增强型槐糖脂衍生物

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年2月15日递交的美国临时专利申请号63/149,477的权益，其通过引用其整体并入本文。

背景技术

消费者每天使用并暴露于家庭和个人护理产品。例如，大多数消费者的日常惯例包括使用化妆品、洁面乳、口腔护理产品和/或其他个人护理和卫生产品。另外，每天都会使用清洁组合物用于对表面进行消毒，以及去除在例如厨房和浴室中的诸如盐的沉积物。虽然许多此类产品含有作为活性成分的刺激性化学物质，但也可能包含其他化学物质作为添加剂，其例如有助于诸如香料、染料和活性成分的粘度、发泡、防腐蚀和溶解度等性能。

使用特别刺激性的化学物质的一种特定种类的产品是消毒产品。消毒剂对于工业、消费者和医疗机构来说是必不可少的，用于降低由机会性病原体导致的人类和动物感染的风险，对抗流行病，并为医疗程序提供无菌环境。然而，消毒产品的制造商和配方师在提供对人体暴露安全且易于在环境中生物降解的有效产品方面面临着重大问题。挑战的核心是这一事实，即消毒产品中的活性成分具有固有的急性危害，包括化学灼伤和毒性，并且其广泛的活性限制了其生物降解能力。这些消毒成分的示例包括：短链醇(SCA)、次氯酸盐、过氧化物和季铵化合物(QAC)。

对人类和家畜的毒性是现有消毒活性成分的短期问题。可归因于这些成分的环境损害尚未得到充分了解；然而，它很大程度上依赖于剂量。SCA、次氯酸盐和过氧化物均已被证明是可生物降解的，其速率不会在环境中显示显著积聚。大量泄漏或故意使用此类消毒成分确实会造成环境破坏，但效果不会持久。

另一方面，QAC已被证明可以在环境中持续存在。虽然在实验室有氧条件下已经显示了生物降解途径，但QAC，尤其是那些含有芳香族支架的，很容易在环境污泥中积聚，并且很难分配到水性介质中。这将QAC从能够发生生物降解的有氧环境中去除。QAC在厌氧环境污泥和土壤中的积聚构成重大挑战。去除自然和人类活动促进的其他含氮环境污染物的典型方法因QAC的存在而受到严重限制。

QAC在厌氧污泥环境中的生物降解是可能的，但QAC的主要分解产物包括短烷基胺，例如甲胺。烷基胺可以在能够降解QAC的微生物内积聚，导致QAC降解酶的抑制和/或对微生物本身的毒性。让问题变得更加复杂的是，QAC已被证明可以抑制微生物用来降解其他化合物的甲烷生成和其他厌氧消化途径。因此，环境中QAC的风险会带来通常会降解的其他危险化学物质积聚的风险。

除了环境中QAC积聚的问题及其对生物降解途径所必需的微生物的影响外，最近的研究表明QAC环境积聚正在加速对传统抗生素具有抗性的微生物的发展。发现的负责在细菌中给予QAC抗性的相同基因与医学研究人员研究的抗药细菌相关。这种抗性的机制涉及使用对外源化合物具有广泛特异性的外流蛋白。因此，QAC在环境中的积聚将导致选择能够抵抗它们并且无意中可能抵抗传统抗生素的细菌。

有多种天然分子已被证明作为消毒活性成分具有一定的功效。这些类型的分子中研究最多的是抗菌肽(AMP)或阳离子宿主防御肽。虽然AMP的强大性能以及与人类和动物健康的相容性使其成为作为消毒活性成分使用的主要候选者，但当代技术无法划算地生产它们。缺乏以有利于商业化的成本生产AMP的方法，这阻碍了它们作为消毒活性成分和治疗剂的使用。

具有表明作为消毒活性成分的效用的特性的另一类源自自然的分子是生物表面活性剂。生物表面活性剂是微生物衍生的两亲分子，由疏水性结构域(例如脂肪酸)和亲水性结构域(例如糖)组成。由于其两亲性质，生物表面活性剂可以在不同流体相之间的界面处(例如油/水或水/空气界面)分配。与合成表面活性剂不同，生物表面活性剂在热水或冷水以及任意极端的pH值下均有效。此外，生物表面活性剂可生物降解且无毒。

尤其是糖脂类生物表面活性剂在细胞生物学中具有许多重要的生理作用，主要是作为细胞膜的主要成分；然而，由于它们有可能作为传统表面活性剂的生物替代品，它们近年来引起了人们的关注。槐糖脂(SLP)是一种感兴趣的特殊的糖脂。然而，与AMP相反，SLP本身缺乏足够的活性来作为消毒活性成分。

SLP包含由通过糖苷醚键链接至一个脂肪酸的两个葡萄糖分子组成的槐糖。SLP分为两种一般形式：内酯形式，其中脂肪酸侧链中的羧基与槐糖部分形成环酯键；以及酸形式或线性形式，其中酯键被水解。除了这些形式外，还存在许多衍生物，其特征在于脂肪酸侧链中是否存在双键、碳链的长度、糖苷醚键的位置、存在或不存在引入到糖部分的羟基的乙酰基、以及其他结构参数。

酵母细胞在包含具有不同长度碳链的糖和/或脂质和脂肪酸的培养基质中的发酵可用于产生多种SLP。熊蜂生斯塔莫酵母(假丝酵母)是最广泛认可的SLP生产者之一。通常，酵母在发酵过程中产生内酯和线性SLP，其中约60-70％的SLP包含内酯形式，并且其余部分包含内酯形式。

使用酵母发酵制备SLP通常会产生一系列具有一定结构分布的分子。此外，由于生物过程的性质，很难标准化从酵母培养物中提取的纯SLP的精确浓度。此外，粗糙形式SLP可能具有浑浊的外观和某些不期望的气味。因此，纯化通常是制备所需且可销售的产品所必需的。

消费者越来越多地寻找无毒、对皮肤和/或眼睛无刺激、对环境影响较小的清洁产品以及其他家庭和个人护理产品，但这些更安全和更可持续的产品仍然被期望在许多特性(例如清洁和减少病菌)上发挥与传统产品相同的性能。由于满足这些需求的天然或可持续材料有限，配制安全且环保的清洁组合物仍然是一个挑战。

因此，需要可有效地对材料和/或表面进行消毒并且不含有害或污染性化学物质或合成衍生的消毒剂的改进的清洁组合物。

发明内容

本申请提供了用于制备适于衍生化的槐糖脂(SLP)的材料和方法；衍生槐糖脂的材料和方法；将槐糖脂纯化至高纯度水平的材料和方法；以及根据所描述的方法产生的衍生SLP。更具体地，在某些实施方式中，提供了用于制备阳离子SLP衍生物的工艺，其中在一些实施方式中，该工艺包括两步合成方案以产生反应性醛柄，然后将阳离子可生物降解官能团安装到其上。SLP和阳离子SLP衍生物可以使用例如离子交换树脂纯化，以提供高纯度的SLP和SLP衍生盐，用于配制到例如清洁和消毒消费品中。

有利地，在某些实施方式中，根据本发明产生、衍生和/或纯化的SLP表现出有利的抗微生物活性，并且可以用作家庭、工业环境、办公室和零售环境以及医疗保健中的消毒活性成分。因此，在某些实施方式中，本发明提供了有利的新型SLP衍生物，包括例如附图中和通过本发明说明书描述的那些。

在优选的实施方式中，本发明的方法最初包括产生用于产生衍生化和/或纯化的SLP的标准化SLP分子“底物”。图1。在某些实施方式中，这需要在包含定制的油化学原料的浸没式发酵反应器中培养产槐糖脂的酵母以产生酵母培养物产物，所述酵母培养物产物包含发酵肉汤、酵母细胞和具有两种或多种分子结构的混合物的粗制SLP。

在某些实施方式中，产槐糖脂酵母是熊蜂生斯塔莫酵母(Starmerellabombicola)，或斯塔莫酵母和/或假丝酵母分支的另一成员。例如，可以根据本发明的方法使用熊蜂生斯塔莫酵母菌株ATCC 22214。

分子结构的混合物可包含例如内酯SLP、线性SLP、脱乙酰化SLP、单乙酰化SLP、二乙酰化SLP、酯化SLP、具有不同疏水链长度的SLP、附接有脂肪酸-氨基酸复合物的SLP和其他SLP，包括在本公开中具体示例的和/或未具体示例的那些。

