修饰的血浆凝血因子VIII及其使用方法
文献发布时间：2024-04-18 19:58:26
技术领域
本申请主要涉及医疗，特别是涉及修饰的血浆凝血因子VIII多肽及其在治疗甲型血友病中的应用。
背景技术
甲型血友病是一种X连锁的隐性疾病，由功能性血浆凝血因子VIII(hFVIII)缺乏引起。在甲型血友病患者中，血液不能正常凝结，导致受伤时出血过多。出血表型通常与残余因子(residual factor)活性有关：患有严重疾病(因子活性<1％正常)的人有频繁的自发性出血；患有中度疾病(因子活性为1％-5％正常)的人很少有自发性出血，但轻微创伤时会出血；含有轻度疾病(因子活性为5％-40％正常)的人在介入性手术或创伤时会出血。
目前治疗严重甲型血友病(因子VIII活性<1％)需要定期静脉输注重组因子VIII(rFVIII)或血浆浓缩因子VIII。中度和轻度甲型血友病的个体可根据需要进行治疗，无需定期预防方案。输注治疗是昂贵的，并引入传染病风险。rFVIII疗法由于生产、纯化和配制的费用而被证明是昂贵的。rFVIII治疗仍然需要静脉内给药，因为其他给药途径的生物利用度有限。rFVIII的成本和有限的利用度阻碍了该治疗策略的普遍实施。
基因治疗为输注治疗提供了一种替代方案。然而，目前的基因疗法需要高剂量的病毒载体，这增加了与治疗相关的费用。然而，实施基因治疗技术的困难包括载体毒性和因子VIII表达水平不足。
因此，对FVIII进行生物工程改造以提高凝血活性，表现为如分泌增加、比活性增加或两者兼有，这将显著提高细胞培养生产或转基因动物中rFVIII的产量，并增加甲型血友病的基因治疗策略的成功潜力。因此，需要能够有效表达足够量的hFVIII蛋白以增加FVIII的产量或将病毒载体的所需剂量降低到可耐受水平的改进的载体和构建体。
发明内容
本申请的一个方面涉及与野生型hFVIII多肽或参考多肽相比含有一个或多个突变的修饰hFVIII多肽(mhFVIII)。
在一些实施方式中，所述mhFVIII在位置A20、T21、F57、L69、I80、L178、R199、H212、I215、R269、I310、L318、S332、R378、I610和/或I661位置处包含一个或多个氨基酸取代。
在一些实施方式中，所述mhFVIII包含选自表1中列出的氨基酸取代中的一个或多个氨基酸取代。
在一些实施方式中，所述mhFVIII在选自A20K、T21I、T21V、F57L、L69V、I80V、L178F、R199K、H212Q、I215V、R269K、I310V、L318F、S332P、R378S、I610M和I661V中的位置处包含一个或多个氨基酸取代。在一些实施方式中，所述mhFVIII包含单个氨基酸取代。
在一些实施方式中，所述mhFVIII在氨基酸A20K和T21I中的每一个中包含氨基酸取代。
在一些实施方式中，所述mhFVIII包含氨基酸取代A20K和T21V。
在一些实施方式中，所述mhFVIII包含氨基酸取代T21I、L69V和I80V。
在一些实施方式中，所述mhFVIII包含氨基酸取代T21I、L69V、I80和L178F。
在一些实施方式中，所述mhFVIII包含氨基酸取代T21I、L69V、I80V和I661V。
在一些实施方式中，所述mhFVIII包含氨基酸取代T21I、L69V、I80、L178F和I661V。
在一些实施方式中，所述mhFVIII包含氨基酸取代R199K、H212Q、I215V、R269K、I310V、L318F和S332P。
在一些实施方式中，所述mhFVIII包含氨基酸取代T21I、L69V、I80V、L178F、H212Q、I215V、R269K、L318F和I661V。
在一些实施方式中，所述mhFVIII包含氨基酸取代A20K、T21V、L69V、I80V、L178F、H212Q、I215V、R269K、L318F和I661V。
在一些实施方式中，所述mhFVIII包含氨基酸取代T21I、L69V、I80V、L178F、R199K、H212Q、I215V、R269K、I310V、L318F、S332P和I661V。
在一些实施方式中，所述mhFVIII包含氨基酸取代A20K、T21V、L69V、I80V、L178F、R199K、H212Q、I215V、R269K、I310V、L318F、S332P和I661V。
在一些实施方式中，所述mhFVIII由包含hFVIII的A1、A2、A3、C1和C2结构域的单个多肽组成。
在一些实施方式中，所述mhFVIII由单个多肽组成，所述单个多肽包含：(1)hFVIII的A1、A2、A3、C1和C2结构域；和(2)hFVIII的截短的B结构域。
在一些实施方式中，所述mhFVIII由包含hFVIII的所述A1和A2结构域的重链多肽和包含hFVIII的所述A3、C1和C2结构域的轻链多肽组成。在一些实施方式中，所述重链多肽进一步包含hFVIII的截短的B结构域和包含hFVIII的所述A3、C1和C2结构域的轻链多肽。
在一些实施方式中，所述mhFVIII包含人FVIII的重链和来自不同物种的FVIII的轻链，例如犬FVIII的轻型链。
本申请的另一个方面涉及编码本申请的所述mhFVIII的分离的多核苷酸。
本申请的另一个方面涉及一种表达盒，所述表达盒包含：本申请的所述多核苷酸；和与所述多核苷酸可操作地连接的调控序列。
本申请的另一个方面涉及包含本申请的所述多核苷酸的表达载体。在一些实施方式中，所述表达载体是质粒。在一些实施方式中，所述表达载体是病毒载体。在一些实施方式中，所述表达载体是AAV载体。
本申请的另一个方面涉及包含本申请的所述表达载体的宿主细胞。
本申请的另一个方面涉及包含本申请的所述mhFVIII和药学上可接受的载体的药物组合物。
本申请的另一个方面涉及包含本申请的所述表达载体和药学上可接受的载体的药物组合物。
本申请的另一个方面涉及一种治疗患有因子VIII缺乏症的受试者的方法。所述方法包括向所述受试者施用有效量的本申请的所述mhFVIII、所述表达载体或所述宿主细胞的步骤。
本申请的另一个方面涉及重组AAV载体，所述重组AAV载体包含编码mhFVIII的核苷酸，其中所述mhFVIII在选自A20K、T21I、T21V、F57L、L69V、I80V、L178F、R199K、H212Q、I215V、R269K、I310V、L318F、S332P、R378S、I610M和I661V的位置处包含一个或多个氨基酸取代，并且其中所述AAV载体能够在宿主细胞中表达所述mhFVIII。在一些实施方式中，所述mhFVIII包含hFVIII的截短的B结构域。
本申请的另一个方面涉及一种表达mhFVIII的方法。所述方法包括以下步骤：(a)将表达载体导入宿主细胞，所述表达载体包含：多核苷酸，所述多核苷酸包含编码信号肽的核苷酸序列和编码所述mhFVIII的核苷酸序列，其中所述mhFVIII在选自A20K、T21I、T21V、F57L、L69V、I80V、L178F、R199K、H212Q、I215V、R269K、I310V、L318F、S332P、R378S、I610M和I661V的位置处包含一个或多个氨基酸取代；以及与所述多核苷酸操作性连接的调控序列；(b)让所述宿主细胞在适合所述mhFVIII表达和分泌的条件下生长；(c)从所述宿主细胞收获培养基，和(d)从所收获的培养基纯化出所述mhFVIII。
附图说明
图1显示了编码在B结构域(hBDDF8)中存在缺失的野生型人FVIII的表达质粒(pANG-CAG-hBDDF8)。所述hBDDF8编码序列(包括重链和轻链)受CAG启动子调控，所述CAG启动子用于检测根据本申请的各种修饰的hBDDF8-蛋白(也称为“突变体hFVIII”或“hFVIII突变体”)的功能活性。
图2显示了hBDDF8重链(hBDDF8-HC)和在16个氨基酸位置含有17个取代突变的用于分析hFVIII突变体活性的修饰hBDDF8重链(qwBDDF8-HC)之间的比对。在图3和实施例1中进一步描述了包含其各种单、双和多个取代的其他构建体。对这些突变体的相对功能活性的进一步分析显示在图4-9中，如下所述。
图3总结了hBDDF8-HC中用于分析hFVIII功能活性的示例性取代突变体。
图4显示了在HuH7细胞中单个氨基酸取代的hFVIII突变体(即修饰的hBDDF8蛋白)的相对功能活性(与hFVIII(即未修饰的hBDDF8蛋白)的功能活性相比)。
图5显示了在HEK 293T细胞中单个氨基酸取代的hFVIII突变体(即修饰的hBDDF8蛋白)的相对功能活性(与hFVIII(即未修饰的hBDDF8蛋白)的功能活性相比)。
图6显示了在HEK 293T细胞中hFVIII重链的氨基酸21中的特定单氨基酸取代突变(即在氨基酸位置21处修饰的hBDDF8蛋白)的相对功能活性(与hFVIII(即未修饰的hBDDF8蛋白)的功能活性相比)。
图7显示了在HEK 293T细胞中含有T21I与hFVIII重链的氨基酸20中的各种取代(即在氨基酸位置21修饰的hBDDF8蛋白)的组合的双氨基酸取代的相对功能活性(各自相比，以及与未修饰的hBDDF8蛋白和单氨基酸取代突变体T21I相比)。
图8显示了在Huh7细胞中具有单个或多个突变(如所示的那样)的各种hFVIII-HC突变体在转染后24小时或48小时的功能活性(与pANG-CAG-hBDDF8中的所述hBDDF8 cDNA相比)。
图9显示了在HEK 293T细胞中各种hFVIII-HC突变体(包括具有单个和多个突变(如所示的那样)的那些突变体)在转染后24小时、48小时和72小时的功能活性(与hFVIII(即未修饰的hBDDF8蛋白)的功能活性相比)。
图10显示了在CHO细胞中各种hFVIII-HC突变体(包括具有单个或多个突变(如所示的那样)的那些突变体)在转染后24小时或48小时的功能活性(与hFVIII(即未修饰的hBDDF8蛋白)的功能活性相比)。
图11A显示了所选择的hFVIII突变体(和野生型)和人/犬杂合FVIII突变体的结构域。图11B显示了在HEK 293T细胞中图11A中的无B结构域hFVIII突变体(和野生型)和人/犬杂合FVIII突变体在转染后48小时的功能活性(与hFVIII(即未修饰的hBDDF8蛋白)的功能活性相比)。
图12显示了表达质粒(pANG-TTR-hBDDF8)，其类似于图1中的表达质粒，不同之处在于CAG启动子被TTR启动子取代。
图13显示了在Huh7细胞中表达的来自rAAV2载体的各种mhFVIII构建体和hBDDF8在转染后72小时的功能活性。
具体实施方式
I.定义
与本申请的生物分子有关的各种术语在上文中和贯穿说明书和权利要求使用。
短语“活性增强的FVIII(actFVIII或actF8)”是指修饰hFVIII(hF8)，其经遗传工程改变使得与未修饰的野生型hFVIII相比，所编码的蛋白表现出至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的活性增加。未修饰的野生型hFVIII的核苷酸序列列于SEQ ID NO:1中，其包含编码19个氨基酸(MQIELSCFFLCLLRFCFS(SEQ ID NO:2))的信号肽的核苷酸序列。包含信号肽的未修饰野生型hFVIII的氨基酸序列列于SEQ ID NO:3中。没有信号肽的未修饰野生型hFVIII的氨基酸序列列于SEQ ID NO:4中。
术语“hBDDF8蛋白”、“hBDDF8多肽”或“hBDDF8”是指在B结构域中有缺失的野生型hFVIII蛋白。在一些实施方式中，所述缺失涵盖大部分B结构域，包括对野生型B结构域内的多个切割响应的序列。示例性hBDDF8多肽具有SEQ ID NO:5(具有信号肽)或SEQ ID NO:6(没有信号肽)中所示的氨基酸序列，其包含hFVIII重链(SEQ ID NO:7)、截短的B结构域(SEQ ID NO:8)和轻链(SEQ ID NO:9)。
后面跟着元素或物种列表的短语“一个或多个”旨在涵盖列表中元素或物种的任何排列。因此，例如，短语“选自A、B、C、D、E和F中的一个或多个取代突变”可以包括含有A、B，C、D，E和/或F的取代突变的任何组合。
如本文所用，范围可以表示为从一个特定整数值到另一个特定的整数值。当表达这样的范围时，应当理解，该范围内的任何和所有整数值限定了根据本申请的不同的实施方式，并且实施方式的完整范围包括在该范围内，并且该范围进一步包括初始范围内的任意整数值对之间的任何和全部子范围。
关于本申请的核酸，术语“分离的核酸”，当应用于DNA时，是指，从其来源的生物体的天然存在的基因组中与其直接相邻的序列(在5'和3'方向上)分离下来的DNA分子。例如，“分离的核酸”可以包括插入载体(如质粒或病毒载体)中或者整合到原核生物或真核生物的DNA中的DNA或cDNA分子。可以优化核酸密码子以增强哺乳动物细胞中的表达。
