一种按需激活的级联反应与抗生素协同的抗菌材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于抗菌技术领域，具体涉及一种按需激活的级联反应与抗生素协同的抗菌材料及其制备方法和应用。

背景技术

细菌感染是人类患病和死亡的主要原因之一，对人体安全造成了重大的威胁。在临床治疗中，使用频率最高、治疗效果明显的药物依旧是抗生素。但抗生素的频繁使用会导致高危害的多重耐药细菌增加，使公共安全处于更加严峻的困境。

活性氧(ROS)作为机体细胞能量代谢的副产物，参与了多种胞内生化反应。已有研究表明，ROS由于存在氧化性，能够破坏细菌的生物膜、氧化其蛋白质并降解DNA，杀菌的同时避免了耐药性的问题，在治疗细菌感染方面有重大的作用。目前ROS主要通过天然酶与纳米酶的级联反应产生，与天然酶相比，纳米酶因其易于合成，高度稳定和耐用等优点，在研究过程中更具有高效性。此外，纳米酶还可以进行修饰以改变自身的性质从而提高其整体催化活性和生物相容性。因此，纳米酶在分析、生物医学和环境化学等不同领域显示出巨大的应用潜力。但是，ROS极短半衰期和极窄扩散距离在抗菌应用中仍旧是一个重大挑战，且治疗过程中产生的过多的非特异性ROS会对感染部位周围的健康组织造成严重损害。因此，迫切需要开发一种既可以避免耐药性又具有良好的抗菌性能的抗菌材料。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种按需激活的级联反应与抗生素协同的抗菌材料及其制备方法和应用，具体采用以下的技术方案：

一种按需激活的级联反应与抗生素协同的抗菌材料，上述抗菌材料(AFeGp)是由抗生素包埋在Fe-ZIF-8中，然后和葡萄糖氧化酶(GOx)共埋在聚丙烯酰胺水凝胶微球中得到。

本发明选用具有优异催化活性的Fe-ZIF-8为模拟酶，相较于其他纳米酶而言，Fe-ZIF-8在中性条件下可以通过ATP的激活作用显示出优异的酶活性。同时，Fe-ZIF-8兼具载体的作用，在一般情况下具有良好的稳定性。将抗生素包埋在Fe-ZIF-8中，可以避免抗生素的过早触发。在此基础上，将抗生素@Fe-ZIF-8与葡萄糖氧化酶共埋在聚丙烯酰胺水凝胶微球中，当细菌存在时，细菌分泌的ATP可用于激活AFeGp(AMP@Fe-ZIF-8/GOx@pAAm)抗菌系统，一方面ATP可以打破Fe-ZIF-8的pH限制，使其在生理条件下也存在较为优异的催化活性，从而解决了Fe-ZIF-8只能在较窄pH值范围内表现出催化活性的问题，使得Fe-ZIF-8能顺利和葡萄糖氧化酶级联产生ROS。另外，此抗菌系统在无ATP的情况下不发生反应，实现按需产生ROS，避免了一般情况下过量的ROS的产生对正常细胞的伤害。另一方面，由于ATP和金属离子的配位作用，Fe-ZIF-8对ATP具有响应性，在ATP的存在下能够响应释放出其中的抗生素，在ROS破坏耐药性细胞的细胞壁、氧化其体内的蛋白质后，抗生素进一步作用避免细菌细胞壁的修复，两者的协同作用可以在低含量ROS以及小浓度抗生素的情况下高效的杀灭多耐药细菌。此外，水凝胶微球提供了抗生素@Fe-ZIF-8与葡萄糖氧化酶可以共存的微环境，其中的聚丙烯酰胺是类似于细胞外基质(ECM)的三维网格结构，有利于葡萄糖氧化酶和Fe-ZIF-8的产物中间体的转移，提高了级联反应的反应效率，通过ATP的双功能最终达到按需杀灭细菌并实现降低细菌抗药性的目的。

