一种聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶的制备方法及应用

技术领域

本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶的制备方法及应用。

背景技术

光热消融是一种新兴的肿瘤原位治疗方法，其原理是利用近红外光照射肿瘤区域富集的光敏剂，进而产生局部高温杀伤肿瘤细胞。聚吡咯光热纳米酶因其良好的生物相容性、优异的光稳定性以及良好的光热转换效应，在肿瘤光热治疗领域备受关注。它在近红外光照射下可产生足够的热量来杀死肿瘤细胞并诱导抗肿瘤免疫，起到治疗作用。然而，由于肿瘤内部的乏氧微环境，光热纳米酶不能有效的发挥光热消融作用杀伤肿瘤细胞，进而显著降低了的治疗效果，同时，无法精确控制光热消融的强弱，在临床转化中面临挑战。因此，研发可改善肿瘤乏氧微环境进而增强肿瘤光热消融技术的光热纳米材料对于提升治疗效果尤为必要。

普鲁士蓝光热纳米酶具有良好的生物相容性和独特的性能，引起了广泛的生物医学研究者的关注。已有研究证明，普鲁士蓝光热纳米酶基于其固有的生物活性和成像能力可作为治疗药物，可清除体内多余的活性氧(ROS)以治疗ROS相关疾病，并通过过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)等酶催化活性将过氧化氢分解为氧气以改善肿瘤微环境的乏氧状态。如能将光热消融与酶相结合，势必能改善肿瘤乏氧微环境进而增强肿瘤光热疗效。

然而，目前缺乏将光热消融和酶相结合的技术，因此，亟需寻求为临床实体肿瘤提供高效的可调节增强肿瘤光热消融手段的技术。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶的制备方法，制得的光热纳米酶具有光热和酶催化活性双功能，应用于肿瘤的光热治疗时，能分解过氧化氢产生氧气以改善肿瘤乏氧微环境，并能增强肿瘤光热疗效。

为达到上述技术目的，本发明采用技术方案如下：

一种聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)将聚乙烯吡咯烷酮加入到去离子水中，搅拌至完全溶解，得到聚乙烯吡咯烷酮溶液；

(2)往聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入吡咯(PY)和亚铁氰化钾(K

(3)将反应液离心，去除沉淀后，得到上清液，将上清液透析后真空冷冻干燥，即得聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶(PPY@PB NEs)。

步骤(2)中，所述吡咯与亚铁氰化钾的摩尔比为(1～15):(1～15)。

进一步，步骤(1)中，所述聚乙烯吡咯烷酮溶液的浓度为5～20mg/mL，更优选为10mg/mL。

进一步，步骤(2)中，所述六水合三氯化铁的用量占吡咯与亚铁氰化钾总质量的25-40％。

进一步，步骤(3)中，所述离心条件为：3000rpm，离心15min。

进一步，步骤(3)中，所述透析采用的是100000MWCO的透析袋，透析时间为72h。

进一步，步骤(3)中，所述冷冻干燥的温度为-80℃，时间为48h。

上述方法制备的聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶在制备肿瘤的光热治疗药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了一种聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶的制备方法，该光热纳米酶(PPY@PB NEs)由基于聚吡咯光热纳米酶(PPYNEs)与普鲁士蓝光热纳米酶(PB NEs)通过铁离子一步催化合成，制备方法简单，设备要求较低，反应条件温和，绿色环保，适合大规模工业生产，制备的光热纳米酶(PPY@PB NEs)具有良好的光热性能。在近红外光的照射下，PPY@PB NEs具有良好光热消融效果，可显著抑制肿瘤细胞的生长，制备的PPY@PB NEs还具有较好的产氧性能，可以分解过氧化氢产生氧气，进而改善肿瘤乏氧微环境，增强肿瘤的原位热消融治疗效果。

附图说明

图1为实施例1制备的聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶的透射电镜图；

图2为实施例1-5制备的聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶的粒径图；

图3为实施例1-5制备的聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶的紫外-可见吸收光谱；

图4为实施例1-5制备的聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶的光热性能测试结果；

图5为实施例1制备的聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶在不同条件下的光热性能测试结果；

图6为实施例1制备的聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶的产氧能力测试结果；

图7为实施例1制备的聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶的血液相容性测试结果；

图8为实施例1制备的聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶的生物安全性测试结果；

图9为实施例1制备的聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶对肿瘤细胞的杀伤能力测试结果。

具体实施方式

以下结合实施例、附图和具体实施例对本发明的技术方案作详细说明。这些实施例仅用于进一步说明本发明而不用于限制本发明范围。

实施例1

一种聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)将0.1g聚乙烯吡咯烷酮加入到10mL去离子水中，搅拌至完全溶解，得到聚乙烯吡咯烷酮溶液；

(2)往聚乙烯吡咯烷酮溶液中加入1mmol(69.2μL)吡咯(PY)和0.1333mmol(49.11mg)亚铁氰化钾(K

(3)将反应液3000rpm离心15min，去除沉淀后，得到上清液，将上清液采用100000MWCO的透析袋透析72h后，-80℃下真空冷冻干燥48h，得到蓝黑色粉末，即为聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶(PPY@PB NEs)。