关于本申请的RNA分子，术语“分离的核酸”主要是指由如上定义的分离的DNA分子编码的RNA分子。或者，该术语可以指从其自然状态下(即在细胞或组织中)与其结合的RNA分子上充分分离下来的RNA分子，从而以“基本上纯的”形式存在(术语“基本上纯的”如下文所限定)。
关于蛋白，术语“分离的蛋白”或“分离和纯化的蛋白”在本文中是指通过表达本申请的分离的核酸分子产生的蛋白。或者，这个术语可以指的是这样的蛋白，其已经与自然结合的其他蛋白充分分离，从而以“基本上纯的”形式存在。
术语“hFVIII多肽”是指基本上保持hFVIII生物功能的全长人FVIII蛋白、人FVIII蛋白片段、人FVIII蛋白的结构域和结构域组合。
术语“突变hFVIII多肽”或“修饰hFVIII多肽”是指与参考hFVIII多肽有一个或多个氨基酸差异(例如一个或更多个氨基酸取代)的多肽。参考hFVIII多肽可以是具有或不具有信号肽的野生型hFVIII蛋白、具有修饰的野生型hFVIII蛋白，例如B结构域有缺失的野生型hFVIII蛋白(例如hBDDF8)或无B结构域的hFVIII、hFVIII的片段、具有或不具有进一步修饰的hFVIII的结构域或结构域的组合。在一些实施方式中，“修饰的hFVIII多肽”的“参考hFVIII多肽”是指修饰前的hFVIII多肽。在一些实施方式中，术语“突变hFVIII多肽”或“修饰hFVIII多肽”是指包含人FVIII重链和来自不同物种的FVIII轻链(例如来自犬FVIII的轻链)的杂合FVIII多肽。
本文中使用的术语“hFVIII变体”是指基本上保持hFVIII生物功能的“突变hFVIII蛋白”或“修饰hFVIII蛋白”。
“保守氨基酸取代”是氨基酸残基被功能相似的残基所取代的取代。保守取代的实例包括非极性(疏水性)残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸相互之间的取代；带电荷或极性(亲水性)残基相互之间的取代，例如精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间或苏氨酸和丝氨酸之间的取代；碱性残基如赖氨酸或精氨酸相互之间的取代；一种酸性残基，如天冬氨酸或谷氨酸相互之间的取代；芳香族残基如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸相互之间的取代；或丙氨酸或甘氨酸的取代。本申请的突变FVIII蛋白可以包括相对于参考蛋白具有一个或多个保守取代并保持参考蛋白的一些或全部活性的氨基酸，如本文所述。
本文使用的术语“表达盒”是指包含足以表达感兴趣的多核苷酸的核酸元件的核酸构建体。通常，表达盒包含与调控序列(例如启动子和增强子)可操作地连接的感兴趣的多核苷酸。在一些实施方式中，表达盒可以包含额外的元件，例如内含子、聚腺苷酸化位点、土拨鼠肝炎病毒转录后反应元件(WPRE)、分泌信号序列和/或已知影响编码序列表达水平的其他元件。
术语“调控序列”是指基因的转录调控序列，可见于编码区的5'或3'侧、编码区内或内含子内。调控序列的实例包括但不限于启动子和增强子。
本文使用的术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的核苷酸序列。通常，感兴趣的多核苷酸位于启动子序列的3'。在一些实施方式中，启动子整体来源于天然基因。在一些实施方式中，启动子由衍生自不同天然存在的启动子的不同元件组成。在一些实施方式中，启动子包含合成核苷酸序列。本领域技术人员应当理解的是，不同的启动子将指导基因在不同组织或细胞类型中，或在不同的发育阶段，或响应于不同的环境条件，或药物或转录辅助因子的存在或不存在的表达。普遍存在的、细胞类型特异性、组织特异性、发育阶段特异性和条件性启动子，例如药物反应启动子(例如四环素反应启动子)是本领域技术人员众所周知的。启动子的实例包括但不限于磷酸甘油酸激酶(PKG)启动子、CAG、NSE(神经元特异性烯醇酶)、突触蛋白或NeuN启动子，SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子；腺病毒主要晚期启动子(Ad-MLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV即刻早期启动子区(CMVIE)、SFFV启动子、骨肉瘤病毒(RSV)启动子、合成启动子、杂合启动子等。启动子可以来自人类，也可以来自其他物种，包括来自小鼠。此外，衍生自非病毒基因的序列，例如鼠金属硫蛋白基因启动子，也可以在此使用。在一些实施方式中，启动子是异源启动子。在一些实施方式中，启动子序列由近端和更远端的上游元件组成，并且可以包含增强子元件。
本文使用的术语“异源启动子”是指在自然界中未发现与给定编码序列可操作地连接的启动子。
术语“增强子”是指可以刺激启动子活性的核苷酸序列，并且可以是启动子的先天元件(innate element)或插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。
术语“操作性连接的”或“可操作地连接的”是指两个或多个核酸片段在单个核酸片段上的结合，从而使一个的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时(例如，编码序列处于启动子的转录控制下)，启动子与编码序列可操作地连接。编码序列可以在正义或反义方向上与调控序列操作性连接。
如本文所用，术语“分泌信号序列”、“信号肽”或其变体是指与天然多肽的分泌水平相比，具有增强(如上所述)可操作地连接多肽从细胞分泌的功能的氨基酸序列。如上文所限定的，“增强”的分泌是指由细胞合成的多肽从该细胞分泌的相对比例增加；分泌的蛋白的绝对量没有非得也增加。在一些实施方式中，基本上所有(即，至少95％、97％、98％、99％或更多)的多肽被分泌。然而，只要与天然多肽相比分泌水平提高，不必非得是基本上所有甚至大部分的多肽都被分泌。通常，分泌信号序列在内质网内被切割，并且在一些实施方式中，分泌信号序列在分泌之前被切割。然而，只要多肽从细胞的分泌增强并且多肽具有功能，分泌信号序列就没有必要非得被切割。因此，在一些实施方式中，分泌信号序列被部分或完全保留。分泌信号序列可以全部或部分来源于分泌多肽的分泌信号(即，来源于前体)和/或可以是全部或部分合成的。分泌信号序列的长度并不重要；通常，已知的分泌信号序列的长度为约10-15至50-60个氨基酸。此外，来自分泌多肽的已知分泌信号可以被改变或修饰(例如，通过氨基酸的取代、缺失、截短或插入)，只要得到的分泌信号序列起到增强可操作地连接多肽分泌的作用。本发明的分泌信号序列可以包含、基本上由或由天然存在的分泌信号或其修饰组成(如上所述)。本领域已知许多直接从细胞分泌的分泌蛋白和序列。本发明的分泌信号序列还可以是全部或部分合成的或人工的。合成的或人工的分泌信号肽是本领域已知的，参见例如Barash等人的"Human secretory signal peptidedescription by hidden Markov model and generation of a strong artificialsignal peptide for secreted protein expression,"Biochem.Biophys.Res.Comm 294:835-42(2002)；其公开内容整体并入本文。术语“可操作地连接”是指编码序列表达所需的调控序列被放置在DNA分子中相对于编码序列的适当位置，从而影响编码序列的表达。这种相同的定义有时适用于表达载体中编码序列和转录控制元件(例如启动子、增强子和终止元件)的排列。该定义有时也适用于第一和第二核酸分子的核酸序列的排列，其中产生杂合核酸分子。
术语“基本上纯的”是指包含至少50-60重量％感兴趣的化合物(如核酸、寡核苷酸、蛋白等)的制剂。更优选的是，所述制剂含有至少75重量％，最优选90-99重量％的感兴趣的化合物。通过适用于感兴趣的化合物的方法(例如色谱法、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析等)测量纯度。
短语“当提及特定核苷酸序列或氨基酸序列时，基本上由……组成”是指具有给定SEQ ID NO特性的序列。例如，当用于提及氨基酸序列时，该短语包括序列本身和不会影响序列的基本特性和新特性的分子修饰物。
本文使用的术语“寡核苷酸”是指本申请的引物和探针，并被限定为由两种或多种优选多于三种的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸组成的核酸分子。寡核苷酸的确切大小将取决于各种因素和使用寡核苷酸的特定应用。本文中使用的术语“探针”是指寡核苷酸、多核苷酸或核酸，无论是R A或DNA，无论是如在纯化的限制性内切酶消化中那样自然存在的还是合成产生的，其能够与具有与探针互补序列的核酸退火或特异性杂交。探针可以是单链的，也可以是双链的。探针的确切长度取决于许多因素，包括温度、探针来源和使用方法。例如，对于诊断应用，根据靶序列的复杂性，寡核苷酸探针通常包含15-25个或更多个的核苷酸，尽管它可以包含更少的核苷酸。
术语“同一性百分比”在本文中用于指核酸或氨基酸序列之间的比较。核酸和氨基酸序列经常使用例如国家医学图书馆(National Library of Medicine)BLAST比对程序中的计算机程序进行比较。
本文所用的“对应”核酸或氨基酸或序列是存在于FVIII或突变FVIII分子或其片段中的位点的核酸或氨基酸，其具有与另一物种的FVIII分子中的位点相同的结构和/或功能，尽管所述核酸或氨基酸数可能不相同。“对应”于另一个FVIII序列的序列基本上对应于这样的序列，并在严苛条件下与指定为SEQ ID NO:1的人FVIIIDNA序列杂交。“对应”于另一个FVIII序列的序列还包括导致FVIII或所要求保护的促凝杂合FVIII或其片段的表达并且将与包含SEQ ID NO:1的核酸分子杂交但遗传密码子冗余的序列。
本文所用的“独特”氨基酸残基或序列是指一个物种的FVIII分子中的氨基酸序列或残基与另一物种的FVIII分子中的同源残基或序列不同。
本文所用的“比活性”是指将纠正人因子VIII缺乏型血浆的凝血缺陷的活性。在标准测定中，以每毫克总FVIII蛋白的凝血活性单位测量比活性，其中将人FVIII缺乏型血浆的凝血时间与正常人血浆的凝血时间进行比较。一个FVIII活性单位是存在于一毫升正常人血浆中的活性。在测定中，凝块形成的时间越短，所测定的FVIII的活性就越大。在人FVIII测定中，杂合的人/猪FVIII具有共凝活性。这种活性，以及其他杂合的或杂合等效的FVIII分子或其片段的活性，可以小于、等于或大于血浆衍生的或重组的人FVIII的活性。
本文所用的人或动物FVIII的“亚基”是蛋白的重链和轻链。FVIII的重链包含三个结构域，即Al、A2和B。FVIII的轻链也包含三个结构域，即A3、C1和C2。
本文使用的术语“表位”、“抗原位点”和“抗原决定簇”是同义词，并被定义为人、动物、杂合体或杂合等效的FVIII或其片段的被抗体特异性地识别的部分。它可以由任何数量的氨基酸残基组成，并且可以依赖于蛋白的一级、二级或三级结构。根据本公开的内容，包括至少一个表位的杂合FVIII、杂合FVIII等效物或它们之一的片段可以用作下述诊断测定中的试剂。在一些实施方式中，与人或猪FVIII相比，杂合的或杂合等效的FVIII或其片段与所有天然存在的抑制性FVIII抗体没有交叉反应性或交叉反应性较低。
如本文所用，术语“免疫原性位点”被定义为人或动物FVIII、杂合的或杂合等效的FVIII或其片段的一个区域，该区域通过常规方案(如本文所述的免疫测定法，如ELISA或Bethesda测定法)测定的那样，特异性地引发抗人或动物中FVIII、杂合体、杂合等效物或片段的抗体的产生。它可以由任何数量的氨基酸残基组成，并且它可以依赖于蛋白的一级、二级或三级结构。在一些实施方式中，杂合的或杂合等效的FVIII或其片段在动物或人中是非免疫原性的或比人或猪FVIII具有更低的免疫原性。
本文所用的“FVIII缺乏症”是指由以下原因引起的凝血活性缺乏：(1)产生有缺陷的FVIII；(2)FVIII的产生不足或没有产生FVIII；或(3)FVIII的部分或全部抑制。甲型血友病是一种由X连锁基因缺陷以及由其编码的FVIII蛋白缺失或缺乏引起的FVIII缺乏症。
II.修饰的hFVIII多肽(mhFVIII)
本申请的一个方面涉及与野生型hFVIII多肽或未修饰的参考多肽相比含有一个或多个突变的修饰hFVIII多肽(mhFVIII)。在一些实施方式中，与在相同条件下在相同类型的宿主细胞中表达的野生型hFVIII或参考蛋白(如hBDDF8)相比，所述mhFVIII在宿主细胞中表达时，导致宿主细胞中hFVIII活性增加。
