E3泛素连接酶CHIP及其多肽片段作为尿液参比标志物的应用
文献发布时间:2024-04-18 19:58:26
技术领域
本发明涉及尿液外泌体E3泛素连接酶CHIP及其多肽片段的新用途,具体涉及E3泛素连接酶CHIP及其多肽片段作为尿液外泌体的稳定表达蛋白,具有在儿童、青少年、中年及老年整个人体生命周期尿液稳定表达特点,可作为尿液内参标志物、比对标志物在制备用于尿液外泌体检测,外泌体研究、健康人群临床研究、相关疾病诊断、鉴别诊断、病情程度与活动性判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究中的应用。
背景技术
泛素化修饰是一种蛋白质翻译后修饰,其广泛参与机体的各种生理活动。泛素化修饰能介导蛋白质的蛋白酶体和溶酶体依赖的降解,清除异常或正常废弃蛋白,其不仅广泛参与DNA修复、细胞生长及细胞周期调控,还参与到免疫系统发育和免疫反应各个阶段之中。除此之外,泛素化修饰也参与到许多非蛋白降解功能调节过程中,其在蛋白激酶活化、信号传导、调控组蛋白修饰、病毒出芽以及囊泡转运等方面发挥着重要调控作用。在广泛参与机体功能调节的泛素化系统中,由于 E3 泛素连接酶能特异性识别作用底物,其可决定泛素化修饰的特异性。有研究发现,E3泛素连接酶功能异常与肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病、自身免疫性疾病或个体发育异常等息息相关。热休克蛋白70 碳末端程互作用蛋白(Carboxy terminus of Hsc70 Interacting Protein, CHIP)是由Ballinger等于1999年从心脏 cDNA 文库中发现,CHIP可通过E3 泛素连接酶发挥生物学效应。CHIP所介导的泛素-蛋白酶体通路,在维持胞浆中蛋白质的稳态中发挥重要作用,E3 泛素连接酶 CHIP 是细胞内蛋白质质量控制的关键因素之一。本研究E3 ubiquitin-protein ligase CHIP在不同年龄分组的人群尿液外泌体中普遍存在,且组间无差别稳定表达。
与常用的临床血液样本相比,尿液可以完全无创、连续、大量收集;可累积更多种类、更大幅度的变化,机体的很多病理生理变化可能体现在尿液中。一些激素和细胞因子等分子量相对较小的蛋白多肽入血后很快被代谢并排泄入尿液,其在尿液中被检测到的概率较血中大幅增加;尿中可能的蛋白降解过程在样本收集前已经完成,尿蛋白可在较长时间内保持稳定。外泌体具有膜性囊泡结构,分子稳定性高,尿液外泌体蛋白质组学研究将二者优势结合,具备良好生物标志物来源的特质。本实验在前期方法学摸索的基础上,期望通过尿液蛋白或多肽研究,实现将无创、方便、快捷、易重复的尿液外泌体稳定表达蛋白应用于尿液内参标志物、尿液外泌体研究、健康人群临床研究、相关疾病诊断、鉴别诊断、病情程度与活动性判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究中,也为进一步尿液多肽检测试剂盒的研究奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种尿液外泌体E3泛素连接酶CHIP及其多肽片段作为尿液内参标志物、比对标志物在制备用于尿液外泌体检测,外泌体研究、健康人群临床研究、相关疾病诊断、鉴别诊断、病情程度与活动性判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究中的应用。
优选地,所述尿液外泌体E3泛素连接酶CHIP的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示(MKGKEEKEGG ARLGAGGGSP EKSPSAQELK EQGNRLFVGR KYPEAAACYG
RAITRNPLVA VYYTNRALCY LKMQQHEQAL ADCRRALELD GQSVKAHFFL
GQCQLEMESY DEAIANLQRA YSLAKEQRLN FGDDIPSALR IAKKKRWNSI
EERRIHQESE LHSYLSRLIA AERERELEEC QRNHEGDEDD SHVRAQQACI
EAKHDKYMAD MDELFSQVDE KRKKRDIPDY LCGKISFELM REPCITPSGI
TYDRKDIEEH LQRVGHFDPV TRSPLTQEQL IPNLAMKEVI DAFISENGWV
EDY );或由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列衍生的,且与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。
