方法中的蛋白纯化检测；

图3为一种双标签促进人源组蛋白H1.5抗原蛋白及其制备方法中的WB检测H1.5重组蛋白免疫活性。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

一种双标签促进人源组蛋白H1.5抗原蛋白，抗原蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

一种双标签促进人源组蛋白H1.5抗原蛋白的制备方法，该制备方法包括如下步骤。

(1)序列设计及载体。通过各种测试，我们确定在人源组蛋白H1.5全长蛋白(如氨基酸序列SEQ ID NO.4所示)的N端融合SUMO标签的第二个β折叠到第一个α螺旋的结构域(如氨基酸序列SEQ ID NO.3所示，共30Aa)，同时在H1.5的C端融合GST标签的最后三个α螺旋的结构域(如氨基酸序列SEQ ID NO.5所示)，融合标签与H1.5之间通过柔性连接序列SSG连接。助溶标签将氨基酸序列反翻译后得到对应的基因序列(如核苷酸序列SEQ ID NO.6所示)，并在基因两端分别加上Nde I(核苷酸序列CATATG)和Bam HI(核苷酸序列GGATCC)酶切位点，对该基因序列进行合成并让其连接到E.coli表达载体pET28(a)中的Nde I和Bam HI酶切位点之间。

(2)诱导表达。将合成的载体通过热击转化到E.coli BL21(DE3)中，挑取单克隆于3ml LB(Amp.100ug/ml)中过夜培养。次日，以1％的接种量转接到两支含3ml LB(Amp.100ug/ml)试管中，37℃，200rpm培养至OD600＝0.5后转入18℃，200rpm培养1h。取出试管，一支加入3ul无菌水作为阴性对照，另一支加入IPTG至终浓度1mM后于18℃，200rpm培养过夜。

(3)表达验证。将步骤(2)中过夜培养的菌液离心收集(5000rpm，3min)后用1mlPBS缓冲液重悬并超声破碎(宁波新芝，SCIENTZ-IID)。破碎液13000rpm离心10min，上清转入新EP管中，用1ml PBS重悬沉淀。将上清与沉淀分别跑12％的SDS-PAGE胶，结果如图2。结果显示重组组蛋白H1.5在上清有明显表达(图1，～32kDa，矩形线框内)。

在图1中，Lane 1：蛋白Marker；

Lane 2：未诱导菌株可溶性总蛋白；

Lane 3：未诱导菌株不可溶总蛋白；

Lane 4：诱导菌株可溶性总蛋白；

Lane 5：诱导菌株不可溶总蛋白。

(4)纯化。按照步骤(2)重新诱导1L菌液。细胞重悬后用通过超高压均质机(宁波新芝，SCIENTZ-207A)破碎。13000rpm离心20min后，上清用于FPLC系统纯化(苏州赛谱仪器有限公司，SDL100-F2，搭配1ml的cOmplete His-Tag Purification column)。图2结果显示，目标蛋白(～32kDa)存在于上清总蛋白中(图2，第二泳道)，过柱之后目标蛋白基本全部挂柱(图2，第三泳道)。洗脱蛋白泳道显示(图2，第四泳道)，除了目标蛋白带外，几乎看不到其他蛋白条带，表明通过该方法获得了高纯度的蛋白。

在图2中，Lane 1：蛋白Marker；

Lane 2：用于纯化的总蛋白样；

Lane 3：纯化过柱后总蛋白；

Lane 4：柱洗脱蛋白。

(5)免疫活性测试。作为抗原，除了纯度要求外，免疫活性决定了该抗原的使用性能。为了检测获得的H1.5重组蛋白是否具有免疫活性，我们对获得的重组蛋白进行了蛋白免疫印迹(Westernblot，WB)实验(图3)。如图所示，H1.5重组蛋白条带处具有明显条带，标明该蛋白具有免疫活性，可用于免疫相关检测试剂中。

在图3中，上样量：1ug；一抗：抗H1.5多克隆抗体，ThermoFisher，PA5-25155；二抗：HRP标记的羊抗兔，proteintech，PR30011。