人FVIII编码具有2351个氨基酸的蛋白(具有19个氨基酸的信号肽和2332个氨基酸的成熟蛋白)。它排列有一系列结构“结构域”：NH
A1-a
编码野生型人FVIII的cDNA序列具有如在SEQ ID NO:1中示出的核苷酸序列。在SEQ ID NO:1中，FVIII开放阅读框的前57个核苷酸编码信号肽序列(SEQ ID NO:2)，该信号肽序列通常从成熟FVIII蛋白上切割下来。
在一些实施方式中，本申请的修饰hFVIII多肽在对应于SEQ ID NO:3中示出的野生型hFVIII氨基酸序列的氨基酸残基20-171的区域中包含一个或多个氨基酸取代。在一些实施方式中，本申请的修饰hFVIII多肽在位置A20、T21、F57、L69、I80、L178、R199、H212、I215、R269、I310、L318、S332、R378、I610和I661的位置处包含一个或多个取代。
述及本文所述的突变体或修饰物，由后面跟着数字的氨基酸的单字母代码表示的位置命名是指氨基酸残基及其在野生型hFVIII中的位置(SEQ ID NO:3)。例如，命名“A20”是指野生型hFVIII序列(SEQ ID NO:3)第20位的氨基酸残基丙氨酸(A)。类似地，由氨基酸的第一个单字母代码、后面跟着数字、后面跟着氨基酸的第二个单字母代码表示的取代命名是指野生型hFVIII(SEQ ID NO:3)中由数字示出的位置处的原始氨基酸残基被第二个氨基酸取代。例如，命名“A20K”是指野生型hFVIII(SEQ ID NO:3)第20位的氨基酸残基丙氨酸(A)被氨基酸残基赖氨酸(K)取代。氨基酸位置命名和取代命名也适用于hFVIII的结构域、hFVIII重链和轻链、hFVIII片段、与hFVIII具有共同序列的多肽和/或其他hFVIII衍生的序列，例如hBDDF8。
在一些实施方式中，本申请提供了mhFVIII，该mhFVIII包含选自A20、T21、F57、L69、I80、L178、R199、H212、I215、R269、I310、L318、S332、R378、I610和I661中的一个或多个氨基酸残基中的氨基酸取代。所述mhFVIII可以包括涵盖这16个氨基酸位点的任何突变组合。根据本申请使用的示例性mhFVIII在图3中有描述，其所识别的单个和多个突变置于方框中。
在一些实施方式中，本申请的mhFVIII包括选自A20K、T21I、T21V、F57L、L69V、I80V、L178F、R199K、H212Q、I215V、R269K、I310V、L318F、S332P、R378S、I610M和I661V中的一个或多个氨基酸取代。
在一些实施方式中，本申请的mhFVIII在位置T21处包含氨基酸取代。优选的取代包括T21I和T21V。在一些实施方式中，所述mhFVIII在选自A20、F57、L69、I80、L178、R199、H212、I215、R269、I310、L318、S332、R378、I610和I661中的位置处进一步包含一个或多个氨基酸取代。
在一些实施方式中，本申请的mhVIII在位置A20和T21处包含氨基酸取代。在一些实施方式中，本申请的mhFVIII包含氨基酸取代A20K和T21I(2M1突变体)，或氨基酸取代A20K和T21V(2M2突变体)。
在一些实施方式中，本申请的mhFVIII在位置T21、L69和I80处包含氨基酸取代。在一些实施方式中，本申请的mhFVIII包含氨基酸取代T21I、L69V和I80V(3M1突变体)。
在一些实施方式中，本申请的mhFVIII在位置T21、L69、I80和L178处包含氨基酸取代。在一些实施方式中，本申请的mhFVIII包含氨基酸取代T21I、L69V、I80和L178F(4M1突变体)。
在一些实施方式中，本申请的mhFVIII在位置T21、L69、I80和I661处包含氨基酸取代。在一些实施方式中，本申请的mhFVIII包含氨基酸取代T21I、L69V、I80V和I661V(4M3突变体)。
在一些实施方式中，本申请的mhFVIII在位置T21、L69、I80、L178和I661处包含氨基酸取代。在一些实施方式中，本申请的mhFVIII包含氨基酸取代T21I、L69V、I80V、L178F和I661V(5M4突变体)。
在一些实施方式中，本申请的mhFVIII在位置R199、H212、I215、R269、I310、L318和S332处包含氨基酸取代。在一些实施方式中，本申请的mhFVIII包含氨基酸取代R199K、H212Q、I215V、R269K、I310V、L318F和S332P(7M2突变体)。
在一些实施方式中，本申请的mhFVIII在位置T21、L69、I80、L178、H212、I215、R269、L318和I661处包含氨基酸取代。在一些实施方式中，本申请的mhFVIII包含氨基酸取代T21I、L69V、I80V、L178F、H212Q、I215V、R269K、L318F和I661V(9M1突变体)。
在一些实施方式中，本申请的mhFVIII在位置A20、T21、L69、I80、L178、H212、I215、R269、L318和I661处包含氨基酸取代。在一些实施方式中，本申请的mhFVIII包含氨基酸取代A20K、T21V、L69V、I80V、L178F、H212Q、I215V、R269K、L318F和I661V(10M1突变体)。
在一些实施方式中，本申请的mhFVIII在位置T21、L69、I80、L178、R199、H212、I215、R269、I310、L318、S322和I661处包含氨基酸取代。在一些实施方式中，本申请的mhFVIII包含氨基酸取代T21I、L69V、I80V、L178F、R199K、H212Q、I215V、R269K、I310V、L318F、S322P和I661V(12M1突变体)。
在一些实施方式中，本申请的mhFVIII在位置A20、T21、L69、I80、L178、R199、H212、I215、R269、I310、L318、S332和I661处包含氨基酸取代。在一些实施方式中，本申请的mhFVIII包含氨基酸取代A20K、T21V、L69V、I80V、L178F、R199K、H212Q、I215V、R269K、I310V、L318F、S332P和I661V(13M1突变体)。
在一些实施方式中，与上述氨基酸取代相对应的氨基酸位置可以被其他保守取代所取代。表1提供了在氨基酸位置A20、T21、L69、I80、L178、R199、H212、I215、R269、I310、L318、S332和I661处的示例性氨基酸取代的列表。
表1.示例性的氨基取代。
在一些实施方式中，上述mhFVIIIs包括B结构域中的缺失(“无B结构域”)。在B结构域中包含有缺失的hFVIII多肽的实例在美国专利No.6,800,461、美国专利No.6,780,614U.S.U.S.和专利申请公报No.2004/0197875中有描述，其通过引用结合纳入于此。
在一些实施方式中，本申请的mhFVIII包含单链多肽。在一些实施方式中，本申请的mhFVIII包含具有截短或缺失的B结构域的单链hFVIII多肽。在一些实施方式中，本申请的mhFVIII包含含有A1结构域和A2结构域的重链(HC)和含有A3结构域、C1结构域和C2结构域的轻链(LC)的异源二聚体。在一些实施方式中，本申请的mhFVIII包含含有A1结构域、A2结构域和全长或截短的B结构域的重链(HC)和含有A3结构域、C1结构域和C2结构域的轻链(LC)的异源二聚体。在一些实施方式中，本申请的mhFVIII包含含有A1结构域的多肽、含有A2结构域的多肽和含有A3结构域、C1结构域和C2结构域的多肽的异源三聚体。
在一些实施方式中，上述mhFVIII衍生自包含在带有SEQ ID NO:5中示出的天然hFVIII信号肽的B结构域中有缺失的野生型hBDDF8。mhFVIII的分泌形式不包含SEQ ID NO:2中示出的信号肽序列。
在一些实施方式中，当在体外(in vitro)或体内(in vivo)表达时，本申请的mhFVIII导致FVIII活性提高5％-100倍、10％-50倍、50％-25倍、2-100倍、2-80倍、2-60倍、2-40倍、2-20倍、2-10倍、2-5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少70倍、至少80倍或至少100倍的野生型hFVIII或由其衍生的参考多肽的FVIII活性。体外FVIII活性可以通过分析来自表达mhFVIII的细胞的组织培养基来测定。体内FVIII活性可通过分析从接受mhFVIII输注的个体或表达mhFVIII的表达载体收集的血浆来测定。
在一些实施方式中，如上所述的本申请的mhFVIII可以进一步修饰以额外包括、删除或修饰其他FVIII序列，从而赋予其他所需的性能，例如降低的抗原性、增加的稳定性、通过与血清结合蛋白结合增加的循环半衰期、增加的蛋白分泌、增加的对因子IXa和/或因子X的亲和力、降低的对von Willebrand因子的亲和力、增加的糖基化作用、改变的失活切割、改变的至少一个钙结合位点和/或增加的保质期。
例如，在一些实施方式中，本申请的mhFVIII可以被修饰为另外包括负责人FVIII的免疫原性和/或抗原性的氨基酸取代，如美国专利No.5,859,204、美国专利No.6,770,744和美国专利申请公报No.2003/0166536所述，例如R503A、R503G、P504A、L505S、Y506L、Y506A、S507A、S507L、R508A、R508S、R509G、L510S、P511L、P511A、K512A、G513S、V514A、K515M、H516L、L517S、K518M、D519A、F520A、P521L、I522M、L523M、P524A、G525A、E526G、I527M、I528A、M2218I、F2219L、V2242A、K2246E、L2271F或其任意组合。
在其他一些实施方式中，如上所述的本申请的mhFVIII可以被修饰为另外包括如美国专利申请No.2016/102133中所述的提供分泌增加的氨基酸取代，例如I105V、Y124F、A127S、D134E、Q136H、F148L、G151K、H153Q、M166T和L171P或其任何组合。
在其他一些实施方式中，如上所述的本申请的mhFVIII可以被修饰为另外包括通过借助于融合的A2和A3结构域而赋予活化的FVIII更大的稳定性的氨基酸取代。特别地，FVIII可以通过取代位置683和1845(即Y683C，T1845C)的半胱氨酸残基来修饰，从而得到形成共价连接A2和A3结构域的C683-Cl845二硫键的突变FVIII。
在其他一些实施方式中，如上所述的本申请的mhFVIII可以进一步被修饰为另外包括赋予改变的失活切割位点的氨基酸取代。例如，A355或A581可以被取代，用于降低突变FVIII对通常使野生型FVIII失活的切割酶的敏感性。
在其他一些实施方式中，如上所述的本申请的mhFVIIIs可以进一步被修饰为另外包括赋予对因子IXa的增强的亲和力的氨基酸取代。
在其他一些实施方式中，如上所述的本申请的mhFVIII可以被进一步修饰为另外包括赋予增加的循环半衰期的氨基酸取代。这可以通过各种方法实现，包括但不限于通过减少与硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)的相互作用。
在其他一些实施方式中，如上所述的本申请的mhFVIII可以被进一步修饰为另外包括赋予用于在天冬酰胺残基处进行糖基化的识别序列的氨基酸取代。这种修饰可用于通过存在(existing)抑制性抗体(低抗原性FVIII)和通过降低产生抑制性抗体(低免疫原性FVIII)的可能性而逃避检测。在一个代表性的实施方式中，修饰FVIII被突变为结合有用于N-连接的糖基化的共有氨基酸序列，例如N-X-S/T。
在其他一些实施方式中，如上所述的本申请的mhFVIIIs可以被进一步修饰为另外包括突变，从而(i)缺失von Willebrand因子结合位点，(ii)在A759处加入突变，和/或(iii)在A2结构域和A3结构域之间加入氨基酸序列间隔区，其中所述氨基酸间隔区具有足够的长度，使得在激活时，促凝血活性的FVIII蛋白变成异源二聚体。
在一些实施方式中，本申请的mhFVIII是杂合FVIII，其包含人FVIII重链和来自不同物种的FVIII轻链，例如来自犬FVIII的轻链。在一些实施方式中，人FVIII重链进一步包含本申请中描述的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方式中，杂合FVIII包括截短的B结构域。在一些实施方式中，杂合FVIII由单个多肽组成，所述单个多肽包含(1)野生型人FVIII重链序列或修饰的人FVIII重链序列，和(B)来自不同物种的FVIII轻链序列，例如来自犬FVIII的轻链。在一些实施方式中，修饰的人FVIII重链序列包含本申请中描述的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方式中，修饰的人FVIII重链序列包括hBDDF8序列或具有本申请中描述的一个或多个氨基酸取代的修饰hBDDF8。