在某些实施方式中，SLP分子的混合物的分布可以通过调节发酵参数(例如原料、发酵时间和/或溶解氧水平)来改变。

在优选的实施方式中，调整油化学原料以包括油酸源。在某些实施方式中，油酸含量高，例如为至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方式中，油化学原料仅包含油酸源。

有利地，在某些实施方式中，使用高油酸和/或纯油酸油化学原料产生酵母培养物产物，其包含比使用含有其他脂肪酸源的原料更低的SLP分子结构多样性，其中产生的主要SLP分子含有C18碳链和位于第九个碳的单不饱和键。

在某些实施方式中，为了确保酵母完全消耗油化学原料，将发酵时间延长至超过制备SLP的典型时间。在一些实施方式中，发酵时间在40小时至150小时或50至120小时的范围内。

在某些实施方式中，在发酵期间控制溶解氧(DO)水平，以缩小酵母培养物产物中产生的SLP分子的结构多样性。优选地，DO水平维持在高水平，使得例如氧转移以高于50mM每小时每升、高于60mM每小时每升或高于70mM每小时每升的速率发生。

在某些实施方式中，SLP分子“底物”的产生还包括对酵母培养物产物中产生的粗制SLP分子的发酵后改变。在一种实施方式中，粗制SLP被水解以产生线性SLP。在一些实施方式中，线性SLP被脱乙酰化。

水解优选包括将粗制SLP与提高pH的碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾和/或氢氧化铵)混合，其中增加的pH导致内酯SLP中的内酯键断裂并将其转化为线性SLP(图2)，以及在一些实施方式中，单乙酰化和/或二乙酰化SLP的脱乙酰化。

在一些实施方式中，当水解过程中存在旁观阳离子时，使用离子交换树脂纯化粗制线性SLP。更具体地，在优选的实施方式中，使用例如蠕动泵或其他类型的泵将粗制线性槐糖脂循环通过含有离子交换位点的离子交换床一段时间，例如15分钟至20小时、3小时至15小时、4小时至12小时、或优选地30分钟至3小时。

在某些实施方式中，与水解反应中使用的氢氧化物盐的浓度相比，离子交换位点的量是等摩尔或高达1.5摩尔或更多。在一些实施方式中，离子交换位点是阳离子交换位点。

有利地，离子交换树脂提供了用于纯化SLP分子和用于中和反应产物的pH的新方法，而不需要可以稀释和/或改变最终产物的化学性质的标准猝灭方法。

在优选的实施方式中，除去了旁观阳离子的线性SLP用作用于一种或多种衍生化和/或纯化程序的标准化底物。

除去了旁观阳离子后，可以采用两步合成方案在线性SLP上生成反应性醛柄，然后安装阳离子可生物降解官能团。图3。

在优选的实施方式中，步骤一包括采用臭氧分解将线性SLP分子的烯烃部分氧化成臭氧化物(反应性5元环)，然后还原所得的SLP-臭氧化物以产生具有醛柄的线性SLP。图4。在特定位置(例如，在脂肪酸部分的第九个碳)含有不饱和键的槐糖脂允许槐糖脂分子的定点官能化。

在一些实施方式中，步骤一包括产生具有醛官能团的线性SLP的另一途径，其中另一途径涉及SLP分子的脂肪酸尾部中存在的不饱和键的氧化裂解。在某些实施方式中，氧化裂解途径涉及一锅、两阶段转化，对本领域技术人员来说，其可以通过许多不同的化学试剂来完成。在一个实施方式中，首先在合适的溶剂中用四氧化锇(OsO

在某些实施方式中，无论是通过臭氧分解还是氧化裂解产生，反应性醛柄然后用作通过步骤二还原胺化添加伯胺的位点。在某些实施方式中，还原胺化包括在还原条件下将伯胺引入SLP-醛中。这会产生稳定的仲胺，作为SLP“支架”和伯胺“货物”之间的共价连接。图5。

在某些实施方式中，线性SLP底物可以使用酰胺偶联来安装包含阳离子氨基酸官能团的酰胺(而不是安装醛柄)，以产生长链酰胺衍生物(例如，C18)。图6。

在一些实施方式中，线性SLP底物可以安装有酰胺以产生短链酰胺衍生物(例如，C9)，首先通过氧化裂解截短脂肪酸部分，然后将截短的酸与包含阳离子氨基酸官能团的酰胺偶联。图7A-7B。

用于根据本发明的酰胺安装的偶联剂可包括例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI/HOBt)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PYBOP)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵四氟硼酸盐(TBTU)，和/或N,N'-二环己基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑(DCC/HOBt)。

在某些实施方式中，可以利用类似的反应方案将包含醛柄的线性SLP转化为长链或短链酰胺。在一些实施方式中，截短的酸(图7A)可以充当用于安装醛柄的替代底物。

在某些实施方式中，根据本方法的伯胺是阳离子氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸或组氨酸。在某些实施方式中，伯胺是含有阳离子氨基酸的重复段的短肽。在某些实施方式中，伯胺是含有作为间隔区的甘氨酸残基的短肽，其位于SLP支架和伯胺货物之间，或者位于阳离子氨基酸残基之间。图8。

在某些实施方式中，本发明的SLP衍生物的独特的阳离子性质允许阳离子离子交换树脂用于选择性纯化。将来自前述工艺的粗制反应混合物应用于阳离子离子交换树脂允许选择性保留阳离子物质，并选择性去除未反应的SLP和/或不包含所需链长或特征(例如，C18，单不饱和)的SLP。

在优选的实施方式中，从树脂中除去SLP阳离子衍生物是通过应用含有大浓度单价金属阳离子的电解质溶液来实现的。大浓度的单价金属阳离子胜过结合的SLP阳离子衍生物，使它们在树脂上交换并产生SLP阳离子衍生物的高度纯化流。图8-12。

在某些实施方式中，根据本方法产生的衍生阳离子SLP可以用作环境友好型清洁组合物中的活性成分，用于对被例如细菌、病毒、真菌、霉菌、霉、原生动物、生物膜和/或其他传染性生物体污染的材料和/或表面进行有效灭菌和/或消毒。有利地，在优选的实施方式中，组合物和方法至少与抗微生物肽(AMP)或阳离子宿主防御肽以及其他化学和/或合成清洁制剂(例如QAC和SCA)一样有效地对材料和/或表面进行消毒。

可选择地，清洁组合物还可包含一种或多种其他组分，包括例如载体(例如水)、亲水性和/或疏水性连接剂、多价螯合剂、助洗剂、溶剂、有机和/或无机酸(例如乳酸、柠檬酸、硼酸)、精油、植物提取物、交联剂、螯合剂、脂肪酸、醇、pH调节剂、还原剂、钙盐、碳酸盐、缓冲剂、酶、染料、着色剂、香料、防腐剂、萜烯、倍半萜类、类萜、乳化剂、反乳化剂、发泡剂、消泡剂、漂白剂、聚合物、增稠剂和/或增粘剂。

清洁组合物可以配制为例如微乳液、可溶解粉末和/或颗粒、压制粉末、松散粉末、固体条、稀释喷雾、浓缩物、气雾剂、泡沫、马桶清洁剂、洗衣粉、餐具洗涤剂、胶囊化的可溶解的囊、凝胶和/或配制为预润湿或水活化的布、海绵、抹布或其他基材。

在优选的实施方式中，本发明提供了用于对在其中或其上具有有害微生物的材料和/或表面进行灭菌和/或消毒的方法，其中该方法包括将本发明的清洁组合物施用于材料和/或表面，使得组合物与有害微生物接触。有利地，该方法可在人类、植物和动物的存在下安全地用于家庭、商业、医疗保健和工业环境。

清洁组合物可施用于例如柜台、地板、卫生间、衣服和纺织品、医疗装置和植入物、塑料和陶瓷盘、地毯和垫子、玩具、门把手、浴缸、水槽、玻璃和窗户。该组合物还可用于对流体(例如空气和/或水)进行消毒。

有利的是，本发明的使用不会对使用者造成伤害，并且不会向环境中释放大量的污染和有毒化合物。另外，该组合物和方法利用可生物降解且毒理学安全的组分。因此，本发明可作为“绿色”消毒剂用于多种行业。