优选地,所述制剂为尿液外泌体E3泛素连接酶CHIP及其多肽片段检测试剂盒。
优选地,所述试剂盒包括抗原抗体反应的免疫方法及其试剂盒如能够特异性结合E3泛素连接酶CHIP及其多肽片段的适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。
优选地,所述检测方法包括直接检测E3泛素连接酶CHIP及其多肽片段的质谱等方法及其相关试剂盒。
优选地,所述检测方法包括直接检测E3泛素连接酶CHIP及其多肽片段的相关核酸检测等方法及其相关试剂盒。
优选地,所述试剂盒还包括选自下组的成分:固相载体,稀释液,对照品,标准品,质控品,检测抗体,第二抗体、第二抗体稀释液,发光试剂,洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。
优选地,所述标准品包括E3泛素连接酶CHIP标准品、人源化标签抗体标准品;较佳地,所述质控品包括:E3泛素连接酶CHIP质控品、人源化标签抗体质控品;较佳地,所述固相载体包括:微粒、微球、玻片、试纸条、塑料珠、液相芯片、微孔板或亲和膜等以及同等功能的其他载体。
优选地,所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种及具有类似功能的载体。
发明人首先收集不同年龄段男性及女性健康人尿液标本,参照人类尿液蛋白质组计划(Human Urine Proteome Project,HKUPP)和欧洲肾脏和尿液蛋白质组(EuropeanKidney and Urine Proteomics, EuroKUP)组(http://www.eurokup.org)标准操作程序对尿液外泌体的提取,通过透射电子显微镜、外泌体纳米微粒追踪检测及蛋白免疫印迹对尿液外泌体进行鉴定,通过液相二级质谱技术(liquid chromatography tandem massspectrometry,LC-MS/MS),采用数据非依赖性扫描模式(Data-independent acquisition,DIA),构建正常人群尿液外泌体蛋白质图谱,通过生信分析尿液外泌体稳定无差异表达蛋白E3泛素连接酶CHIP,发明人利用蛋白免疫印迹法对不同性别不同年龄健康人尿液外泌体E3泛素连接酶CHIP及其含量进行了验证。
本发明通过研究证实,健康人尿液外泌体E3 ubiquitin-protein ligase CHIP及其多肽片段稳定表达,从而提出检测尿液外泌体E3泛素连接酶CHIP及其多肽片段可用于尿液内参标志物、尿液外泌体、健康人群及相关疾病患者的各种目的应用检测。
本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势,利用尿液标本检测尿液外泌体E3泛素连接酶CHIP及其多肽片段。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂,下文特举较佳实施例,并配合附图,作详细说明如下。
附图说明
图1是尿液外泌体E3泛素连接酶CHIP及其多肽片段在健康人群中的含量图。
图2是尿液外泌体E3泛素连接酶CHIP及其多肽片段在健康人群中的蛋白免疫印迹结果图。
具体实施方式
实施例1
收集覆盖儿童、青少年、中年及老年的7个年龄段男性及女性正常生活状态下清洁中段晨尿100mL。入组人员均无高血压、糖尿病、心脑血管疾病以及其他系统疾病,也无肝肾功能异常,近1月内无药物服用史,并且表观健康。经当事者同意,取上述人群正常生活状态下清洁中段晨尿100mL。参考HKUPP和EuroKUP)(http://www.eurokup.org)的标准操作程序,提取浓缩后尿液样本中的外泌体,重悬在预冷的PBS中,保存于-80℃冰箱。通过透射电子显微镜、外泌体纳米微粒追踪检测与蛋白免疫印迹对尿液外泌体进行鉴定。
实施例2
对尿液样品进行蛋白提取及酶解脱盐,对提取的蛋白浓度进行测定。通过先进的液相二级质谱技术(LC-MS/MS),采用数据非依赖性扫描模式(DIA),构建不同年龄段不同性别正常人群尿液外泌体蛋白质图谱。所有实验均进行三次,所有数值以平均值±标准偏差表示。Fold change 1.5倍,得到差异蛋白的分析结果,FDR<0.05被认为有统计学意义。
实施例3
使用Homo sapiens数据库。通过 PD 软件分析质谱原始文件,使用数据库直系同源群簇(Clusters of Orthologous Groups,COG)进行同源分类,使用蛋白质数据库进行基因本体论(Gene Ontology,GO)对细胞组分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)、生物过程(biological process,BP)进行统计分析,筛选稳定表达蛋白。