III.mhFVIII编码多核苷酸、表达盒和表达载体
本申请的另一个方面涉及编码本申请的mhFVIII的分离的多核苷酸，包括编码本文所述范围(breadth)的取代和/或其他突变的所有可能的核酸。分离的核酸可以是RNA或DNA。
在某些实施方式中，所述多核苷酸编码mhFVIII多肽，该多肽被密码子优化为用于在各种人类、灵长类动物或哺乳动物细胞例如HuH7、HEK293T或CHO细胞中表达。编码本申请的mhFVIII的多核苷酸可以被密码子优化为在不改变编码的氨基酸序列的情况下提高宿主细胞中的活性、稳定性或表达。
密码子由一组三个核苷酸组成，编码特定氨基酸或导致翻译终止(即终止密码子)。遗传密码是冗余的，其中多个密码子指定相同的氨基酸，即总共有61个密码子编码20个氨基酸。密码子优化将多核苷酸序列中存在的密码子替换为编码相同氨基酸的优选密码子，例如，用于哺乳动物表达的优选密码子。因此，在该过程中氨基酸序列没有被改变。密码子优化可以使用基因优化软件进行。密码子优化的核苷酸序列被翻译并与原始蛋白序列比对，以确保氨基酸序列没有变化。密码子优化的方法是本领域已知的，并且例如在美国申请公报No.2008/0194511和美国专利No.6,114,148中有描述。
在一些实施方式中，所述mhFVIII蛋白以单链的无B结构域的mhFVIII的形式表达。在一些实施方式中，所述mhFVIII蛋白以包含hFVIII的重链(HC)和轻链(LC)的双链(DC)蛋白的形式由一种或多种核酸表达。在一些实施方式中，所述mhFVIII蛋白以包含A1结构域的多肽、包含A2结构域的多肽和包含A3、C1和C2结构域的多肽的异源三聚体的形式由一种或多种核酸表达。
在一些实施方式中，本申请的mhFVIII编码多核苷酸包括用于表达野生型hFVIII氨基末端信号肽(SEQ ID NO:2)的编码序列，该编码序列从成熟蛋白中去除。在一些实施方式中，本申请的mhFVIIIs衍生自具有SEQ ID NO:5(具有信号肽)或SEQ ID NO:6(没有信号肽)的氨基酸序列的hBDDF8蛋白。由于信号肽序列可以影响表达水平，因此所述mhFVIII编码多核苷酸可以被工程改造为表达携带本领域已知的多种异源N-末端信号肽中的任何一种信号肽的mhFVIII。
在一些实施方式中，如上所述的本申请的mhFVIII编码多核苷酸可以被修饰为额外包括、缺失或修饰赋予其他所需性能的其他FVIII序列，所述性能例如为降低的抗原性、增加的稳定性、通过与血清结合蛋白结合而增加的循环半衰期、增加的蛋白分泌、增加的对因子IXa和/或因子X的亲和力、降低的对von Willebrand因子的亲和力、增加的糖基化作用、改变的失活切割、改变的一个或多个钙结合位点、和/或增加的货架寿命，如上所述。
本申请的另一个方面涉及用于表达本文所述的mhFVIII的表达盒。在一些实施方式中，所述表达盒包括编码本申请的mhFVIII的核苷酸序列和与该核苷酸序列可操作地连接的调控序列。在一些实施方式中，所述调控序列包含启动子。
本申请的另一个方面涉及能够在体外和/或体内表达本申请的mhFVIII的表达载体。在一些实施方式中，所述表达载体是非病毒载体，例如质粒。在一些实施方式中，所述表达载体是病毒载体，例如AAV载体或慢病毒载体。
用于表达本申请的mhFVIII的表达载体通常包括与待表达的多核苷酸序列可操作地连接的一个或多个调控序列。本领域技术人员应当理解的是，所述表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白的表达水平等因素。本申请的表达载体可以被导入宿主细胞中，从而产生本文所述的mhFVIII。
用于指导在哺乳动物细胞中表达的合适表达载体通常包括启动子以及本领域已知的其他转录和翻译控制序列。在某些实施方式中，哺乳动物表达载体能够优先指导多核苷酸在特定细胞类型中的表达(例如使用组织特异性调控元件来表达所述多核苷酸)。组织特异性调控元件是本领域已知的，并且可以包括例如肝细胞特异性启动子和/或增强子(例如白蛋白启动子、a-1抗胰蛋白酶启动子、apoE增强子)。或者，可以使用在几乎任何细胞类型中具有活性的组成型启动子(例如HCMV)。
在某些优选的实施方式中，所述表达载体是病毒载体。病毒载体通常有一个或多个病毒基因被去除，并且包括被插入到病毒基因组插入位点的基因/启动子盒，以用于插入外源性转基因，包括本文所述的突变FVIII基因。去除的基因的必要功能可以由如下细胞系提供，所述细胞系已被工程化改造为反式表达早期基因的基因产物。示例性病毒载体包括但不限于腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体，包括慢病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体和α病毒载体。其他病毒载体包括星形病毒、冠状病毒、正粘病毒、乳头状病毒、副粘病毒、细小病毒、小核糖核酸病毒、痘病毒、披膜病毒(togavirus)等病毒载体。所述病毒载体可以包括任何合适的核酸构建体，例如DNA或RNA构建体，并且可以是单链、双链或复链(duplexed)的。
一旦制备了本申请的DNA构建体，就可以将其整合到宿主细胞中。因此，本申请的另一个方面涉及制备包含mhFVIII核酸的重组细胞的方法。从基本上来说，这需要通过转化、转导、电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质体等将DNA构建体导入到细胞中，并选择已在染色体外(episomally)结合所述DNA或已将所述DNA整合到宿主基因组中的细胞。在一些实施方式中，将表达所述mhFVIII的细胞移植到受试者中以用于治疗血友病。
在一些实施方式中，所述mhFVIII蛋白由病毒载体表达，用于给血友病患者施用。在一些实施方式中，所述病毒载体是AAV载体。在一些实施方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些实施方式中，所述病毒载体是腺病毒载体。在一些实施方式中，所述病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施方式中，所述病毒载体是疱疹病毒载体。在一些实施方式中，提供了用于施用编码mhFVIII的一种或多种AAV载体的方法。
重组AAV和慢病毒载体已被发现在各种基因治疗应用中具有广泛的用途。它们在此类应用中的效用很大程度上是由于在各种器官环境中实现的体内基因转移的高效率。AAV和慢病毒颗粒可以有利地用作有效基因递送的载体。这样的病毒粒子对于这样的应用具有许多期望的特征，包括对分裂和非分裂细胞的趋向性。这些载体的早期临床经验也表明没有持续的毒性，免疫反应很小或检测不到。已知AAV通过受体介导的内吞作用或转运作用在体外和体内感染多种细胞类型。这些载体系统已经在人体中进行了测试，靶向视网膜上皮、肝脏、骨骼肌、气道、大脑、关节和造血干细胞。基于质粒DNA或微环(minicircle)的非病毒载体也可能是编码FVIII的大基因的合适的基因转移载体。
在一些实施方式中，所述mhFVIII编码序列被提供作为包装在衣壳中的病毒载体的组分。在一些实施方式中，AAV载体用于本申请的mhFVIII的体内递送。在这种情况下，所述AAV载体包括至少一种mhFVIII和用于控制mhFVIII序列表达的相关表达控制序列。用于表达mhFVIII序列的示例性AAV载体可以包括用于FVIII表达的启动子-增强子调控区域和顺式作用ITR(其功能是能够促进mhFVIII核酸复制和包装到AAV衣壳中以及将mhFVIII核苷酸整合到靶细胞的基因组中)。优选的是，所述AAV载体的rep和cap基因缺失并被mhFVIII序列及其相关表达控制序列所取代。所述mhFVIII序列通常插入到一个或两个(即两侧)足以进行病毒复制的AAV TR或TR元件附近。最优选的是，仅分别包括载体的必要部分，例如ITR和LTR元件。在一些实施方式中，两种或更多种AAV载体被用于本申请的mhFVIII的体内递送。在这种情况下，每个AAV载体如上所述构建，并携带mhFVIII编码序列的一部分(例如，一个载体携带mhFVIII重链的编码序列，另一个载体携带mhFVIII轻链的编码序列)。
适用于促进突变hFVIII序列在靶细胞中的组织特异性表达的调控序列被用于所述mhFVIII的体外或体内表达。在本申请的表达构建体中引入组织特异性调节元件为mhFVIII或其功能片段的表达提供了至少部分的组织趋向性。例如，编码在巨细胞病毒(CMV)启动子或CAG启动子控制下的突变FVIII的核酸序列可用于骨骼肌表达或hAAT-ApoE和其他用于肝特异性表达。AAV和慢病毒载体中的造血特异性启动子也可用于在体内驱动所述mhFVIII的表达。
包装的病毒载体的病毒衣壳组分可以是细小病毒衣壳。优选AAVCap和嵌合衣壳。合适的细小病毒病毒衣壳组分的实例为来自细小病毒科的衣壳组分，例如自主细小病毒(autonomous parvovirus)或依赖性病毒(dependovirus)。例如，病毒衣壳可以是AAV衣壳(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12衣壳；本领域技术人员应当知道可能存在尚未鉴定出的执行相同或相似功能的其他变体)，或者可以包括来自两个或更多个AAV衣壳的组分。AAV Cap蛋白的完整补体(complement)包括VP1、VP2和VP3。包含编码AAV VP衣壳蛋白的核苷酸序列的ORF可以包含少于完整补体AAV Cap蛋白，或者可以提供AAV Cap蛋白的完整补体。
一种或多种AAV-Cap蛋白可以是嵌合蛋白，包括来自两种或多种病毒的氨基酸序列AAV-Cap，优选两种或更多种AAV，如Rabinowitz等人的美国专利No.6,491,907中所述。例如，嵌合病毒衣壳可以包括AAV1-Cap蛋白或亚基和至少一种AAV2-Cap或亚基。嵌合衣壳可以例如包括具有一个或多个B19-Cap亚基的AAV衣壳，例如，AAV-Cap蛋白或亚基可以被B19-Cap蛋白或亚基取代。例如，AAV衣壳的Vp3亚基可以被B19的Vp2亚基取代。
可以培养包装细胞以产生本申请的包装病毒载体。所述包装细胞可以包括(1)病毒载体功能、(2)包装功能和(3)辅助功能。所述病毒载体功能通常包括细小病毒基因组的一部分，例如AAV基因组，其中rep和cap被删除，并被突变FVIII序列及其相关表达控制序列取代，如上所述。
在某些实施方式中，所述病毒载体功能可以适当地作为复链载体模板提供，如Samulski等人的美国专利公报No.2004/0029106中所述。复链载体是二聚自互补(sc)多核苷酸(通常为DNA)。例如，可以选择复链载体的DNA，以便由于链内碱基配对而形成双链发夹结构。复链DNA载体的两条链都可以包装在病毒衣壳内。复链载体提供了与双链DNA病毒载体相当的功能，并且可以缓和靶细胞合成与通常被病毒包裹的单链基因组互补的DNA的需要。
选择用于病毒载体的TR(可降解的和不可降解的)优选为AAV序列(来自任何AAV血清型)。可降解的AAV ITR不需要具有野生型TR序列(例如，野生型序列可以通过插入、缺失、截短或错义突变而改变)，只要TR介导所需的功能，例如病毒包装、整合和/或原病毒拯救等。TR可以是起AAV反向末端重复的作用的合成序列，例如授予Samulski等人的美国专利No.5,478,745中所述的“双-D序列”。典型但不一定的是，多个TR来自相同的细小病毒，例如，两个TR序列都来自AAV2。
所述包装功能包括衣壳组分。所述衣壳组分优选来自细小病毒衣壳，例如AAV衣壳或嵌合AAV衣壳功能。合适的细小病毒病毒衣壳组分的实例是来自细小病毒科例如自主细小病毒或依赖性病毒的衣壳组分。例如，所述衣壳组分可以选自AAV衣壳，例如AAV1-AAV12和其他尚未鉴定的新型衣壳，或者选自非人灵长类动物来源。所述衣壳组分可以包括来自两个或更多个AAV衣壳的组分。