SEQ ID NO.1：

CATATGGACGGCTCTTCCGAAATTTTTTTCAAAATCAAAAAAACCACC

CCGCTGCGTCGCCTGATGGAAGCCTTTGCTAAACGCCAGGGTAAAGA

AAGCTCTGGTTCTGAGACCGCTCCGGCAGAAACCGCAACTCCAGCAC

CTGTAGAAAAATCCCCGGCTAAAAAGAAAGCAACGAAAAAAGCCGC

CGGCGCTGGTGCAGCTAAACGTAAAGCTACTGGTCCACCTGTTTCTGA

GCTGATTACCAAAGCCGTGGCAGCGTCTAAAGAGCGTAATGGCCTGA

GCCTGGCGGCTCTGAAAAAAGCGCTGGCGGCTGGCGGTTATGACGTA

GAGAAAAATAATAGCCGTATCAAACTGGGCCTGAAATCTCTGGTATCC

AAAGGCACTCTGGTGCAGACTAAAGGCACCGGTGCCTCTGGTTCTTTT

AAGCTGAATAAGAAGGCAGCGTCTGGTGAAGCGAAACCGAAAGCTA

AAAAAGCTGGCGCTGCAAAAGCGAAAAAGCCGGCAGGTGCAACTCC

GAAAAAAGCGAAAAAAGCGGCGGGTGCGAAAAAAGCTGTGAAAAA

AACCCCTAAGAAGGCAAAAAAGCCGGCAGCTGCGGGCGTGAAAAAG

GTTGCCAAGAGCCCGAAAAAAGCGAAGGCAGCGGCGAAACCGAAGA

AAGCAACCAAATCTCCGGCCAAACCGAAAGCTGTGAAACCGAAAGC

TGCTAAACCGAAGGCGGCTAAACCGAAAGCGGCAAAACCGAAAGCG

GCAAAGGCGAAAAAAGCAGCGGCGAAAAAAAAATCCAGCGGCACGC

ACCCAGATTTCATGCTGTATGATGCACTGGATGTCGTACTGTATATGGA

CCCGATGTGCCTGGATGCATTCCCGAAACTGGTTTGCTTCAAAAAACG

TATCGAAGCAATCCCGCAGATCGATAAATACCTGAAGAGCAGCTAAGGATCC。

SEQ ID NO.2：

DGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKESSGSETAPAETATPAPVEKSPA

KKKATKKAAGAGAAKRKATGPPVSELITKAVAASKERNGLSLAALKKA

LAAGGYDVEKNNSRIKLGLKSLVSKGTLVQTKGTGASGSFKLNKKAAS

GEAKPKAKKAGAAKAKKPAGATPKKAKKAAGAKKAVKKTPKKAKKPA

AAGVKKVAKSPKKAKAAAKPKKATKSPAKPKAVKPKAAKPKAAKPKA

AKPKAAKAKKAAAKKKSSGTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSS。

SEQ ID NO.3：

DGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKE。

SEQ ID NO.4：

SETAPAETATPAPVEKSPAKKKATKKAAGAGAAKRKATGPPVSELITKAV

AASKERNGLSLAALKKALAAGGYDVEKNNSRIKLGLKSLVSKGTLVQT

KGTGASGSFKLNKKAASGEAKPKAKKAGAAKAKKPAGATPKKAKKAA

GAKKAVKKTPKKAKKPAAAGVKKVAKSPKKAKAAAKPKKATKSPAKPKAVKPKAAKPKAAKPKAAKPKAAKAKKAAAKKK。

SEQ ID NO.5：

THPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSS。SEQ ID NO.6：

GACGGCTCTTCCGAAATTTTTTTCAAAATCAAAAAAACCACCCCGCTG

CGTCGCCTGATGGAAGCCTTTGCTAAACGCCAGGGTAAAGAAAGCTC

TGGTTCTGAGACCGCTCCGGCAGAAACCGCAACTCCAGCACCTGTAG

AAAAATCCCCGGCTAAAAAGAAAGCAACGAAAAAAGCCGCCGGCGC

TGGTGCAGCTAAACGTAAAGCTACTGGTCCACCTGTTTCTGAGCTGAT

TACCAAAGCCGTGGCAGCGTCTAAAGAGCGTAATGGCCTGAGCCTGG

CGGCTCTGAAAAAAGCGCTGGCGGCTGGCGGTTATGACGTAGAGAAA

AATAATAGCCGTATCAAACTGGGCCTGAAATCTCTGGTATCCAAAGGC

ACTCTGGTGCAGACTAAAGGCACCGGTGCCTCTGGTTCTTTTAAGCTG

AATAAGAAGGCAGCGTCTGGTGAAGCGAAACCGAAAGCTAAAAAAG

CTGGCGCTGCAAAAGCGAAAAAGCCGGCAGGTGCAACTCCGAAAAA

AGCGAAAAAAGCGGCGGGTGCGAAAAAAGCTGTGAAAAAAACCCCT

AAGAAGGCAAAAAAGCCGGCAGCTGCGGGCGTGAAAAAGGTTGCCA

AGAGCCCGAAAAAAGCGAAGGCAGCGGCGAAACCGAAGAAAGCAA

CCAAATCTCCGGCCAAACCGAAAGCTGTGAAACCGAAAGCTGCTAAA

CCGAAGGCGGCTAAACCGAAAGCGGCAAAACCGAAAGCGGCAAAGG

CGAAAAAAGCAGCGGCGAAAAAAAAATCCAGCGGCACGCACCCAGA

TTTCATGCTGTATGATGCACTGGATGTCGTACTGTATATGGACCCGATG

TGCCTGGATGCATTCCCGAAACTGGTTTGCTTCAAAAAACGTATCGAAGCAATCCCGCAGATCGATAAATACCTGAAGAGCAGCTAA。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。