一种与番茄果实光泽度相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及蔬菜分子育种技术领域，特别是涉及一种与番茄果实光泽度相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicum L.)是全世界栽培最广泛的蔬菜作物之一，富含叶酸、维生素C、钾、番茄红素等营养物质。番茄果实颜色艳丽，营养价值高，作为一种可鲜食的果蔬，因其独特的风味和丰富的口感备受人们喜爱，种植面积逐年增加。我国是番茄生产量和种植面积最大的国家。近年来，随着我国社会经济发展，大众生活水平的日益提高，人们在对蔬菜水果的消费选择注重其营养、风味的同时，一些颜色鲜亮、外观整洁、表皮光滑的品种倍受人们的青睐。番茄的外观品质包含果实的颜色、光泽、形状等。果实光泽度是对果实表面反射光的能力进行评价的一项指标，反射光能力越强则光色度越高。光泽度是樱桃番茄果实的一个重要外观性状，具有高光泽性状的樱桃番茄由于鲜艳和亮丽的外表，深受广大消费者的喜爱，其市场价格比低光泽的樱桃番茄高。从国内消费市场来看，随着人们消费水平的提高，消费者对番茄的要求越来越高，具有较好外观的水果蔬菜已成为当今消费者的首选。番茄的外观感官品质也成为影响大多消费者购买心理的最直接因素之一，外观品质好的番茄具有较好的推广市场。在生产中，光泽好的品种因其价格较光泽差的品种价格高而受到农民欢迎，使得光泽度差的品种被逐渐淘汰，需要育成一批满足市场需求的高光泽番茄品种。

然而，在番茄育种体系中，品质性状的评价选育耗时较长，需等到番茄果实正常成熟后进行(李晓蕾等，2010)。在常规育种中，对果皮光泽性状的鉴定需要等到果实成熟期，耗时较长(周冰钰等，2013)。虽然分子标记辅助选择育种可有效地克服传统育种的缺陷，缩短育种周期，加速育种进程(朱明涛等，2010；许向阳等，2011；Xu et al.,2015)。但目前对光泽性状进行品种选育时较为盲目，尚无性状连锁的分子标记可以有效应用于分子标记辅助育种过程，亟需开展光泽性状精细定位的研究工作。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)作为第三代分子标记技术，因其在生物基因组中广泛分布、多态性丰富，具备易于检测和统计，可实现高通量自动化检测等优势，已广泛应用于种质资源研究、品种真实性鉴定、分子标记辅助育种等领域。针对单碱基变异，目前有多种基于PCR的SNP分子标记检测方法，例如酶切扩增多态性序列法、高分辨率熔解曲线、等位基因特异性PCR和竞争性等位基因特异性PCR(KompetitiveAllele Specific PCR)等。

PARMS(Penta-primer amplification refractory mutation system，五引物扩增受阻突变体系)是基于特异分辨SNP单碱基变异位点而开发的PCR检测技术。该技术可快速简单地进行SNP等位基因基因型检测。PARMS SNP采用5条引物进行PCR反应，其中2条荧光通用引物包含在PARMS2×Master Mix中。其余3条为标记特异引物，需要根据实验目的定制设计合成。这3条中，一条为标记位点的特异引物(Locus specific primer)，另2条为SNP等位基因特异引物(Allele specific primer)。这2条引物的5’分别加上21个碱基的特定通用接头序列，用于与荧光通用引物匹配扩增，与FAM荧光匹配的接头序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’,与HEX荧光匹配的接头序列为5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。标记引物设计基本原则可采用通用的引物设计规则，引物长度18～30bp，扩增片段小于250bp(含引物)，在满足引物设计条件前提下，越短越好。带有2个不同的通用接头引物序列的Allele 1和Allele 2特异扩增引物在DNA复性后与对应的SNPDNA模板结合，PARMS PCR酶和Buffer系统能保证严格的等位基因特异扩增，配合Locus特异扩增引物，经过头2轮PCR后，形成了带有通用接头序列的PCR扩增产物。此时带有报告荧光以及荧光猝灭基团的通用探针(无扩增时因FRET效应而无荧光信号)，可以以带有通用接头序列的PCR扩增产物作为模板进行PCR扩增，一旦扩增成功，荧光探针上的荧光猝灭基团与报告基团解离，FRET效应消失，此时进行荧光扫描，即可检测到对应的荧光信号，因而可以得知对应的等位基因是否存在。