在某些实施方式中，一种或多种VP衣壳蛋白可以包含嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含来自两种或更多种病毒优选两种或更多种AAV的氨基酸序列。例如，所述嵌合病毒衣壳可以包括来自腺相关病毒(AAV)的衣壳区和来自B19病毒的至少一个衣壳区。所述嵌合衣壳可以例如包括具有一个或多个B19衣壳亚基的AAV衣壳，例如，AAV衣壳亚基可以被B19衣壳亚基取代。例如，AAV衣壳的VP1、VP2或VP3亚基可以被B19的VP1、VP2或VP3亚基取代。作为另一个实例，所述嵌合衣壳可包括AAV 2型衣壳，其中所述2型VP1亚基已被来自AAV 1、3、4、5或6型衣壳，优选3、4或5型衣壳的VP1亚基取代。或者，嵌合细小病毒具有AAV 2型衣壳，其中2型VP2亚基已被来自AAV 1、3、4、5或6型衣壳，优选3、4或5型衣壳的VP2亚基取代。同样，优选这样的嵌合细小病毒，其中来自AAV 1、3、4、5或6型(更优选3、4或5型)的VP3亚基被取代为AAV2型衣壳的VP3亚基。作为另一种选择，优选这样的嵌合细小病毒，其中两个AAV 2型亚基被来自不同血清型(例如，AAV 1、3、4、5或6型)的AAV的亚基取代。在根据该实施方式的示例性嵌合细小病毒中，AAV 2型衣壳的VP1和VP2，或VP1和VP3，或VP2和VP3亚基被不同血清型(例如，AAV 1、3、4、5或6型)的AAV的相应亚基取代。同样，在其他一些优选实施方式中，所述嵌合细小病毒具有AAV 1、3、4、5或6型衣壳(优选2、3或5型衣壳)，其中一个或两个亚基已被来自不同血清型的AAV的亚基取代，如上文针对AAV 2型所述。
经包装的病毒载体通常包括突变FVIII序列和两侧为TR元件的表达控制序列，所述TR元件足以导致载体DNA的包装和随后在转导细胞中表达突变FVIII序列。所述病毒载体功能可以例如作为质粒或扩增子的组分提供给细胞。所述病毒载体功能可以存在于细胞系内的染色体外和/或可以整合到细胞的染色体DNA中。
IV.用于mhFVIII蛋白的生产方法和细胞系
本申请的另一个方面涉及制备本申请的mhFVIII的方法。这需要在表达载体转化宿主细胞以表达mhFVIII的条件下使本申请的宿主细胞生长。然后分离表达的mhFVIII。
本申请的另一个方面涉及宿主细胞，所述宿主细胞包括编码本申请的所述mhFVIII的分离的核酸分子。所述宿主细胞可以含有分离的核酸分子作为附加体(episomal)质粒形式的DNA分子，或者它可以稳定地整合到所述宿主细胞的基因组中。此外，所述宿主细胞可以构成用于生产所述mhFVIII蛋白的表达系统。合适的宿主细胞可以是但不限于动物细胞(例如人HuH7和HEK293细胞、中国仓鼠卵巢细胞(“CHO”)、幼仓鼠肾细胞(“BHK”))、细菌细胞(例如大肠杆菌)、昆虫细胞(例如Sf9细胞)、真菌细胞、酵母细胞(例如酿酒酵母或裂殖酵母)、植物细胞(例如拟南芥或烟草细胞)、藻类细胞等。适合实施本申请的哺乳动物细胞此外还包括COS(例如，ATCC No.CRL 1650或1651)、BHK(例如，ATCC No.CRL6281)、CHO(ATCC No.CCL 61)、HeLa(例如，ATCC No.CCL 2)、293(ATCC No.1573)、CHOP、HuH7、HEK293和NS-1细胞。
本申请的另一个方面涉及从培养细胞生产mhFVIII的方法。在一些实施方式中，所述方法包括以下步骤：(a)将表达载体导入宿主细胞，所述表达载体包含：多核苷酸，所述多核苷酸包含编码信号肽的核苷酸序列和编码所述mhFVIII的核苷酸序列，其中所述mhFVIII包含在选自A20K、T21I、T21V、F57L、L69V、I80V、L178F、R199K、H212Q、I215V、R269K、I310V、L318F、S332P、R378S、I610M和I661V中的位置处的至少一个或多个氨基酸取代；以及与所述多核苷酸操作性连接的调控序列；(b)在适合表达和分泌所述mhFVIII的条件下使携带表达载体的所述宿主细胞生长；和(c)收获所述宿主细胞和/或所述宿主细胞的培养基，和(d)从所收获的培养基和/或宿主细胞纯化出所述mhFVIII。
在一个实施方式中，让所述宿主细胞在生长培养基中进行体外生长。合适的生长培养基可以包括但不限于含有von Willebrand因子(本文称为“VWF”)的生长培养液。在该实施方式中，所述宿主细胞可以包含编码VWF的转基因，或者可以将VWF作为补充剂引入所述生长培养基中。所述生长培养基中的VWF将允许所述mhFVIII实现更高表达水平。一旦重组FVIII分泌到所述生长培养基中，就可以使用相关重组DNA和蛋白技术的普通技术人员已知的技术(包括本文所述的技术)将其从生长培养基中分离。在另一个实施方式中，制备本申请的所述mhFVIII的方法还包括在分离所述mhFVIII之前破坏所述宿主细胞。在该实施方式中，所述mhFVIII与细胞碎片分离。
所述mhFVIII优选以基本上纯的形式生产。在一个特定的实施方式中，基本上纯的重组FVIII的纯度为至少约80％，更优选至少90％，最优选至少95％、98％、99％或99.9％。基本上纯的重组FVIII可以通过本领域熟知的常规技术获得。通常，基本上纯的mhFVIII被分泌到重组宿主细胞的生长培养基中。或者，产生基本上纯的mhFVIII，但不分泌到生长培养基中。在这种情况下，为了分离基本上纯的mhFVIII，将携带重组质粒的宿主细胞繁殖，通过超声处理、加热或化学处理进行裂解，并离心匀浆以去除细胞碎片。然后将上清液进行顺次(sequential)硫酸铵沉淀。在适当尺寸的葡聚糖或聚丙烯酰胺柱中对含有基本上纯的mhFVIII的级分进行凝胶过滤以分离mhFVIII。如有必要，可以通过高效液相色谱法(“HPLC”)进一步纯化蛋白级分(含有基本上纯的mhFVIII)。
V.治疗方法
本申请的另一个方面涉及一种治疗患有FVIII缺乏症的患者的方法。
在一些实施方式中，该方法包括向有需要的患者施用有效量的本申请的mhFVIII的步骤。在一些实施方式中，所述mhFVIII以纯化形式静脉内施用。
在其他一些实施方式中，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的表达载体的步骤，所述表达载体包含本申请的mhFVIII的编码序列，其中所述表达载体能够在所述患者中表达所述mhFVIII。
在其他一些实施方式中，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的细胞的步骤，所述细胞包含本申请的mhFVIII的编码序列，其中所述细胞能够在移植后在所述患者中表达所述mhFVIII。在一些实施方式中，所述细胞是真皮成纤维细胞。在一些实施方式中，所述细胞是自体细胞。在一些实施方式中，所述方法包括将mhFVIII编码序列导入靶细胞群的步骤，其中所述靶细胞分离自需要这种治疗的受试者；在所述靶细胞中表达所述mhFVIII，以及将有效量的mhFVIII表达细胞输注到所述受试者中。
在一些实施方式中，所述FVIII缺乏症是甲型血友病。在这种情况下，本申请的mhFVIII的表达可以增强患者的凝血，否则所述患者容易由于FVIII缺乏而不受控制地出血(例如，关节内、颅内或胃肠道出血)，包括已经产生抗人FVIII抗体的血友病患者。载体的靶细胞是能够表达具有FVIII活性的多肽的细胞，例如哺乳动物肝系统的那些细胞、内皮细胞和具有适当细胞机制以处理(process)前体从而产生具有FVIII活力的蛋白的其他细胞。
将所述mhFVIII蛋白或编码mhFVIII的表达载体或表达mhFVIII的细胞施用于FVIII缺陷患者可以在功能上重建凝血级联反应(coagulation cascade)。所述mhFVIII蛋白或编码mhFVIII的表达载体或表达mhFVIII的细胞可以单独施用，或可以与其他治疗剂组合以药学上可接受或生物学上可相容的组合物施用。
在一些实施方式中，所述方法包括根据与用于输注人或动物FVIII相同的程序，将包含mhFVIII蛋白的药物组合物静脉内施用于患者。合适的有效量的mhFVIII可以包括但不限于约10至约500单位/kg患者体重。
编码mhFVIII的表达载体或mhFVIII蛋白或表达mhFVIII的细胞的处理剂量将随FVIII缺乏症的严重程度而变化。通常，剂量水平根据每个患者出血情节的严重程度和持续时间在频率、持续时间和单位上进行调整。因此，编码mhFVIII的表达载体或mhFVIII蛋白或表达mhFVIII的细胞包含在药学上可接受的载体、递送载体或稳定剂中，其量足以向患者递送治疗有效量的蛋白以止血，如通过标准凝血测定法测得的那样。
FVIII被经典地定义为存在于正常血浆中的物质，该物质可纠正甲型血友病个体的血浆中的凝血缺陷。纯化和部分纯化形式的FVIII的体外凝血活性被用于计算人类患者输注的mhFVIII的剂量，并且是从患者血浆中恢复的活性和体内出血缺陷的校正的可靠指标。据报道，新型FVIII分子的体外标准测定与它们在狗输注模型或人类患者中的行为之间没有差异。
通常，通过施用所述mhFVIII在患者体内达到所需的血浆FVIII活性水平为正常水平的30-200％。在一个实施方式中，治疗性mhFVIII的静脉内施用的优选剂量为约5-500单位/kg体重，特别是10-100单位/kg重量，进一步特别是20-40单位/kg体重的剂量；间隔频率为约8至24小时(在受严重影响的血友病患者中)；并且以天为单位的治疗持续时间为1-10天，或者直到出血情节得到解决。使用抑制剂的患者可能需要与其先前形式的FVIII不同量的mhFVIII。例如，患者可能需要更少的mhFVIII，因为它比野生型VIII具有更高的特异性活性，并且其抗体反应性降低。与用人或血浆来源的FVIII治疗一样，治疗性mhFVIII输注的量由单阶段FVIII凝血测定法确定，并且在选定的情况下，通过测量输注后患者血浆中的FVIII来确定体内恢复。应该理解的是，对于任何特定的受试者，特定的剂量方案应该根据个体需要和施用或监督组合物施用的人的专业判断随时间调整，并且本文所述的浓度范围仅是示例性的，并不旨在限制所要求保护的mhFVIII的范围或实践。
治疗可以根据需要采取单次静脉施用所述mtFVIII的形式，或者在较长时间内定期或连续施用。或者，治疗性mhFVIII可以与脂质体一起以不同的时间间隔以一个或若干个剂量皮下或口服施用。
向有需要的人类受试者或动物施用表达载体可以通过本领域已知的用于施用病毒载体的任何手段进行。示例性施用模式包括直肠、透粘膜、局部、透皮、吸入、胃肠外(例如，静脉内、皮下、皮内、肌肉内和关节内)等施用，以及直接组织或器官注射，或者，鞘内、直接肌肉内、脑室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。可注射物可制备为常规形式，如液体溶液或悬浮液，适合在注射前在液体中溶解或悬浮的固体形式，或乳液形式。或者，可以以局部而非全身的方式施用所述病毒，例如以贮库(depot)或缓释制剂施用。
在某些优选实施方式中，所述表达载体通过肌肉内施用，更优选通过肌肉内注射或局部施用。本文公开的载体可以通过任何合适的方式施用于受试者的肺部，但是优选通过施用由本发明的细小病毒载体(其由受试者吸入)组成的可吸性颗粒的气溶胶悬浮液来进行施用。可吸入颗粒可以是液体或固体。包含本发明的细小病毒载体(例如AAV)的液体颗粒的气溶胶可以通过任何合适的方式生产，例如使用本领域技术人员已知的压力驱动的气溶胶喷雾器或超声喷雾器(参见如美国专利No.4,501,729)。
表达mhFVIII的病毒载体的剂量将取决于施用方式、待治疗的疾病或病症、个体受试者的状况、特定的病毒载体和待递送的基因，并且可以以常规方式确定。用于实现治疗效果的示例性剂量为至少约10
编码mtFVIII的多核苷酸可以作为含有重链和轻链部分的单链分子施用，或者在用于递送到患者的宿主细胞中的多个独立的病毒或非病毒载体中分成两个或多个分子(例如，重链和重链)。
在一些实施方式中，所述表达载体是病毒载体。可以用于本申请的病毒载体包括但不限于多种血清型的腺相关病毒(AAV)载体(例如，AAV-1至AAV-12及其伪型载体)、杂合AAV载体、逆转录病毒载体，包括慢病毒载体和伪型慢病毒载体(例如人免疫缺陷病毒(HIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV))；腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、非病毒载体和其他载体。此外，任何所述病毒载体都可以被修饰以包括组织特异性启动子/增强子等。
VI.药物组合物
本申请的另一个方面涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含(1)本申请的mhFVIII多肽、编码mhFVIII的表达载体或表达mhFVIII的细胞，和(2)药学上可接受的载体。
示例性药学上可接受的载体包括无菌的、不含热原的水和无菌的、不含热原的、磷酸盐缓冲盐水。生理上可接受的载体包括药学上可接受载体。药学上可接受的载体是那些在生物学上或在其他方面不是不希望的载体，即，所述材料可以在不引起超过该材料的有利生物学效果的不希望的生物学效果的情况下施用于受试者。在一些实施方式中，所述药物组合物被配制用于注射。