实施例2

步骤(2)中，吡咯用量为2mmol，亚铁氰化钾用量为0.1333mmol。其余与实施例1相同。

实施例3

步骤(2)中，吡咯用量为1mmol，亚铁氰化钾用量为1mmol。其余与实施例1相同。

实施例4

步骤(2)中，吡咯用量为0.1333mmol，亚铁氰化钾用量为1mmol。其余与实施例1相同。

实施例5

步骤(2)中，吡咯用量为0.1333mmol，亚铁氰化钾用量为2mmol。其余与实施例1相同。

对比例1

制备聚吡咯光热纳米酶(PPYNEs)：

步骤(2)中，不加入亚铁氰化钾(K

对比例2

制备普鲁士蓝光热纳米酶(PB NEs)：

步骤(2)中，不加入吡咯，其余与实施例1相同。

图1为实施例1制备的聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶的透射电镜图，图片显示，PPY@PB NEs的外观为圆形。

图2为实施例1-5制备的聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶的粒径图，可以看出，本发明实施例制备的PPY@PB NEs光热纳米酶的粒径大小呈正态分布，尺寸合适，具有良好的被动靶向肿瘤组织的能力。在各实施例不同的制备比例中，随着吡咯加入量的增大，纳米酶的粒径也会随之增大。

图3为实施例1-5制备的聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶的紫外-可见吸收光谱，可以看出，本发明实施例制备的PPY@PB NEs光热纳米酶在700nm处均有明显的特征吸收峰，并且吸收峰的强弱与亚铁氰化钾的加入量成正相关，这是PB的特征吸收峰，证明PB被成功杂合进光热纳米酶中。

1.测试实施例1-5制备的聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶的光热性能

测试方法：将试实施例1-5制备的聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶分别配制成500μg/mL的水溶液，以去离子水作为对照组。使用功率密度为3.0W/cm

测试结果见图4，可以看出，PPY@PB NEs的光热性能主要受吡咯加入量的影响，吡咯的加入量越大，纳米颗粒的光热性能越强，去离子水对照组温度在整个过程中无明显变化。

2.测试聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶在不同条件下的光热性能

测试方法：(1)将实施例1制备的PPY@PB NEs分别配制成100、300、500μg/mL的水溶液，以去离子水作为对照组。设定808nm激光器的功率密度为1.0W/cm

(2)将实施例1制备的PPY@PB NEs配制成500μg/mL的水溶液，以去离子水作为对照组。分别使用功率密度为1.0、2.0、3.0W/cm

测试结果见图5，其中图5A为PPY@PB NEs在不同浓度下的光热性能，图5B为PPY@PBNEs在不同激光功率密度下的光热性能，可以看出，PPY@PB NEs在受到808nm激光(1.0W/cm

3.检测实施例1制备的聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶PPY@PB NEs、对比例1制备的PPYNEs、对比例2制备的PB NEs的产氧能力。

测试方法：将PPY@PB NEs、PPYNEs、PB NEs分别配制成500μg/mL的水溶液，各取1mL，分别加入200uLH

测试结果见图6，可以看出，PPYNEs组和去离子水组中的氧气含量没有明显变化，PB NEs和PPY@PB NEs中氧气含量明显增高，说明PPY@PB NEs具有分解H

4.检测聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶的血液相容性

测试方法：将实施例1制备的PPY@PB NEs分别配制成25、50、100、200μg/mL的水溶液，作为实验组样品，分别以去离子水和PBS分别作为阳性和阴性对照，然后将不同浓度(25、50、100、200μg/mL)的PPY@PB NEs水溶液以及对照组样品分别与10％小鼠红细胞悬液共孵育2h后离心，检测上清液在541nm处(血红蛋白特征吸紫外吸收峰)的吸光度，通过吸光度比值计算每组样品的溶血率，以此判断纳米颗粒的血液相容性。

结果如图7所示，分别以去离子水和PBS分别作为阳性和阴性对照。经过计算，当PPY@PB NEs最高浓度达到200μg/mL时，溶血率小于5％，表明PPY@PB NEs具有良好的血液相容性。

5.检测聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶的生物安全性

测试方法：将实施例1制备的PPY@PB NEs分别配制成50、100、200、400、800μg/mL的水溶液，将不同浓度(50、100、200、400、800μg/mL)的PPY@PB NEs溶液分别与MEF(SCRC-1040,ATCC)和4T1细胞(CRL-2539,ATCC)共孵育24h后，使用CCK-8法检测细胞活力。

测试结果如图8所示，可以看出，不同浓度的PPY@PB NEs对MEF和4T1细胞均无明显毒性，各组细胞活性均保持在85％以上。说明PPY@PB NEs在此浓度范围内对细胞无明显损伤。

6.检测聚吡咯-普鲁士蓝杂化光热纳米酶对肿瘤细胞的杀伤能力

测试方法：将实施例1制备的PPY@PB NEs分别配制成25、50、100、200、400μg/mL的水溶液，将不同浓度(25、50、100、200、400μg/mL)的PPY@PB NEs与4T1细胞(CRL-2539,ATCC)共孵育2h后，使用808nm近红外光照射。通过检测细胞活性研究PPY@PB NEs的光热杀伤效果。

结果如图9所示，可以看出，随着PPY@PB NEs的浓度升高，4T1细胞活性逐渐下降。当纳米颗粒浓度达到400μg/mL时，4T1细胞活性仅为15％。结果证明PPY@PB NEs对肿瘤细胞具有良好的光热杀伤能力，可显著抑制肿瘤细胞的生长。

虽然，上述内容已经在一般性说明和具体实施方案中对本发明作了详尽的描述，但对本领域技术人员来说，在本发明基础上，仍然有修改的空间。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的所有简单的变形、修改或者能够不花费创造性劳动的替换均属于本发明的保护范围。