作为进一步优选的实施方式，上述抗生素为AMP(氨苄青霉素钠)。AMP作为抗生素药物，可以负载在Fe-ZIF-8中。在细菌分泌的ATP存在下，AMP@Fe-ZIF-8可发生分解，响应释放AMP，从而对细菌发生作用。

本发明还提供了上述按需激活的级联反应与抗生素协同的抗菌材料的制备方法，包括以下步骤：

将AMP、2-甲基咪唑、七水合硫酸亚铁混匀，再加入二水合乙酸锌静置反应20min-50min即得AMP@Fe-ZIF-8；将AMP@Fe-ZIF-8、葡萄糖氧化酶、丙烯酰胺、BIS和PI配置成酶/预凝胶溶液，然后进行促酶/预凝胶溶液凝胶化，即得到所述抗菌材料。

作为进一步优选的实施方式，上述AMP、2-甲基咪唑、七水合硫酸亚铁和二水合乙酸锌的比例为(18-22)mg：(5-9)mL：(0.3-0.5)mL：(1.5-1.7)mL。2-甲基咪唑和二水合乙酸锌二者通过固定的比例配合可以形成MOF框架，产生可作为抗生素AMP的载体；七水合硫酸亚铁加入后，可使MOF具有类过氧化物酶活性，同时，适当的含量可维持MOF原有的形貌。

作为进一步优选的实施方式，上述AMP、2-甲基咪唑、七水合硫酸亚铁和二水合乙酸锌的比例为：20mg：7mL：0.4mL：1.6mL。Fe-ZIF-8是ZIF-8合成过程中掺入了Fe

作为进一步优选的实施方式，上述静置反应时间为30min

作为进一步优选的实施方式，上述静置反应后还包括离心，水洗三次。

作为进一步优选的实施方式，上述AMP@Fe-ZIF-8、葡萄糖氧化酶、丙烯酰胺、BIS和PI用量的比例为5mg：2mg：150mg：10mg：10mg。

作为进一步优选的实施方式，上述采用微流控紫外聚合技术促酶/预凝胶溶液凝胶化。

本发明的有益效果为：

本发明提出的抗菌材料能够应用在医疗材料的制备中，其可以利用细菌分泌出来的ATP来打破Fe-ZIF-8的pH限制，使其在生理条件下也存在较为优异的催化活性，能够顺利和葡萄糖氧化酶级联产生ROS。另外，由于ATP和金属离子的配位作用，Fe-ZIF-8对ATP具有响应性，当ATP的存在时能够响应释放出其中的抗生素，在ROS破坏耐药性细胞的细胞壁、氧化其体内的蛋白质后，抗生素进一步作用避免细菌细胞壁的修复，从而达到按需协同抗菌并实现降低细菌耐药性的目的。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1所示为RBITC@Fe-ZIF-8有无ATP的扫描电子显微镜图片；

图2所示为葡萄糖存在下不同反应体系的生物催化活性比较；

图3所示为不同反应体系的抗菌性能比较。

具体实施方式

以下将结合实施例和附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。

实施例1

一种按需激活的级联反应与抗生素协同的抗菌材料，抗菌材料是由抗生素包埋在Fe-ZIF-8中，然后和葡萄糖氧化酶共埋在聚丙烯酰胺水凝胶微球中得到，抗生素为AMP(氨苄青霉素钠)。

实施例2

一种按需激活的级联反应与抗生素协同的抗菌材料的制备方法，具体包括以下步骤：

S1：20mg氨苄青霉素钠(AMP)于7mL 2M 2-甲基咪唑溶液中搅拌混匀，再加入0.4mL200mM七水合硫酸亚铁溶液搅拌混匀，随后再加入1.6mL 200mM二水合乙酸锌静置反应30min，离心水洗三次得到AMP@Fe-ZIF-8；

S2：将5mg 5mg/mL AMP@Fe-ZIF-8、2mg 2mg/mL葡萄糖氧化酶、150mg丙烯酰胺(5％wt)、10mg BIS(1％wt)和10mg PI(1％wt)溶于1ml超纯水中配置成酶/预凝胶溶液，然后利用微流控紫外技术促酶/预凝胶溶液凝胶化，即得到AFeGp。