附图说明

图1描绘了用于制备含有油酸链的线性槐糖脂的根据本发明的一个实施方式的制备方案。

图2描绘了根据本发明的一个实施方式的反应方案，其示出了二乙酰化内酯槐糖脂的水解以产生线性槐糖脂。

图3描绘了用于制备线性阳离子槐糖脂的根据本发明的一个实施方式的制备方案。

图4描绘了根据本发明的一个实施方式的反应方案，其示出了使用臭氧分解来产生在位置9处具有醛的线性槐糖脂。

图5描绘了根据本发明的一个实施方式的反应方案，其示出了使用还原胺化来制备线性槐糖脂。R基团可以是含有衍生自氨基酸的一种或多种阳离子胺的任何烷基或芳基。

图6描绘了根据本发明的一个实施方式的反应方案，其示出了线性SLP底物的酰胺偶联以产生含有阳离子氨基酸残基的长链酰胺。

图7A-7B描绘了(A)根据本发明的实施方式的反应方案，其示出了线性SLP底物的氧化裂解以产生截短酸，和(B)根据本发明的实施方式的反应方案，其示出了截短酸的酰胺偶联以产生含有阳离子氨基酸残基的短链酰胺。

图8A-8B描绘了根据本发明的实施方式的线性单阳离子槐糖脂衍生物的示例。

图9描绘了根据本发明的实施方式的线性聚阳离子槐糖脂衍生物的示例。所有氨基酸残基都是可变的，并且可以被例如精氨酸、甘氨酸、组氨酸和/或赖氨酸取代。

图10描绘了根据本发明的实施方式的最多二价阳离子线性槐糖脂衍生物的示例。

图11描绘了根据本发明的实施方式的最多三价阳离子线性槐糖脂衍生物的示例。

图12描绘了根据本发明的实施方式的最多四价阳离子线性槐糖脂衍生物的示例。

图13描绘了根据本发明的一个实施方式的反应方案的示例，其示出了醇保护基团的去除以及随后槐糖脂衍生物的胺盐的形成。

图14描绘了根据本发明的一个实施方式的反应方案，其示出了用仲胺生成线性槐糖脂的三步合成途径，其不需要烯烃官能团的臭氧分解。

图15描绘了根据本发明的一个实施方式的反应方案，其示出了含有醛和烯烃官能团同时保留原始烷基链长度的线性槐糖脂的合成路线。

图16描绘了根据本发明实施方式的反应方案，其示出了将内酯槐糖脂直接还原为含有醛和烯烃官能团同时保留原始C18烷基链的线性槐糖脂。

具体实施方式

本申请提供了用于制备适于衍生化的槐糖脂(SLP)的材料和方法；用于槐糖脂衍生化的材料和方法；用于将槐糖脂纯化至高纯度水平的材料和方法；以及根据本方法制备的衍生SLP。

在某些实施方式中，本发明提供了阳离子SLP衍生分子，包括例如附图和整个主题说明书中描述的那些。这些阳离子SLP衍生物可以使用例如离子交换树脂进行纯化，以提供用于配制为消毒消费品的高纯度的SLP衍生盐。

槐糖脂是由例如斯塔莫酵母分支的各种酵母产生的糖脂生物表面活性剂。SLP由链接至长链羟基脂肪酸的二糖槐糖组成。它们可包含β-糖苷地连接至17-L-羟基十八烷酸或17-L-羟基-Δ9-十八碳烯酸的部分乙酰化的2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-D-吡喃葡萄糖单元。羟基脂肪酸可以具有例如11至20个碳原子，并且可以含有一个或多个不饱和键。此外，槐糖残基可以在6-位和/或6'-位上被乙酰化。脂肪酸羧基可以是游离的(酸性或线性形式)或在4”-位处内部酯化(内酯形式)。在大多数情况下，SLP的发酵产生疏水性(水不溶性)SLP和亲水性(水溶性)SLP的混合物，疏水性SLP包括例如内酯SLP、单乙酰化线性SLP和二乙酰化线性SLP，亲水性SLP包括例如非乙酰化线性SLP。

如本文所用，术语“槐糖脂”、“槐糖脂分子”、“SLP”或“SLP分子”包括SLP分子的所有形式及其异构体，包括，例如，酸性(线性)SLP和内酯SLP。还包括单乙酰化SLP、二乙酰化SLP、酯化SLP、具有不同疏水链长度的SLP、连接有脂肪酸-氨基酸复合物的SLP以及其他SLP，包括在本公开中描述和/或未描述的那些SLP。

在一些实施方式中，根据本发明的SLP分子由通式(1)和/或通式(2)表示，并且作为具有不同脂肪酸链长度(R

在通式(1)或(2)中，R

取代基的非限制性示例包括卤素原子、羟基、低级(C1-6)烷基、卤代低级(C1-6)烷基、羟基低级(C1-6)烷基、卤代低级(C1-6)烷氧基和其他。R

选定的定义

如本文所用，“绿色”化合物或材料是指至少95％衍生自天然、生物和/或可再生来源，例如植物、动物、矿物质和/或微生物，并且此外，该化合物或材料是可生物降解的。另外，在一些实施方式中，“绿色”化合物或材料对人类的毒性最小，并且可以具有LD50>5000mg/kg。“绿色”产品优选不含以下任何物质：非植物基乙氧化表面活性剂、线性烷基苯磺酸盐(LAS)、醚硫酸盐表面活性剂或壬基酚乙氧基化物(NPE)。在某些优选的实施方式中，本文描述的SLP分子(包括衍生的SLP分子)是对使用者具有最小毒性的“绿色”化合物。

如本文所用，“生物膜”是微生物(例如细菌、酵母或真菌)的复杂聚集体，其中细胞利用细胞外基质彼此粘附和/或粘附到表面。生物膜中的细胞在生理上不同于同一生物体的浮游细胞，浮游细胞是可以在液体培养基中漂浮或游泳的单细胞。

如本文所用，“污染物”是指导致另一种物质或物体变脏或不纯的任何物质。污染物可以是有生命的或无生命的，可以是无机或有机物质或沉积物。此外，污染物可包括但不限于：诸如石油或沥青质的碳氢化合物；脂肪、油和油脂(FOG)，例如烹饪油脂、植物油和猪油；脂质；蜡，例如石蜡；树脂；微生物，例如细菌、生物膜、病毒、真菌、霉菌、霉、原生动物、寄生虫或其他传染性微生物；污渍；或被称为例如污物、灰尘、水垢、污泥、污垢、矿渣、尘垢、浮渣、斑块、堆积物或残留物的任何其他物质。

如本文所用，“污损”是指污染物在例如一件设备的表面上以损害设备的结构和/或功能完整性的方式累积或沉积。污损可导致阻塞、堵塞、劣化、腐蚀以及与其相关的其他问题，并且可发生在金属和非金属材料和/或表面上。由于生物体(例如生物膜)而产生的污损被称为“生物污损”。

如本文所用，在污染物或污损的上下文中使用的“清洁”是指从材料和/或表面去除或减少污染物。

如本文所用，“消毒”是指在组合物与有害微生物接触时间(即暴露时间)之后的10分钟或更短的时间内、优选5分钟或更短的时间内、更优选2分钟或更短的时间内，控制或基本上控制有害微生物。

如本文所用，“控制”在微生物的上下文中是指杀死、固定、破坏、去除、减少种群数量和/或以其他方式使微生物不能繁殖和/或造成实质性伤害或污损。

在优选的实施方式中，有害微生物是“基本上受控制的”，意思是指定区域内至少90％、优选至少95％、或更优选至少99％的微生物种群受到控制。

在某些优选实施方式中，100％的有害微生物受到控制，这意味着表面和/或材料已被“消毒”。

如本文所用，“有害”或“致病”微生物是指能够在另一生物体中引起感染、疾病或其他形式的伤害的任何单细胞或非细胞生物体。如本文所用，有害或致病微生物是传染原，并且可以包括例如细菌、蓝藻细菌、生物膜、病毒、病毒粒子、类病毒、真菌、霉菌、霉、原生动物、朊病毒和藻类。在某些实施方式中，有害微生物可以包括多细胞生物体，例如某些寄生虫、蠕虫、线虫和/或地衣。

如本文所用，“预防”情况或事件是指避免、延迟、预先阻止或最小化情况或事件的特定征兆或症状的发生。预防可以但不要求是绝对或彻底的，这意味着情况或事件可能在以后仍会发展。预防可包括降低情况或事件发生的严重性，和/或抑制情况或事件发展为更严重的情况或事件。