对于注射，所述载体通常是液体。作为注射介质，优选使用含有通常用于注射溶液的添加剂的水，所述添加剂例如为稳定剂、盐或盐水和/或缓冲剂。对于其他施用方法，所述载体可以是固体或液体。对于吸入方式施用，所述载体将是可吸性的，并且优选为固体或液体颗粒形式。
本申请通过以下实施例进行进一步说明，这些实施例不应被解释为限制性的。贯穿本申请引用的所有参考文献、专利和已公布的专利申请的内容通过引用合并于此。
实施例
例1：因子VIII突变体的构建、表达和表征
模板：质粒pANG-CAG-hBDDF8被用作将多个hFVIII突变引入hFVIII重链的编码区的模板。如图1所示，pANG-CAG-hBDDF8(SEQ IDNO:15)含有人因子VIII(hBDDF8)cDNA，该cDNA受CAG启动子的控制。此外，pANG-CAG-hBDDF8在B结构域中携带有缺失，导致功能缺陷性B结构域。图2鉴定了在pANG-CAG-hBDDF8中构建的hFVIII突变。图3显示了在本研究中分析的两种hFVIII突变，包括单氨基酸取代及其组合。
单突变：使用GIBSON
T21突变体：通过用P取代T21，在pANG-CAG-hBDDF8中引入AvrII限制性位点。所得质粒pANG-CAG-hBDDF8-T21P用作模板，在氨基酸位置21产生多点突变。pANG-CAG-hBDDF8-T21P被AvrII消化并用作本文所述的突变体构建的模板。将NNN对应于T21位置的19个寡核苷酸通过HIFI组装重组到pANG-CAG-hBDDF8中。突变质粒包括pANG-CAG-hBDDF8-T21V、pANG-CAG-hBDDF8-T21I……pANG-CAG-hBDDF8-T21G等。最后的字母表示该特定位置的氨基酸取代。根据本发明，可以使用类似的策略来生成其他取代。
具有T21I的A20突变：T21I和NNN对应于丙氨酸20的19个寡核苷酸通过HIFI组装重组到被AvrII消化的pANG-CAG-hBDDF8-T21P中。得到的突变质粒包括pANG-CAG-hBDDF8-T21V、pANG-CAG-hBDDF8-T21I……pANG-CAG-hBDDF8-T21G等。根据本发明，类似的策略可用于产生其他取代，例如pANG-CAG-hBDDF8-A20K/T21V(2M2)。
突变的组合：在pANG-CAG-hBDDF8中构建具有多个HC突变的hFVIII突变体(如图3所示)。在一个实施方式中，化学合成编码取代突变A20K、T21V、L69V、I80V、L178F、R199K、H212Q、I215V、R269K、I310V、L318F、S332P和I661V的DNA片段，并用于取代pANG-CAG-hBDDF8中的相应区域。所得质粒pANG-CAG-BDDF8-13M1表达具有上述13个突变的突变因子VIII蛋白(13M1)。
在另一个实施方式中，化学合成编码取代突变T21I、L69V、I80V、L178F、R199K、H212Q、I215V、R269K、I310V、L318F、S332P和I661V的DNA片段，并用于取代pANG-CAG-hBDDF8的相应区域。所得到的质粒pANG-CAG-BDDF8-12M1表达具有上述12个突变的突变因子VIII蛋白(12M1)。
在另一个实施方式中，化学合成编码取代突变A20K、T21V、L69V、I80V、L178F、H212Q、I215V、R269K、L318F和I661V的DNA片段，并用于取代pANG-CAG-hBDDF8的相应区域。所得到的质粒pANG-CAG-BDDF8-10M1表达具有上述10个突变的突变因子VIII蛋白(10M1)。
在另一个实施方式中，化学合成编码取代突变T21I、L69V、I80V、L178F、H212Q、I215V、R269K、L318F和I661V的DNA片段，并用于取代pANG-CAG-hBDDF8的相应区域。所得质粒pANG-CAG-BDDF8-9M1表达具有上述9个突变的突变因子VIII蛋白(9M1)。
在另一个实施方式中，化学合成编码取代突变R199K、H212Q、I215V、R269K、I310V、L318F和S332P的DNA片段，并用于取代pANG-CAG-hBDDF8的相应区域。所得到的质粒pANG-CAG-BDDF8-7M2表达具有上述7个突变的突变因子VIII蛋白(7M2)。
在另一个实施方式中，化学合成编码取代突变T21I、L69V、I80V、L178F和I661V的DNA片段，并用于取代pANG-CAG-hBDDF8的相应区域。所得质粒pANG-CAG-BDDF8-5M4表达具有上述5个突变的突变因子VIII蛋白(5M4)。
在另一个实施方式中，化学合成编码取代突变T21V、L69V、I80V和I661V的DNA片段，并用于取代pANG-CAG-hBDDF8的相应区域。所得质粒pANG-CAG-BDDF8-4M3表达具有上述4个突变的突变因子VIII蛋白(4M3)。
在另一个实施方式中，化学合成编码取代突变T21I、L69V、I80V和L178F的DNA片段，并用于取代pANG-CAG-hBDDF8的相应区域。所得质粒pANG-CAG-BDDF8-4M1表达具有上述4个突变的突变因子VIII蛋白(4M1)。
在另一个实施方式中，化学合成编码取代突变T21I、L69V和I80V的DNA片段，并用于取代pANG-CAG-hBDDF8的相应区域。所得到的质粒pANG-CAG-BDDF8-3M1表达具有上述3个突变的突变因子VIII蛋白(3M1)。
为了测试突变构建体的功能活性，将HEK 293T、HuH7和CHO细胞在含有10％胎牛血清、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的DMEM中在37℃在提供有5％二氧化碳的潮湿环境中培养。用pANG-CAG-hDDF8中的突变体或野生型表达构建体转染HEK 293T、HuH7和CHO细胞。转染后，将细胞维持在含有2％灭活胎牛血清的RPMI-1640培养基中。在转染后的不同时间(24小时、48小时、72小时)收集细胞培养基。使用活化部分凝血活酶时间(APTT)测定法分析分泌的FVIII活性。使用正常人血浆作为标准物。
这些测定的代表性结果如图4-10、11B和13所示。简而言之，图4-6显示在转染后48小时，与野生型hFVIII相比，HuH7细胞(图4)和HEK 293T细胞(图5、6)中的特异性单氨基酸取代突变体的功能活性增加。图6显示在转染后48小时，T21I和T21V突变体显著提高HEK293T细胞中的FVIII活性。图7显示在转染后48小时，相对于T21和T21V单取代对应物，携带A20K的双突变体(A20K/T21I和A20K/T22V)在HEK 293T细胞中进一步增加了FVIII活性。图8-10显示在转染后24小时和48小时，与HuH7、HEK 293T和CHO细胞中的野生型、单取代和双取代突变体相比，多个突变的组合可分别显著提高FVIII功能活性。
例2：杂合人/犬因子VIII突变体的构建、表达和功能活性
为了与由突变hVIII重链(hHC)和犬FVIII轻链(cLC)组成的突变杂合人/犬FVIII相比评估本申请的突变hVIII的功能活性，制备了一系列无B结构域的FVIII构建体并在HEK293T细胞中表达，如图11A和11B所示。
简而言之，构建了包含突变体人FVIII重链和犬FVIII轻链的突变体FVIII。简而言之，用CspCI和XhoI消化pANG-CAG-hBDDF8。化学合成了编码犬轻链(cLC)的DNA片段，并通过Gibson组装法用于替换pANG-CAG-hBDDF8中相应的人轻链(hLC)区域。所得质粒pANG CAG-hHC cLC表达由hHC和cLC组成(即hHC-cLC)的无B结构域的杂合人/犬因子VIII多肽。SEQ IDNO:10显示具有天然hFVIII信号肽的hHC-cLC蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:11显示编码SEQ ID NO:10中的蛋白的cDNA序列。SEQ ID NO:12显示不含hFVIII信号肽的hHC-cLC蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:13显示hHC-cLC蛋白中截短的B结构域的氨基酸序列，而SEQ IDNO:14显示犬FVIII轻链(cLC)的氨基酸序列。
使用类似的策略生成pANG-CAG-qwHC-2M1-cLC(2M1突变体)和pANG-CAG-qwHCC-9M1-cLC(9M1突变体)质粒，如图11A所示(和所缩写的那样)。使用活化部分凝血活酶时间(APTT)测定法分析分泌的FVIII活性。图11B显示在转染后48小时，与hFVIII(即未修饰的hBDDF8蛋白)的功能活性相比，HEK 293T细胞中各种人/犬杂合FVIII突变体的功能活性。如图11B所示，与从亲本质粒hBDDF8表达的hFVIIIs相比，在该体系中用cLC取代hLC导致FVIII活性增加。
在另一个方面，比较表达本申请的突变体hVIII的rAAV载体与表达亲本hBDDF8的rAAV载体的功能活性。在这种情况下，构建并生产了表达hBDDF8蛋白和修饰的hBDDF8蛋白的一系列rAAV。将得到的rAAVs用于感染Huh7细胞，并分析感染细胞中的hVIII活性。
在这种情况下，构建了表达本申请的突变体hVIII的第一系列rAAV，其中hBDDF8中的CAG启动子被人TTR启动子取代。简而言之，用SnaBI和MluI消化pANG-CAG-hBDDF8。化学合成编码TTR启动子和内含子的DNA片段，并用来通过Gibson组装法取代pANG-CAG-hBDDF8中的CAG启动子区。
如图12中所示，所得到的质粒pANG-TTR-hBDDF8(SEQ ID NO:18)在TTR启动子的控制下表达hBDDF8蛋白。使用类似的策略来生成pANG-TTR-qwBDDF8-2M1 、 pANG-TTR-qwBDDF8-2M2 、pANG-TTR-qwBDDF8-9M1 、 pANG-TTR-qwBDDF8-10M1 、pANG-TTR-qwBDDF8-12M1、pANG-TTR-qwBDDF8-13M1质粒。
使用AAV2衣壳包装pANG-TTR-hBDDF8及其修饰的变体质粒以由其产生rAAV。简而言之，将pAAV Rep&Cap(血清型2)、pAd-辅助因子(pAd-helper)和转基因质粒以1:1:1的比例共转染到在转瓶(roller bottle)中培养的HEK 293T细胞中。在转染后72小时，收获来自转染的细胞培养基的rAAVs，并通过两轮CsCl梯度超离心机纯化。收集每种rAAV并用含有5％D-山梨醇的PBS进行广泛(extensively)交换。
将HuH7细胞在含有10％FBS、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的DMEM(Invitrogen，Carlsbad，CA)中在37℃在提供有5％CO
如图13所示，当在Huh7细胞中通过rAAV载体表达时，与未修饰的hBDDF8相比，修饰的hBDDF8表现出增加的FVIII活性。
上述实施例表明，与野生型因子VIII相比，本申请的突变因子VIII产物表现出增加的功能活性。因此，使用本文所述的突变体可以降低生产成本和所需的FVIII表达水平(相对于现有构建体)。它们还可以通过提供更高活性的FVIII产物来允许施用更低的载体剂量。
以上描述是为了教导本领域普通技术人员如何实践本申请。本说明书并不旨在详细说明技术人员在阅读说明书后将变得显而易见的所有这些明显的修改和变化。然而，旨在将所有这些明显的修改和变化包括在由以下权利要求书限定的本申请的范围内。权利要求书旨在以任何顺序涵盖所要求保护的部件和步骤，以有效地实现其预期目标，除非上下文有明确相反的指示。
序列表
<110>艾诺健基因治疗股份有限公司
王启钊
于道展
<120>修饰的血浆凝血因子VIII及其使用方法
<130>23US0670AF-CN
<160>18
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>7056
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>misc_feature
<223>人因子 VIII
<400>1
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc60
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cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt1920
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attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa2040