PARMS技术准确度高、稳定性好；检测成本较低，对于不同SNP位点的检测只需要设计相应位点的三条普通引物，带有荧光标记的引物为通用引物；可兼容粗DNA碱煮法提取，样本准备时间极短，特别适合大规模高通量检测平台。近年来PARMS SNP检测技术在群体遗传学研究、疾病诊断、植物育种等领域得到越来越广泛的应用。因此，基于PARMS技术鉴定与番茄果实光泽度相关的SNP分子标记，用于判定被检测番茄材料是否为高光泽材料，对番茄果实高光泽品种辅助选育及快速鉴定具有重要价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种与番茄果实光泽度相关的SNP分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明开发的PARMS SNP分子标记与番茄果实光泽度表型共分离，可以实现在番茄幼苗期判定果实光泽度，从而减少制种成本，对番茄果实高光泽度品种辅助选育及快速鉴定具有重要价值。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种与番茄果实光泽度相关的SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示；SEQ ID NO：4所示序列第34bp处有一个A/G碱基突变。

本发明还提供一种检测所述SNP分子标记的引物组，包括核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的第一反向引物和核苷酸序列如SEQID NO：3所示的第二反向引物。

进一步地，所述第一反向引物和所述第二反向引物5’端连接不同颜色的荧光基团。

进一步地，所述第一反向引物连接FAM荧光基团，所述第二反向引物连接HEX荧光基团。

本发明还提供一种鉴定番茄果实光泽度的试剂盒，包括所述的引物组。

本发明还提供一种检测番茄果实光泽度的方法，包括以下步骤：

以待测番茄样本的DNA为模板，利用所述引物组进行PCR扩增，获取扩增产物；

根据扩增产物的荧光信号判断待测番茄的果实光泽度。

进一步地，若荧光信号为HEX，则判断待测番茄为基因型A，果实光泽度低；若荧光信号为FAM，则判断待测番茄为基因型G，果实光泽度高。

进一步地，所述PCR扩增的反应体系包括：2×PARMS master mix 5μL，正向引物0.15μL，第一反向引物0.15μL，第二反向引物0.4μL，DNA模板10-100ng，ddH

进一步地，所述PCR扩增的反应条件为：94℃15min；94℃20s，65-57℃1min，10个循环；94℃20s，57℃1min，32个循环。

本发明还提供一种利用所述的SNP分子标记、所述的引物组或所述的试剂盒在筛选番茄果实高光泽度品种中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明开发了一种与番茄果实光泽度关联的PARMS SNP分子标记，其SNP位点位于番茄第1号染色体第63041874位碱基，根据定位结果开发鉴定番茄果实光泽度的特异分子标记引物，根据检测标记位点上的多态性，鉴定番茄果实光泽度的差异。本发明开发的PARMS SNP分子标记与番茄果实光泽度表型共分离，可以实现在番茄幼苗期判定果实光泽度，从而减少制种成本，对番茄果实高光泽度品种辅助选育及快速鉴定具有重要价值。同时，也可以加速新的番茄或其它果菜类蔬菜的转育进程。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为番茄果实光泽度GWAS分析；图中橙色原点显示在第1号染色体第63041874bp位置检测到的与番茄果实光泽度显著关联的SNP；

图2为供试材料光泽度值；31份低光泽材料的果实光泽度值在1.1～3.6之间，31份高光泽材料的果实光泽度在8.9～18.7之间。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