如本文所用，“表面活性剂”是指当溶解在水或水溶液中时降低表面张力或降低两种液体之间或液体与固体之间的界面张力的物质或化合物。因此，术语“表面活性剂”包括阳离子试剂、阴离子试剂、非离子试剂、两性离子试剂、两性试剂和/或它们的组合。“生物表面活性剂”是指由活细胞和/或使用天然衍生来源产生的表面活性剂。

如本文所用，“碱性表面活性剂(base surfactant)”是指表现出以相对有序的方式、垂直于界面取向的在界面处吸附的强烈倾向的表面活性剂或两亲性分子。

如本文所用，术语“连结剂”(意指连接或链接在一起，如在混合水和油中)是指相对较弱的两亲物，其仅在界面已经带有碱性表面活性剂或碱性表面活性剂的混合物的吸附层时表现出在油-水界面(从水相(因而是亲水连结剂)或从油相(因而是疏水连结剂))吸附的显著能力。在油水界面上的连结剂的吸附被认为以一种非常有利于产生非常低的油水界面张力的方式影响所吸附的普通表面活性剂的间距和/或顺序，这反过来又增加油的溶解和/或从固体材料和/或表面去除油。

如本文所用，“分离的”或“纯化的”核酸分子、多核苷酸、多肽、蛋白质或有机化合物(例如小分子)基本上不含与其性质上相关的其他化合物，例如细胞材料。纯化或分离的多核苷酸(核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))在其天然存在状态下不含其侧翼的基因或序列。纯化或分离的多肽在其天然存在的状态下不含其他分子或其侧翼的氨基酸。“分离的”菌株是指将该菌株从其自然存在的环境中移出。因此，分离的菌株可以作为例如生物学纯的培养物或作为孢子(或菌株的其他形式)存在。

在某些实施方式中，纯化的化合物是目标化合物的重量的至少60％。优选地，该制剂是目标化合物的重量的至少75％、更优选至少90％、最优选至少99％。例如，纯化的化合物是所需化合物的重量的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％或100％(w/w)的化合物。通过任何适当的标准方法测量纯度，例如通过柱色谱法、薄层色谱法或高效液相色谱法(HPLC)分析。

本文提供的范围应理解为该范围内所有值的简写。例如，1至20的范围被理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20组成的组的任何数字、数字的组合或子范围，以及上述整数之间的所有中间十进制值，例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于子范围，特别考虑从该范围的任一端点延伸的“嵌套子范围”。例如，1至50的示例性范围的嵌套子范围可以包括沿一个方向的1至10、1至20、1至30和1至40，或者沿另一个方向的50至40、50至30、50至20和50至10。

如本文所用，“减少”意指负改变，而“增加”意指正改变，其中改变为至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％，包括其间的所有值。

与“包括”或“含有”同义的过渡术语“包括”是包容性的或开放式的，不排除附加的、未列举的元素或方法步骤。相反，过渡短语“由……组成”排除权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分。过渡短语“基本上由......组成”将权利要求的范围限制为所要求保护的发明的特定材料或步骤“以及不会实质上影响基本和新颖特征的那些”。术语“包括”的使用考虑了“由”或“基本上由”所列举的组分组成的其他实施方式。

除非特别说明或从上下文显而易见，否则如本文所使用的，术语“或”应理解为是包括的。除非特别说明或从上下文显而易见，否则如本文所使用的，术语“一个”和“所述”应理解为单数或复数。

除非具体说明或从上下文显而易见，否则如本文所用的，术语“约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。约可以理解为在规定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％以内。

本文中变量的任何定义中的化学基团列表的列举包括该变量作为任何单个基团或所列基团的组合的定义。本文中用于一个变量或方面的一个实施方式的叙述包括作为任何单个实施方式或与任何其他实施方式或其部分组合的实施方式。本文引用的所有参考文献均通过引用并入本文。

槐糖脂的制备及衍生化

本发明提供了用于制备、衍生化和纯化槐糖脂(SLP)的材料和方法。有利地，本发明适合于纯化的SLP衍生物的工业规模制备，并且使用安全且环境友好的或“绿色”的材料和方法。

在某些实施方式中，本发明提供了阳离子SLP衍生分子，包括在附图和整个主题说明书中描述的那些。在某些实施方式中，阳离子SLP衍生分子根据本文描述的方法制备。

标准化SLP分子“底物”的制备

在优选的实施方式中，本方法最初包括制备用于产生衍生和/或纯化的SLP的标准化SLP分子“底物”。图1。在某些实施方式中，这需要在包含定制的油化学原料的浸没式发酵反应器中培养产槐糖脂的酵母以产生酵母培养物产物，所述酵母培养物产物包含发酵肉汤、酵母细胞和具有两种或更多种分子结构的混合物的SLP。

分子结构的混合物可包含例如内酯SLP、线性SLP、脱乙酰化SLP、单乙酰化SLP、二乙酰化SLP、酯化SLP、具有不同疏水链长度的SLP、具有连结的脂肪酸-氨基酸复合物的SLP和其他的SLP，包括在本公开中描述的和/或未描述的那些。

在某些实施方式中，SLP分子的混合物的分布可以通过调节发酵参数(例如原料、发酵时间和溶解氧水平)来改变。

如本文所用，“发酵”是指细胞在受控条件下的生长或培养。生长可以是需氧的或厌氧的。除非上下文另有要求，否则该短语旨在涵盖该过程的生长阶段和产物生物合成阶段。

如本文所用，“肉汤”、“培养肉汤”或“发酵肉汤”是指至少包含营养物的培养基。如果在发酵过程之后提及肉汤，则肉汤也可以包含微生物生长副产物和/或微生物细胞。

根据本发明使用的微生物生长容器可以是工业用途的任何发酵罐或培养反应器。如本文所用的，术语“反应器”、“生物反应器”、“发酵反应器”或“发酵容器”包括由一个或多个容器和/或塔或管道布置组成的发酵装置。此类反应器的示例包括但不限于连续搅拌釜反应器(CSTR)、固定细胞反应器(ICR)、滴流床反应器(TBR)、气泡柱、气升式发酵罐、静态混合器或其他容器或适用于气液接触的其他装置。在一些实施方式中，生物反应器可包括第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，当提及将底物添加至生物反应器或发酵反应时，应理解为包括在适当时添加至这些反应器中的任一个或两个。

在一个实施方式中，发酵反应器可以具有功能控制器/传感器或者可以连接至功能控制器/传感器，以测量培养过程中的重要因素，例如pH、氧气、压力、温度、搅拌器轴功率、湿度、粘度和/或微生物密度和/或代谢物浓度。

在进一步的实施方式中，容器还能够监测容器内微生物的生长(例如，细胞数量和生长阶段的测量)。可替代地，可以从容器中取出样品用于计数、纯度测量、SLP浓度和/或可见油位监测。例如，在一个实施方式中，采样可以每24小时进行一次。

根据本方法的微生物接种体优选包含所需微生物的细胞和/或繁殖体，其可以使用任何已知的发酵方法来制备。如果需要，可以将接种体与水和/或液体生长培养基预混合。

根据本发明使用的微生物可以是天然的或基因修饰的微生物。例如，微生物可以用特定基因转化以表现出特定特征。微生物也可以是所需菌株的突变体。如本文所用，“突变体”是指参照微生物的菌株、遗传变异体或亚型，其中突变体与参照微生物相比具有一种或多种遗传变异(例如，点突变、错义突变、无义突变、缺失、重复、移码突变或重复扩增)。制备突变体的程序在微生物学领域是众所周知的。例如，紫外线诱变和亚硝基胍被广泛用于此目的。

在优选的实施方式中，微生物是酵母或真菌。适合根据本发明使用的酵母和真菌种的示例包括但不限于斯塔莫属酵母和/或假丝酵母属酵母，例如熊蜂生斯塔莫酵母(假丝酵母)、蜜生假丝酵母、巴蒂斯塔假丝酵母、居花假丝酵母、riodocensis假丝酵母、星形假丝酵母和/或奎假丝酵母。在一个具体的实施方式中，微生物是熊蜂生假丝酵母，例如菌株ATCC 22214。