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atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc2160
atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac2220
agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc2280
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ccagaaaatg acatagagaa gactgaccct tggtttgcac acagaacacc tatgcctaaa2400
atacaaaatg tctcctctag tgatttgttg atgctcttgc gacagagtcc tactccacat2460
gggctatcct tatctgatct ccaagaagcc aaatatgaga ctttttctga tgatccatca2520
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catcacagtg gggacatggt atttacccct gagtcaggcc tccaattaag attaaatgag2640
aaactgggga caactgcagc aacagagttg aagaaacttg atttcaaagt ttctagtaca2700
tcaaataatc tgatttcaac aattccatca gacaatttgg cagcaggtac tgataataca2760
agttccttag gacccccaag tatgccagtt cattatgata gtcaattaga taccactcta2820
tttggcaaaa agtcatctcc ccttactgag tctggtggac ctctgagctt gagtgaagaa2880
aataatgatt caaagttgtt agaatcaggt ttaatgaata gccaagaaag ttcatgggga2940
aaaaatgtat cgtcaacaga gagtggtagg ttatttaaag ggaaaagagc tcatggacct3000
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aatcatatgt caaataaaac tacttcatca aaaaacatgg aaatggtcca acagaaaaaa3300
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caaggcccca gtccaaagca attagtatcc ttaggaccag aaaaatctgt ggaaggtcag3480
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<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>misc_feature
<223> 人因子 VIII 信号肽
<400>2
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Cys Phe Ser
<210>3
<211>2351
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>misc_feature
<223>具有信号肽的人因子 VIII
<400>3
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 1015
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
202530
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
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Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
505560
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65707580
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
859095
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100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
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Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
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Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
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Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
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180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
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355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
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Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
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Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
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Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
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His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
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Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
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Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
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Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
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Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
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900 905 910
Leu Ala Ala Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met
915 920 925
Pro Val His Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys
930 935 940
Ser Ser Pro Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu
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Ser AsnLys Thr Thr Ser SerLys Asn Met Glu MetVal Gln Gln
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Ser ProLys Gln Leu Val SerLeu Gly Pro Glu LysSer Val Glu
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Ser PhePro Ser Ile Arg ProIle Tyr Leu Thr ArgVal Leu Phe
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Gln AspAsn Ser Ser His LeuPro Ala Ala Ser TyrArg Lys Lys
1430 1435 1440
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1445 1450 1455
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Val ThrTyr Lys Lys Val GluAsn Thr Val Leu ProLys Pro Asp
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Pro GlyHis Leu Asp Leu ValGlu Gly Ser Leu LeuGln Gly Thr
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1550 1555 1560
Pro PheLeu Arg Val Ala ThrGlu Ser Ser Ala LysThr Pro Ser
1565 1570 1575
Lys LeuLeu Asp Pro Leu AlaTrp Asp Asn His TyrGly Thr Gln
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Ile ProLys Glu Glu Trp LysSer Gln Glu Lys SerPro Glu Lys
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Thr AlaPhe Lys Lys Lys AspThr Ile Leu Ser LeuAsn Ala Cys
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Glu SerAsn His Ala Ile AlaAla Ile Asn Glu GlyGln Asn Lys
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Pro GluIle Glu Val Thr TrpAla Lys Gln Gly ArgThr Glu Arg
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Leu CysSer Gln Asn Pro ProVal Leu Lys Arg HisGln Arg Glu
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Ile ThrArg Thr Thr Leu GlnSer Asp Gln Glu GluIle Asp Tyr