实验材料：番茄群体材料(来自Zhu et al.,2018,Cell 172,249-261)。

1.番茄果实光泽度关联SNP挖掘：基于前期对297份(来自Guangtao Zhu，et al.,Rewiring ofthe Fruit Metabolome in Tomato Breeding.Cell 172,2018,Pages 249-261.e12)种质资源的果实光泽度，将基因组数据与果实光泽度进行全基因组关联分析(GWAS，Genome-wide association studies)，在第1号染色体第63041874bp位置(番茄参考基因组的NCBI登录号SL2.50(GCF_000188115.3))检测到与番茄果实光泽度显著关联的SNP(见图1)，发现存在A/G/-碱基突变。

2.用于PARMS检测SNP的分子标记引物组合设计：根据GWAS分析结果获得的SNP位点，查找第1号染色体第63041874bp位置，设计1条标记位点的特异引物(Locus specificprimer)为正向引物，2条SNP等位基因特异引物(Allele specific primer)，Allele Gprimer接FAM蓝色荧光接头序列，为第一反向引物；Allele A primer接HEX绿色荧光接头序列，为第二反向引物。引物序列如表1：

表1检测SNP的分子标记引物组合

注：Allele G primer中下划线序列为FAM荧光标签序列；Allele A primer中下划线序列为HEX荧光标签序列。

3.供试种质筛选：从GWAS群体中选取31份高果实光泽材料和31份低果实光泽度材料。62份供试材料的光泽度如图2所示，31份低光泽材料的果实光泽度值在1.1～3.6之间，31份高光泽材料的果实光泽度在8.9～18.7之间。

4.样本材料处理：取长宽约1cm的叶片放入深孔板中(96孔1.2ml)；加入100μL的0.3M氢氧化钠，(上海净信组织研磨仪)50Hz磨样2min(直至样品完全磨碎)；研磨后3000rpm离心1min，沸水浴2min；再加入200μL 0.2M Tris-HCl(pH6.8-7.0)后混匀，再次沸水浴2min；水浴完成后3000rpm离心1min，取上清液稀释20倍，-20℃冻存，作为后续PCR扩增的模板。

5.PCR扩增：PCR扩增反应体系如表2(2×PARMS master mix由武汉市景肽生物科技有限公司提供)：

表2 PCR扩增反应体系

PCR扩增反应条件如下(双头384PCR仪ABI Gene Amp 9700)：

表3 PCR扩增反应条件

扩增片段序列如下(SEQ ID NO：4)：

TTACGATTTAACGATAAATATCCTTATTTTTAA[R]AATATTAGGAATTTTATCTATTCGGTT；

注：R代表此处为A/G碱基突变位点。

6.基因分型：PCR完成后，使用TECAN infinite M1000酶标仪读取荧光信号，然后利用在线软件snpdecoder(http://www.snpway.com/snpdecoder/)解析转换荧光信号，得到清晰直观的分型图，并根据颜色不同，输出基因型结果。结果如表1所示，31份低光泽材料PARMS检测基因分型结果显示有25份材料基因分型结果均为HEX，与材料本身的基因型A吻合，证实该SNP分子标记位点突变为A，则待测番茄材料的果实光泽度低；另外有3份材料该位点存在缺失，基因分型结果为FAM，2份材料未显示检测结果；31份高光泽材料PARMS检测基因分型结果均为FAM，与材料的基因型G完全吻合，证实该SNP分子标记位点突变为G，则待测番茄材料的果实光泽度高。综合统计PARMS检测62份供试材料的结果，共有52份材料PCR基因分型结果与材料基因型一致，该分子标记的准确率达90.3％，说明利用该SNP分子标记对待测样本进行PARMS实验，能够有效检测其基因型，可用于番茄果实色泽的鉴定与辅助育种。

表4 62份供试材料的基因型和PARMS检测SNP分型结果对比

注：左：31份低光泽材料；右：31份高光泽材料。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。