在某些实施方式中，培养方法利用在包含定制的油化学原料的液体生长培养基中的深层发酵。

在一种实施方式中，液体生长培养基包含一种或多种碳源。碳源可以是：碳水化合物，例如葡萄糖、右旋糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇和/或麦芽糖；有机酸，例如乙酸、富马酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、丙二酸和/或丙酮酸；醇类，例如乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、异丁醇和/或甘油；脂肪和油，例如菜籽油、马胡卡油、大豆油、米糠油、橄榄油、玉米油、葵花籽油、芝麻油和/或亚麻籽油；粉末化糖蜜等。这些碳源可以单独使用，也可以两种或多种组合使用。

在优选的实施方式中，发酵培养基包含右旋糖。在另一个优选的实施方式中，调整油化学原料以包括油酸源。在某些实施方式中，油酸含量高，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方式中，油化学原料仅包含油酸源。

油酸源的示例包括但不限于高油酸大豆油、高油酸葵花籽油、高油酸菜籽油、橄榄油、胡桃油、花生油、澳洲坚果油、葡萄籽油、芝麻油、罂粟籽油、纯油酸、马胡卡油、油酸烷基酯和/或油酸的甘油三酯。在优选的实施方式中，使用高油酸大豆油、纯油酸和/或油酸烷基酯。

有利地，在某些实施方式中，使用高油酸和/或纯油酸油化学原料产生酵母培养物产物，该酵母培养物产物包含比使用含有其他脂肪酸源的原料更窄的SLP分子结构多样性，其中产生的主要SLP分子含有C18碳链和第九个碳上的单个不饱和键。例如，在某些实施方式中，大于50％的SLP分子含有C18碳链，优选大于70％，更优选大于85％。

在一个实施方式中，液体生长培养基包含氮源。氮源可以是例如酵母提取物、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、磷酸铵、氨、尿素和/或氯化铵。这些氮源可以单独使用或以两种或多种组合使用。

在一个实施方式中，液体生长培养基中还可以包含一种或多种无机盐。无机盐可包括例如磷酸二氢钾、磷酸一钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、氯化钾、硫酸镁、氯化镁、硫酸铁、氯化铁、硫酸锰、氯化锰、硫酸锌、氯化铅、硫酸铜、氯化钙、碳酸钙、硝酸钙、硫酸镁、磷酸钠、氯化钠和/或碳酸钠。这些无机盐可以单独使用或以两种或多种组合使用。

在一种实施方式中，培养基中包含微生物的生长因子和微量营养物。培养基中还可以包含无机营养物，包括微量元素，例如铁、锌、铜、锰、钼和/或钴。此外，可以包含维生素、必需氨基酸、蛋白质和微量元素的来源，例如，玉米粉、蛋白胨、酵母提取物、马铃薯提取物、牛肉提取物、大豆提取物、香蕉皮提取物等，或以纯化形式。还可以包括氨基酸，例如可用于蛋白质生物合成的氨基酸。

该培养方法可以进一步为生长的培养物提供氧合。一个实施方式利用空气的缓慢运动来去除低含氧空气并引入富氧空气。富氧空气可以是环境空气，其通过包括用于液体的机械搅拌的叶轮和用于向液体供应气泡以将氧气溶解到液体中的空气分布器的机构每天补充。

在某些实施方式中，在发酵期间控制溶解氧(DO)水平，以缩小酵母培养物产物中产生的SLP分子的结构多样性。优选地，DO水平维持在高水平，使得例如氧转移以每小时每升等于或高于50mM、等于或高于55mM、等于或高于60mM、等于或高于65mM或等于或高于70mM的速率发生。

在一些实施方式中，培养方法还可以包括在培养过程之前和/或期间在液体培养基中添加另外的酸和/或抗菌剂。使用抗菌剂或抗生素(例如链霉素、氧四环素)来保护培养物免受污染。然而，在一些实施方式中，酵母培养物产生的代谢物提供足够的抗菌效果，以防止培养物污染。

在一个实施方式中，在反应器接种之前，液体培养基的组分可以任选地被灭菌。在一个实施方式中，液体生长培养基的灭菌可通过将液体培养基的组分置于温度约85-100℃的水中来实现。在一个实施方式中，可以通过将组分以1:3(w/v)的比例溶解在1％至3％的过氧化氢中来实现灭菌。

在一个实施方式中，用于培养的设备是无菌的。诸如反应器/容器的培养设备可以与灭菌单元(例如高压釜)分开，但连接至灭菌单元。培养设备还可以具有在开始接种之前原位灭菌的灭菌单元。垫圈、开口、管道和其他设备部件可以用例如异丙醇等喷洒。可以通过本领域已知的方法对空气进行灭菌。例如，环境空气在被引入容器之前可以穿过至少一个过滤器。在其他实施方式中，可以对培养基进行巴氏灭菌，或者可选地根本不加热，其中可以利用pH和/或低水分活度的应用来控制不需要的微生物生长。

培养物的pH应适合目标微生物。在一些实施方式中，pH为约2.0至约7.0、约3.0至约5.5、约3.25至约4.0、或约3.5。缓冲剂和pH调节剂(例如碳酸盐和磷酸盐)可用于将pH稳定在优选值附近。在某些实施方式中，使用碱溶液来将培养物的pH调节至有利的水平，例如使用15％至30％、或20％至25％的NaOH溶液。碱溶液可以包含在生长培养基中和/或可以在培养期间供应到发酵反应器中，以根据需要调节pH。

在一个实施方式中，培养方法在约5°至约100℃、约15°至约60℃、约20°至约45℃、约22°至约35℃、或约24°至约28℃下进行。在一个实施方式中，培养可以在恒温下连续进行。在另一个实施方式中，培养可以经历变化的温度。

根据本发明的方法，微生物可以在发酵系统中培养足以实现所需效果(例如产生所需量的细胞生物质或所需量的SLP)的时间段。由微生物产生的微生物生长副产物可以保留在微生物中和/或分泌到生长培养基中。生物质含量可以是例如5g/l至180g/l或更多、10g/l至150g/l、或从20g/l至100g/l。

在某些实施方式中，酵母培养物的发酵进行约40至150小时或约48至140小时或约72至130小时或约96至120小时。在某些具体实施方式中，发酵时间范围为48至72小时或96至120小时。

在一些实施方式中，一旦培养基中的右旋糖和/或油酸浓度耗尽(例如，处于0％至0.5％的水平)，发酵循环就结束。在一些实施方式中，发酵循环的结束被确定为微生物已经开始消耗痕量SLP的时间点。

在某些实施方式中，SLP分子“底物”的产生还包括酵母培养物产物中产生的SLP分子的发酵后改变。在一个实施方式中，该粗制SLP组合物被水解以产生线性SLP。在一些实施方式中，线性SLP被脱乙酰化。在一些实施方式中，线性SLP是全乙酰化的。

在一些实施方式中，该方法包括使粗制SLP经历碱性水解。例如，在一个实施方式中，可以将粗制SLP与等摩尔至1.5摩尔浓度的碱溶液(例如氢氧化钠、氢氧化钾和/或氢氧化铵的溶液)混合，以将pH调节至例如约4至11、约5至11、约6至12、或优选地约7至9。在某些实施方式中，这通过用氢氧化物盐溶液在例如75至100℃、80至95℃或85-90℃的高温下处理粗制SLP 2至24小时、3至20小时或4至16小时来实现。

根据本方法，水解过程导致内酯SLP的内酯键断裂并且其转化为粗制线性SLP。图2。在某些实施方式中，粗制线性SLP的一部分被乙酰化、二乙酰化或全乙酰化，其中该部分包含例如SLP分子总量的1％至100％、5％至75％、或10％至50％。在另一个实施方式中，单乙酰化或二乙酰化的SLP分子可以通过相同的碱性水解过程脱乙酰化。

在一些实施方式中，当观察阳离子存在于或可能存在于水解过程中时，使用阳离子交换树脂纯化粗制线性SLP。更具体地，在优选的实施方式中，使用例如蠕动泵或其他类型的泵，将粗制线性槐糖脂循环通过含有阳离子交换位点的离子交换床，持续例如15分钟至20小时、3小时至15小时、4小时至12小时或优选地30分钟至3小时的一段时间。