实施例3

按照以下步骤制备RBITC(罗丹明B异硫氰酸酯)@Fe-ZIF-8，比较其在ATP有/无情况下的扫描电镜图，并利用荧光分光光度计记录其最大发射峰，以检测Fe-ZIF-8在ATP作用下的响应释放能力，具体包括以下步骤：

S1：2mg RBITC于7mL 2M 2-甲基咪唑溶液中搅拌混匀，再加入0.4mL 200mM七水合硫酸亚铁溶液搅拌混匀，随后再加入1.6mL 200mM二水合乙酸锌静置反应30mi n，离心水洗三次得到RBITC@Fe-ZIF-8；

S2：以pH＝7的HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)作为缓冲溶液，总体积200μL，反应温度37℃，反应时间为30min；

S3：用3支0.5mL离心管，分别编号为a、b、c；

S4：离心管a中溶液的配制方法为：5μL ATP(200mM)和10μL RBITC@Fe-ZIF-8(200μg/mL)混合液于185μL pH＝7的HEPES缓冲溶液中；

S5：离心管b中溶液的配制方法为：10μL RBITC@Fe-ZIF-8(200μg/mL)混合液于190μL pH＝7的HEPES缓冲溶液中；

S6：离心管c中溶液的配制方法为：10μL Fe-ZIF-8(200μg/mL)混合液于190μL pH＝7的HEPES缓冲溶液中；

S7：将3支离心管置于反应温度37℃下暗反应30min；

S8：置于扫描电镜中观察形貌变化，并利用荧光分光光度计分别测量溶液的相对荧光强度。

检测结果如图1所示，扫描电镜结果如图1a和1b，有ATP存在时，RBITC@Fe-ZIF-8的形貌发生了明显的改变，难以维持原有的构型，说明Fe-ZIF-8对ATP具有结构响应性。荧光分光光度计测量结果如图1c，有ATP存在时，RBITC@Fe-ZIF-8能够释放其中包埋的荧光物质RBITC，而无ATP时无荧光峰，说明Fe-ZIF-8对ATP具有响应释放能力。

实施例4

利用葡萄糖加入后级联产生的ROS活性实验，通过紫外分光光度计记录其最大吸收峰对应的强度，以检测不同催化体系有/无ATP的生物催化活性，具体包括以下步骤：

S1：将5mg 5mg/mL Fe-ZIF-8或5mg 5mg/mL AMP@Fe-ZIF-8、150mg丙烯酰胺(15％wt)、10mg BIS(1％wt)和10mg PI(1％wt)配置成酶/预凝胶溶液，然后利用微流控紫外技术促酶/预凝胶溶液凝胶化，即得到Fep或AFep；

S2：以pH＝7的HEPES作为缓冲溶液，总体积200μL，反应温度37℃，反应时间为60min；

S3：用8支0.5mL离心管，分别编号为a、b、c、d、e、f、g、h；

S4：离心管a中溶液的配制方法为：10μL Fe-ZIF-8、10μL TMB(20mM)和10μLglucose(200mM)混合液于170μL pH＝7的HEPES缓冲溶液中；相应的，离心管b中在此基础上加入5μL ATP(200mM)；

S5：离心管c中溶液的配制方法为：10μL GOx、10μL Fep、10μL TMB(20mM)和10μLglucose(20mM)混合液于160μL pH＝7的HEPES缓冲溶液中；相应的，离心管d中在此基础上加入5μL ATP(200mM)；

S6：离心管e中溶液的配制方法为：10μL GOx、10μL AFep、10μL TMB(20mM)和10μLglucose(200mM)混合液于160μL pH＝7的HEPES缓冲溶液中；相应的，离心管f中在此基础上加入5μL ATP(200mM)；