实施例4
通过质谱定量分析,尿液外泌体E3泛素连接酶CHIP在健康人群中的含量如图1所示,使用蛋白免疫印迹对健康人群尿液外泌体中的E3泛素连接酶CHIP进行检测,结果如图2所示。E3泛素连接酶CHIP在健康人尿液中无差异稳定表达。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上,然其并非用以限定本发明,任何所属技术领域的技术人员,在不脱离本发明的精神和范围内,当可作些许的更动与改进,因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。
序列表
<110> 张 曼
<120> E3泛素连接酶CHIP及其多肽片段作为尿液参比标志物的应用
<130> 21CHIP-CN
<140> 21CHIP-CN
<141> 2021-11-30
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 303
<212> PRT
<213> Human Urine
<400> 1
Met Lys Gly Lys Glu Glu Lys Glu Gly Gly Ala Arg Leu Gly Ala Gly
1 5 1015
Gly Gly Ser Pro Glu Lys Ser Pro Ser Ala Gln Glu Leu Lys Glu Gln
202530
Gly Asn Arg Leu Phe Val Gly Arg Lys Tyr Pro Glu Ala Ala Ala Cys
354045
Tyr Gly Arg Ala Ile Thr Arg Asn Pro Leu Val Ala Val Tyr Tyr Thr
505560
Asn Arg Ala Leu Cys Tyr Leu Lys Met Gln Gln His Glu Gln Ala Leu
65707580
Ala Asp Cys Arg Arg Ala Leu Glu Leu Asp Gly Gln Ser Val Lys Ala
859095
His Phe Phe Leu Gly Gln Cys Gln Leu Glu Met Glu Ser Tyr Asp Glu
100 105 110
Ala Ile Ala Asn Leu Gln Arg Ala Tyr Ser Leu Ala Lys Glu Gln Arg
115 120 125
Leu Asn Phe Gly Asp Asp Ile Pro Ser Ala Leu Arg Ile Ala Lys Lys
130 135 140
Lys Arg Trp Asn Ser Ile Glu Glu Arg Arg Ile His Gln Glu Ser Glu
145 150 155 160
Leu His Ser Tyr Leu Ser Arg Leu Ile Ala Ala Glu Arg Glu Arg Glu
165 170 175
Leu Glu Glu Cys Gln Arg Asn His Glu Gly Asp Glu Asp Asp Ser His
180 185 190
Val Arg Ala Gln Gln Ala Cys Ile Glu Ala Lys His Asp Lys Tyr Met
195 200 205
Ala Asp Met Asp Glu Leu Phe Ser Gln Val Asp Glu Lys Arg Lys Lys
210 215 220
Arg Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Cys Gly Lys Ile Ser Phe Glu Leu Met
225 230 235 240
Arg Glu Pro Cys Ile Thr Pro Ser Gly Ile Thr Tyr Asp Arg Lys Asp
245 250 255
Ile Glu Glu His Leu Gln Arg Val Gly His Phe Asp Pro Val Thr Arg
260 265 270
Ser Pro Leu Thr Gln Glu Gln Leu Ile Pro Asn Leu Ala Met Lys Glu
275 280 285
Val Ile Asp Ala Phe Ile Ser Glu Asn Gly Trp Val Glu Asp Tyr
290 295 300
- E3泛素连接酶CHIP在脑胶质瘤疾病中的应用
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