阳离子交换位点的量可以是例如用于碱性水解的氢氧化物盐浓度的等摩尔至1.5摩尔。

有利地，离子交换树脂提供了用于纯化SLP分子的新方法，以及用于中和反应产物的pH而不需要标准猝灭方法(这可以稀释和/或改变最终产物的化学组成)的新方法。

在优选的实施方式中，除去了旁观阳离子的线性SLP用作一种或多种衍生化和/或纯化反应的标准化底物。

通过醛柄两步生成阳离子SLP衍生物

去除观察阳离子后，可以采用两步合成方案在纯化的线性SLP(本方法的第一分离中间体)上生成反应性醛柄，然后安装天然衍生的阳离子可生物降解官能团。图3。在特定位置含有不饱和键的槐糖脂允许SLP分子的定点官能化。

步骤1-臭氧分解

在某些实施方式中，将纯化的线性SLP移至包含具有大表面积的多个空气分布器的新的洁净容器中，以进行臭氧分解。在线性SLP的臭氧分解过程中，SLP分子的烯烃部分被转化为臭氧化物，即反应性5元环。

在优选的实施方式中，用2至3vvm的100％臭氧气体使纯化的线性SLP臭氧化2至20小时、3至16小时或4至10小时。温度优选为-78℃或约-78℃。

在一种示例性实施方式中，用3vvm的100％臭氧气体使纯化的线性SLP臭氧化4小时。在其他示例性实施方式中，用2vvm的100％臭氧气体使纯化的线性SLP臭氧化16小时。

在某些实施方式中，臭氧分解后，用压缩空气在2至3vvm下使SLP-臭氧化物脱气2至20小时、3至16小时或4至10小时。

在一个示例性实施方式中，在3vvm下用压缩空气使SLP-臭氧化物脱气4小时。在另一个示例性实施方式中，在2vvm下使SLP-臭氧化物脱气16小时。

在优选的实施方式中，含有臭氧化物的SLP被还原以提供醛柄。图4。脱气后，使SLP-臭氧化物与选自例如三苯基膦、硼氢化钠、亚硫酸氢钠镁和焦亚硫酸钠的无机还原剂反应。在一个优选的实施方式中，还原剂是以与SLP-臭氧化物等摩尔浓度使用的三苯基膦。然后，优选地使线性SLP醛达到室温。

步骤2–还原胺化

在优选的实施方式中，通过醛柄生成阳离子SLP衍生物的步骤二包括线性SLP醛的还原胺化。

在某些实施方式中，还原胺化包括在还原条件下将伯胺引入到醛柄上。这会产生稳定的仲胺，其作为SLP“支架”和伯胺“货物”之间的共价连接。图5。

首先，在一些实施方式中，利用乙酸乙酯从水性混合物中提取线性SLP醛，并在约35℃至45℃的温度下在减小的压力(例如，约200至250毫巴，或约240毫巴)下进行浓缩和干燥。然后可以将干燥的粗制线性SLP醛溶解在包含四氢呋喃(THF)和/或水的反应介质中。用作反应介质的水的百分比优选不超过50％水，并且通常在0至25％之间。

对于胺化反应，将伯胺与还原剂和弱有机酸(优选乙酸)一起引入到提取的线性SLP醛中，但是也可以使用其他有机酸(例如甲酸、三氟乙酸)。

在某些实施方式中，伯胺是阳离子氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸或组氨酸。在某些实施方式中，伯胺是含有阳离子氨基酸重复段的短肽。在某些实施方式中，伯胺是含有作为间隔区的甘氨酸残基的短肽，其位于SLP支架和伯胺货物之间和/或位于阳离子氨基酸残基之间。

在某些优选的实施方式中，伯胺通过氨基酸乙酯和/或肽乙酯递送。在某些实施方式中，还原剂是氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠或硼氢化钠。

在优选的示例性实施方式中，反应利用精氨酸(Arg)的氨基酸乙酯与三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂。

在另一个示例性实施方式中，反应利用组氨酸(His)或赖氨酸(Lys)的氨基酸乙酯与三乙酰氧基硼氢化钠作为还原剂。

在进一步的示例性实施方式中，肽乙酯是Arg-Arg-Arg-Arg、Gly-Gly-Arg-Arg、Gly-Arg-Gly-Arg、Gly-Arg-Arg-Arg或其中各个残基可以从Arg、His、Lys或甘氨酸(Gly)取代的其他组合。图8-图12。在某些实施方式中，甘氨酸间隔区的添加增强了SLP衍生物的水和/或醇溶解度。在某些实施方式中，甘氨酸间隔区的添加通过例如增加脂肪酸部分的链长度来增强SLP衍生物的抗菌活性。有利地，可以增加链长度，而不需要在线性SLP底物的初始制备期间改变发酵参数。

附加的或替代的化学转化以获得含有醛官能团和仲胺的线性槐糖脂。

在某些实施方式中，利用臭氧分解的两步法的替代方法被采用，以制备含有仲胺的线性SLP醛。图13-图14。

在某些实施方式中，水解的线性SLP底物用作起始材料。在一些实施方式中，可以将保护基安装在SLP槐糖环的每个醇基上。保护基的非限制性示例包括乙酰基、三甲基甲硅烷基醚和叔丁基二苯基甲硅烷基醚，但醇保护基的许多示例对本领域技术人员来说是众所周知的。

在优选的实施方式中，不使用臭氧分解将SLP的烯烃基团转化成醛部分。相反，使用过酸试剂(Prilezhaev反应的一个示例)或四氧化锇将烯烃环氧化成环氧乙烷环。根据本方法使用的过酸试剂的示例包括但不限于间氯过氧苯甲酸、过氧乙酸和过甲酸。

然后将所得环氧化物环打开形成邻二醇。在某些实施方式中，这是在酸催化(水性)或碱催化(水性)条件下进行的。

最后，邻二醇被氧化裂解以产生醛基。邻二醇的氧化裂解可以通过适当的氧化剂(例如高碘酸钠)来完成。

在邻二醇氧化裂解后，可以通过已知用于特定基团的传统方法除去保护基(如果存在的话)。例如，可以使用氟化物离子(例如四丁基氟化铵)的水性来源除去甲硅烷基醚保护基，因为在硅和氟原子之间形成的非常强的Si-F键驱动脱保护反应完成。

在获得含有醛的线性槐糖脂后，可以通过之前和图4中概述的化学转化将其转化为前述衍生种类。

在某些实施方式中，期望的是，在进行化学转化以获得醛官能团的同时保留初始烷基链长度。这可以通过多种方式实现。

在一个实施方式中，使用内酯SLP作为起始材料，采用两步合成路线。图15。最初，内酯SLP经历碱性水解，以在将游离羧酸基团转化为甲酯的同时去除乙酰基。使用还原剂(例如DIBAL-H)可以将甲酯转化成醛官能团。在获得含有醛的线性槐糖脂后，可以通过之前和图4中概述的化学转化将其转化为前述衍生种类。

在另一实施方式中，含有醛的线性槐糖脂可通过一步直接还原内酯SLP发酵产物中存在的内酯键来制备。图16。在一定条件下，例如，用二异丁基氢化铝与叔丁基锂之间形成的络合物还原剂(ate络合物)，可以将内酯键一步直接还原成醛。除了ate络合物之外，可能的还原剂的其他示例包括但不限于三叔丁氧基氢化铝锂(TBLAH)、二异丁基-叔-丁氧基氢化铝锂(LDBBA)以及二异丁基氢化铝和正丁基锂ate络合物。在获得含有醛的线性SLP之后，可以通过之前和图4中概述的化学转化将其转化为前述衍生种类。

获得含有短链或长链酰胺官能团的衍生化SLP

在某些实施方式中，线性SLP底物可以安装有包含阳离子氨基酸官能团的酰胺，以产生长链酰胺衍生物(例如，C18)。图6。

在一些实施方式中，可以通过以下方式将线性SLP底物转化为短链酰胺(例如，C9)：首先，经由氧化裂解截短脂肪酸尾部，其次，将包含阳离子氨基酸官能团的酰胺安装到截短的酸上。图7A-图7B。

用于根据本发明的酰胺安装的偶联剂可包括例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI/HOBt)、六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基磷(PYBOP)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基胺四氟硼酸酯(TBTU)和/或N,N'-二环己基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑(DCC/HOBt)。在某些实施方式中，优选的偶联剂是EDCI/HOBt。

在某些实施方式中，可以利用类似的反应方案将如前所述的包含醛柄的线性SLP转化为长链或短链酰胺。在一些实施方式中，截短的酸(图7A)可以用作用于安装先前描述的醛柄的底物。