S7：离心管g中溶液的配制方法为：10μL AFeGp、10μL TMB(20mM)和10μL gl ucose(200mM)混合液于170μL pH＝7的HEPES缓冲溶液中；相应的，离心管h中在此基础上加入5μLATP(200mM)；

S8：所有离心管中的Fe-ZIF-8或GOx含量均保持一致；

S9：将8支离心管置于反应温度37℃下暗反应60min，利用紫外分光光度计分别测量溶液对应的吸光度。

检测结果如图2所示，在无ATP的情况下，各组分均无显色效果，吸光度值几乎为0；加入ATP后，由于底物为glucose，Fe-ZIF-8仍旧不显色，而GOx+Fep，GOx+AFep和AFeGp均有了较为明显的紫外吸收，且AFeGp的紫外吸收明显更高。这表明水凝胶微球提供的微环境有利于葡萄糖氧化酶和Fe-ZIF-8的产物中间体的转移，提高了级联反应效率。同时，GOx+Fep，GOx+AFep二者吸收强度几乎无差别说明包埋AMP后对Fe-ZIF-8的类酶活性几乎无影响。

实施例5

不同反应体系：Blank，AMP，GOx+Fe-ZIF-8，FeGp，GOx+AMP@Fe-ZIF-8和AF eGp的抗菌性能比较，随后利用琼脂培养板培养，计数菌落数量，具体包括以下步骤：

S1：以25g/L的肉汤培养基作为溶液，总体积2mL，反应温度37℃，反应时间为30h；

S2：用6支5mL玻璃管，分别编号为a、b、c、d、e、f；

S3：玻璃管a中溶液的配制方法为：60μL AFeGp于2mL含1×10

S4：玻璃管b中溶液的配制方法为：60μL相同浓度GOx+AMP@Fe-ZIF-8混合液于2mL含1×10

S5：玻璃管c中溶液的配制方法为：60μL相同浓度FeGp混合液于2mL含1×10

S6：玻璃管d中溶液的配制方法为：60μL相同浓度GOx+Fe-ZIF-8混合液于2mL含1×10

S7：玻璃管e中溶液的配制方法为：60μL相同浓度AMP混合液于2mL含1×10

S8：玻璃管f中溶液的配制方法为：2mL含1×10

S9：将6支玻璃管置于37℃的湿培养箱中作用30h；

S10：随后利用琼脂培养板培养，计数菌落数量。

检测结果如图3所示，含有AFeGp的平板作用30h后几乎达到了完全灭菌作用，而Blank，AMP，GOx+Fe-ZIF-8，FeGp和GOx+AMP@Fe-ZIF-8混合物处理的MRSA仍存在大量活跃的细菌。因此，AFeGp具有更高的抗菌活性，因为一方面ATP打破了Fe-ZIF-8的pH限制，使得Fe-ZIF-8能顺利和葡萄糖氧化酶级联产生ROS。另一方面，由于Fe-ZIF-8对ATP的响应性，抗生素被响应释放，在ROS破坏耐药性细胞的细胞壁，氧化其体内的蛋白质后，抗生素进一步作用避免细菌细胞壁的修复。与对照组相比，含有AFeGp的平板在30h后几乎完全阻止了菌落形成，而Blank，AMP，GOx+Fe-ZIF-8，FeGp和GOx+AMP@Fe-ZIF-8混合物处理的平板上仍存在大量较多菌落。

综上所述，本发明提出了一种协同抗菌体系的制备方法，利用水凝胶对酶空间构象的保护作用，以及具有类酶活性的纳米MOF对抗生素的装载，制备了AFeGp协同抗菌材料，实现了高效、可控的抗菌。该抗菌体系中，通过ATP的激活与响应释放作用，AFeGp激活纳米酶活性产生ROS破坏耐药性细胞的细胞壁，氧化其体内的蛋白质后，再通过响应释放的抗生素，进一步地避免了细菌细胞壁的修复，实现了活性氧与抗生素药物分子的按需协同杀菌作用。

显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或者特性可以包含在本实施例申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或是备选的实施例。本领域技术人员可以显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。