离子交换/纯化

在某些实施方式中，本发明的SLP衍生物的独特的阳离子性质允许阳离子离子交换树脂用于选择性纯化，例如，选择性保留阳离子种类和/或选择性去除未反应的SLP和不含有所需碳链长度或特征的SLP。因此，在某些实施方式中，本发明提供了使用阳离子离子交换树脂纯化SLP和SLP衍生物的新方法。

在某些实施方式中，还原胺化后，可使用有机溶剂(优选乙酸乙酯)经由标准液-液提取从还原胺化反应混合物中提取阳离子SLP衍生物，用pH 9.0碳酸钠缓冲液洗涤，并在减小的压力(例如，约200至250毫巴，或约240毫巴)下浓缩。然后可以将混合物重新悬浮在去离子水中，并使用阳离子交换树脂纯化。

在某些实施方式中，使用例如蠕动泵或其他类型的泵，使提取的阳离子SLP通过含有与粗制线性阳离子SLP的浓度等摩尔至1.5摩尔量的阳离子交换位点的离子交换床循环2至20小时、3至15小时或4至12小时的时间段。

在优选的实施方式中，从树脂中除去SLP阳离子衍生物是通过应用含有大浓度单价金属阳离子的电解质溶液来实现的，其中大浓度为SLP阳离子衍生物浓度的1.5至15摩尔当量或2至10摩尔当量。大浓度的单价金属阳离子胜过结合的SLP阳离子衍生物，使它们能够在树脂上交换并产生高度纯化的SLP阳离子衍生物流。

在一些实施方式中，还原胺化后，可以通过以下方法纯化阳离子SLP衍生物：将阳离子SLP衍生物与饱和氯化铵溶液搅拌，以产生搅拌混合物；通过将CH

清洁组合物

在某些实施方式中，本发明提供了如上面和附图中所述的衍生化SLP分子。

在一些实施方式中，根据本发明方法产生的衍生化阳离子SLP可以用作环境友好型或“绿色”清洁组合物中的活性成分，用于对被例如细菌、病毒、真菌、霉菌、霉、原生动物、生物膜和/或其他传染性生物体污染的材料和/或表面进行有效杀菌和/或消毒。有利地，在优选的实施方式中，所述组合物和方法至少与抗菌肽(AMP)或阳离子宿主防御肽以及其他化学和/或合成清洁制剂(例如QAC和SCA)一样有效地用于对材料和/或表面进行杀菌。

清洁组合物可以配制为例如液体、微乳液、可溶解粉末和/或颗粒、压制粉末、松散粉末、稀释喷雾剂、浓缩物、气雾剂、泡沫、胶囊化的可溶解的囊、凝胶和/或作为预润湿或水活化的布、海绵、抹布或其他基材。该清洁组合物可以用作例如马桶清洁剂、洗衣粉、餐具洗涤剂、硬表面和软表面清洁剂、水清洁剂和/或空气清洁剂。

在一些实施方式中，根据本方法生产的衍生化阳离子SLP可以用作消费品中的活性成分，用作防腐剂以防止有害生物体的破坏和/或生长，有害生物体例如为细菌、病毒、真菌、霉菌、霉、原生动物、生物膜和/或其他传染性生物体。此类消费品可包括例如清洁产品(例如消毒剂、通用清洁剂、玻璃清洁剂、洗衣粉和洗洁精)、家庭护理产品(例如地板抛光剂、空气清新剂)、个人护理产品(例如皮肤护理产品、护发产品)、化妆品(例如粉底、指甲油)、绘画用品和建筑材料(例如颜料、漆、底漆、腻子、干式墙、防水填料)，以及在一些实施方式中的健康、食品和饮料产品。

有利的是，本发明的使用不会对使用者造成伤害，并且不会向环境中释放大量的污染和有毒化合物。另外，该组合物和方法利用可生物降解且毒理学安全的组分。因此，本发明可作为“绿色”消毒剂用于多种行业。

在某些实施方式中，清洁组合物包含0.1至10wt％、0.1至9.0wt％、0.1至8.0wt％、0.1至7.0wt％、0.1至6.0wt％、0.1至5.0wt％、0.1至4.0wt％、0.1至3.0wt％、0.1至2.0wt％、1.0至9.0wt％、1.0至5.0wt％、1.0至3.0wt％、3.0至10wt％、3.0至7.0wt％、5.0至10wt％、5.0至9.0wt％、6.0至10wt％、7.0至10wt％和8.0至10wt％的阳离子衍生化SLP。在某些实施方式中，阳离子衍生化SLP以约1ppm至约200ppm、或约2ppm至约250ppm、或约5ppm至约300ppm、或约10ppm至约350ppm、或约25ppm至约400ppm、或约50ppm至约450ppm、或约75ppm至约500ppm、或约100ppm至约600ppm、或约125ppm至约750ppm、或约150ppm至约1000ppm存在于组合物中。

在一个具体的实施方式中，阳离子衍生化SLP以清洁组合物的50至500ppm的浓度存在。

在某些实施方式中，根据本发明的SLP分子具有有利的胶束尺寸。例如，在一些实施方式中，槐糖脂分子将形成尺寸小于500nm、小于100nm、小于50nm、小于25nm、小于15nm或小于10nm的胶束。胶束的尺寸和两亲特性允许对孔的增强渗透，从而可以与其中的杂质进行更大的接触。

在某些实施方式中，清洁组合物的pH范围为2.0至11.0、2.5至10、3.0至9.0、3.0至8.0，或优选地4.0至7.0。在某些实施方式中，单阳离子SLP衍生物在3.0至7.0之间的pH下最稳定。在某些其他实施方式中，多阳离子SLP衍生物在3.0至8.0之间的pH下最稳定。可以使用已知的pH调节剂以将pH保持在合适的水平，包括例如乙酸、乳酸和/或柠檬酸。

任选地，清洁组合物还可以包含一种或多种其他组分，包括例如：载体(例如水)、其他生物表面活性剂、其他表面活性剂(例如聚烷基葡糖苷(如癸酰基葡糖苷和月桂基葡糖苷)、氧化胺)、亲水性和/或疏水性连接剂、多价螯合剂、助洗剂(例如，碳酸钾、氢氧化钠、甘油、柠檬酸、乳酸)、溶剂(例如，水、乙醇、甲醇、异丙醇)、有机酸和/或无机酸(例如，乳酸、柠檬酸、乙酸、硼酸)、精油、植物提取物、交联剂、螯合剂(例如柠檬酸钾、柠檬酸钠、葡萄糖酸钠、柠檬酸)、脂肪酸、醇、还原剂、氧化剂、钙盐、碳酸盐、缓冲剂、酶、染料、着色剂、香料(例如，d-柠檬烯、百里酚、柠檬醛、薰衣草香油精)、防腐剂(例如，辛基异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮)、萜烯(例如，d-柠檬烯)、倍半萜类化合物、萜类化合物、乳化剂、破乳剂、发泡剂、消泡剂、漂白剂、聚合物、增稠剂和/或增粘剂(例如黄原胶、瓜尔胶)。

在示例性实施方式中，清洁组合物可包含作为二醇溶剂(例如甘油、丙二醇和/或丁二醇)中的溶液(1-50％)进行配制或递送的根据本发明的阳离子SLP衍生物。在某些实施方式中，该示例性制剂或递送物还可包含相对于活性抗菌剂高达5％的一种或多种酸，例如乙酸、乳酸和/或柠檬酸。

在一些实施方式中，组合物包含附加的和/或其他生物表面活性剂。根据本发明的附加的生物表面活性剂可以包括例如糖脂、脂肽、黄脂、磷脂、脂肪酸酯和高分子量生物聚合物(例如脂蛋白、脂多糖-蛋白质复合物和/或多糖-蛋白质-脂肪酸复合物)。

在一个实施方式中，附加的和/或其他生物表面活性剂是糖脂类，例如，鼠李糖脂(RLP)、纤维二糖脂质、海藻糖脂质和/或甘露糖赤藓糖醇脂质(MEL)。也可以使用天然(或非衍生化)SLP。在一个实施方式中，生物表面活性剂是脂肽，例如，表面活性素、伊枯草菌素、丰原素、节活性素(arthrofactin)、两性霉素、粘液菌素、地衣素、类芽孢杆菌素、多粘菌素和/或battacin。在一个实施方式中，生物表面活性剂是另一种类型的两亲性分子，例如，酯化脂肪酸、皂苷、心磷脂、普鲁兰多糖、乳化剂、利普曼(lipomanan)、阿拉桑(alasan)和/或甲壳素(liposan)。

在一个实施方式中，生物表面活性剂是生物表面活性剂醇酯，例如内酯槐糖脂乙酯、内酯槐糖脂甲酯、内酯槐糖脂异丙酯、内酯槐糖脂丁酯、线性槐糖脂乙酯、线性槐糖脂甲酯、线性槐糖脂异丙酯或线性槐糖脂丁酯。

在一个实施方式中，生物表面活性剂是金属-生物表面活性剂复合物，其中将抗菌金属(例如银)添加到生物表面活性剂分子中。在某些实施方式中，复合物是银-槐糖脂复合物。

在一个实施方式中，生物表面活性剂是由例如解淀粉芽孢杆菌NRRL B-67928或枯草芽孢杆菌NRRL B-68031产生的脂肽生物表面活性剂(例如表面活性素、伊枯草菌素、丰原素和/或地衣素)的混合物。在某些实施方式中，脂肽混合物包含大于50％表面活性素。

对材料进行杀菌和/或消毒的方法

在优选的实施方式中，本发明提供了对其中或其上具有有害微生物的材料(包括流体，例如空气和/或水)和/或表面进行杀菌和/或消毒的方法，其中该方法包括向材料和/或表面施加根据本发明制备的清洁组合物，使得组合物与有害微生物接触。有利地，该方法可在人类、植物和动物存在下安全地用于家庭、商业和工业环境。

有利地，该方法可用于对广谱的有害微生物进行杀菌和/或消毒，所述广谱有害微生物包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、生物膜、病毒、真菌、霉菌、原生动物、寄生虫、藻类以及其他感染性生物体(例如蠕虫和线虫)。在某些具体实施方式中，该方法可用于对在其上具有大肠杆菌、葡萄球菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属和/或梭菌属的材料和/或表面进行杀菌。

清洁组合物可被施用于例如工作台面、桌子、地板、卫生间、衣服、纺织物、塑料盘、陶瓷盘、水槽、浴缸、玩具、门把手、地毯、垫子、玻璃、窗户、医疗装置或植入物、或流体(例如空气或水)。

可通过使用例如喷雾瓶或加压喷雾装置的喷雾将清洁组合物直接施加至材料和/或表面，或以其他方式将组合物从容器倾倒或挤压到材料和/或表面之上或其中。还可以使用海绵、布、抹布或刷子来施加清洁组合物，其中将组合物摩擦、散布或刷到材料和/或表面上。此外，清洁组合物可通过洗衣机或洗碗机施用。更进一步，清洁组合物可以作为气雾剂施用。

清洁组合物可独立于吸收剂和/或吸附材料使用，或与吸收剂和/或吸附材料结合使用。例如，清洁组合物可配制为与清洁擦拭物、海绵(纤维素、合成的等)、纸巾、餐巾纸、布、毛巾、抹布、拖把头、胶绵拖把和/或包括吸收剂和/或吸附材料的其他清洁装置结合使用。清洁组合物可预加载到吸收剂和/或吸附材料上，在使用过程中被材料后吸收和/或后吸附，和/或与吸收剂和/或吸附材料分开使用。

其上可加载有改进的清洁组合物的清洁擦拭物可由吸收/吸附材料制成。通常，清洁擦拭物具有至少一层非织造材料。可以使用的市售清洁擦拭物的非限制性示例包括DuPont 8838、Dexter ZA、Dexter 10180、Dexter M10201、Dexter 8589、Ft.James 836和Concert STD60LN。所有这些清洁擦拭物均含有聚酯和木浆的混合物。Dexter M10201还包含人造丝(一种木浆衍生物)。清洁组合物在清洁擦拭物上的负载比可为约2-5:1，或约3-4:1。以多种制造方法将清洁组合物加载到清洁擦拭物上。通常，将清洁擦拭物在清洁组合物中浸泡一段时间，直至达到所需的加载量。装载有改进的清洁组合物的清洁擦拭物提供了优异的清洁，并且很少或没有条痕/成膜。

在一个实施方式中，使清洁组合物在材料和/或表面之上或之中浸泡足够的时间，以实现杀菌和/或消毒。例如，浸泡可进行5秒至10分钟，或10秒至5分钟，或30秒至2分钟。优选地，为了实现杀菌和/或消毒，所需的最小暴露时间小于60秒，更优选小于30秒。

在一个实施方式中，可以使用搅拌来施加清洁组合物。这可以是机械的(例如在洗衣机或洗碗机中)或者是手动的(例如通过用布、擦拭物、海绵或刷子擦洗)。

在一个实施方式中，该方法还包括从材料和/或表面去除清洁组合物和有害微生物的步骤。这可以通过例如冲洗表面或喷水到表面上和/或用布、擦拭物、海绵或刷子摩擦或擦拭表面直至清洁组合物和微生物已从材料和/或表面清除。可以在摩擦或擦拭表面之前、期间和/或之后进行冲洗或喷水。

在一些实施方式中，提供了用于防止消费品变质或污染的方法，其中根据本发明的衍生化SLP作为防腐剂成分与消费品一起施用、被施加至消费品、或与消费品一起配制。消费品可以是例如清洁产品、家庭护理产品、个人护理产品、化妆品、绘画用品和/或建筑材料，并且在一些实施方式中可以是健康、食品和饮料产品。

用于杀菌和/或保存的目标微生物

有利地，该方法可用于对广谱的有害生物体和/或微生物进行杀菌、消毒和/或保护不受其影响(即，防止被其污染)，广谱的有害生物体和/或微生物包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、生物膜、病毒、真菌、霉菌、霉、原生动物、线虫、寄生虫、藻类和/或其他传染性生物体。例如，在某些具体实施方式中，该方法可用于对其中或其上具有有害细菌的材料和/或表面进行杀菌，该有害细菌例如为以下菌属的菌株：芽孢杆菌属、脂环酸芽孢杆菌属、地芽孢杆菌属、乳杆菌属、变形杆菌属、沙雷氏菌属、克雷伯氏菌属、肥大杆菌属、弯曲菌属、梭菌属、棒状杆菌属、欧文氏菌属、沙门氏菌属、葡萄球菌属、志贺氏菌属、耶尔森氏菌属、莫拉氏菌属、发光杆菌属、热厌氧杆菌属、脱硫肠状菌属、片球菌属、明串珠菌属、酒球菌属、不动杆菌属、明串珠菌属、嗜冷杆菌属、假单胞菌属、产碱杆菌属、沙雷氏菌属、微球菌属、分枝杆菌属、黄杆菌属、变形杆菌属、肠杆菌属、链球菌属、黄单胞菌属、李斯特菌属、希瓦氏菌属、埃希氏菌属、肠球菌和/或弧菌。

特定的细菌包括，例如，产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、艰难梭菌、金黄色葡萄球菌(包括MRSA)、咽炎链球菌、肺炎链球菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、野油菜黄单胞菌、单核细胞增多性李斯特菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、腐败希瓦氏菌、耐万古霉素肠球菌、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和/或鲍曼不动杆菌。

在某些实施方式中，清洁组合物可具有针对病毒、真菌、霉菌和寄生虫的杀菌和/或消毒能力，病毒例如轮状病毒、甲型、乙型和丙型肝炎、柯萨奇病毒、鼻病毒、感冒病毒、流感病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒和脊髓灰质炎病毒；

真菌，例如，接合酵母属、汉逊德巴利酵母、假丝酵母属、德克酵母属/酒香酵母属、雷公根叶斑病菌、黑附球菌、sebi节担菌、隐球菌属、红色毛癣菌、须毛癣菌、絮状表皮癣菌；

霉菌，例如，链格孢属、曲霉属、丝衣霉属、葡萄孢属、枝孢属、镰刀菌属、地霉属、红曲霉属、念珠菌属、被孢霉属、毛霉属、脉孢菌属、粉孢属、卵孢霉属、青霉菌属；和

寄生虫，例如，绦虫、蠕虫、线虫、弓形虫、旋毛虫、兰伯氏贾第虫、溶组织内阿米巴和隐孢子虫。