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Tyr AspGlu Asp Glu Asn GlnSer Pro Arg Ser PheGln Lys Lys
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Thr ArgHis Tyr Phe Ile AlaAla Val Glu Arg LeuTrp Asp Tyr
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Gly MetSer Ser Ser Pro HisVal Leu Arg Asn ArgAla Gln Ser
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Gly SerVal Pro Gln Phe LysLys Val Val Phe GlnGlu Phe Thr
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Phe AspCys Lys Ala Trp AlaTyr Phe Ser Asp ValAsp Leu Glu
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Ile GlnMet Glu Asp Pro ThrPhe Lys Glu Asn TyrArg Phe His
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Ala IleAsn Gly Tyr Ile MetAsp Thr Leu Pro GlyLeu Val Met
1940 1945 1950
Ala GlnAsp Gln Arg Ile ArgTrp Tyr Leu Leu SerMet Gly Ser
1955 1960 1965
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1970 1975 1980
Val ArgLys Lys Glu Glu TyrLys Met Ala Leu TyrAsn Leu Tyr
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Pro GlyVal Phe Glu Thr ValGlu Met Leu Pro SerLys Ala Gly
2000 2005 2010
Ile TrpArg Val Glu Cys LeuIle Gly Glu His LeuHis Ala Gly
2015 2020 2025
Met SerThr Leu Phe Leu ValTyr Ser Asn Lys CysGln Thr Pro
2030 2035 2040
Leu GlyMet Ala Ser Gly HisIle Arg Asp Phe GlnIle Thr Ala
2045 2050 2055
Ser GlyGln Tyr Gly Gln TrpAla Pro Lys Leu AlaArg Leu His
2060 2065 2070
Tyr SerGly Ser Ile Asn AlaTrp Ser Thr Lys GluPro Phe Ser
2075 2080 2085
Trp IleLys Val Asp Leu LeuAla Pro Met Ile IleHis Gly Ile
2090 2095 2100
Lys ThrGln Gly Ala Arg GlnLys Phe Ser Ser LeuTyr Ile Ser
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Gln PheIle Ile Met Tyr SerLeu Asp Gly Lys LysTrp Gln Thr
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Ser ThrLeu Arg Met Glu LeuMet Gly Cys Asp LeuAsn Ser Cys
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<211>2332
<212>PRT
<213>智人
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<221>misc_feature
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Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
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His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
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His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
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Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
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Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
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Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
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505560
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65707580
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
859095
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His
740 745 750
Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile
755 760 765
Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp
770 775 780
Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys
785 790 795 800
Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly
805 810 815
Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser
820 825 830
Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser
835 840 845
Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu
850 855 860
Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr
865 870 875 880
Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile
885 890 895
Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe
900 905 910
Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His
915 920 925
Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe
930 935 940
Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro
945 950 955 960
Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln
965 970 975
Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr
980 985 990
Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu AsnMet Glu Arg Asn CysArg Ala Pro
995 1000 1005
Cys AsnIle Gln Met Glu AspPro Thr Phe Lys GluAsn Tyr Arg
1010 1015 1020
Phe HisAla Ile Asn Gly TyrIle Met Asp Thr LeuPro Gly Leu
1025 1030 1035
Val MetAla Gln Asp Gln ArgIle Arg Trp Tyr LeuLeu Ser Met
1040 1045 1050
Gly SerAsn Glu Asn Ile HisSer Ile His Phe SerGly His Val
1055 1060 1065
Phe ThrVal Arg Lys Lys GluGlu Tyr Lys Met AlaLeu Tyr Asn
1070 1075 1080
Leu TyrPro Gly Val Phe GluThr Val Glu Met LeuPro Ser Lys
1085 1090 1095
Ala GlyIle Trp Arg Val GluCys Leu Ile Gly GluHis Leu His
1100 1105 1110
Ala GlyMet Ser Thr Leu PheLeu Val Tyr Ser AsnLys Cys Gln
1115 1120 1125
Thr ProLeu Gly Met Ala SerGly His Ile Arg AspPhe Gln Ile
1130 1135 1140
Thr AlaSer Gly Gln Tyr GlyGln Trp Ala Pro LysLeu Ala Arg
1145 1150 1155
Leu HisTyr Ser Gly Ser IleAsn Ala Trp Ser ThrLys Glu Pro
1160 1165 1170
Phe SerTrp Ile Lys Val AspLeu Leu Ala Pro MetIle Ile His
1175 1180 1185
Gly IleLys Thr Gln Gly AlaArg Gln Lys Phe SerSer Leu Tyr
1190 1195 1200
Ile SerGln Phe Ile Ile MetTyr Ser Leu Asp GlyLys Lys Trp
1205 1210 1215
Gln ThrTyr Arg Gly Asn SerThr Gly Thr Leu MetVal Phe Phe
1220 1225 1230
Gly AsnVal Asp Ser Ser GlyIle Lys His Asn IlePhe Asn Pro
1235 1240 1245
Pro IleIle Ala Arg Tyr IleArg Leu His Pro ThrHis Tyr Ser
1250 1255 1260
Ile ArgSer Thr Leu Arg MetGlu Leu Met Gly CysAsp Leu Asn
1265 1270 1275
Ser CysSer Met Pro Leu GlyMet Glu Ser Lys AlaIle Ser Asp
1280 1285 1290
Ala GlnIle Thr Ala Ser SerTyr Phe Thr Asn MetPhe Ala Thr
1295 1300 1305
Trp SerPro Ser Lys Ala ArgLeu His Leu Gln GlyArg Ser Asn
1310 1315 1320
Ala TrpArg Pro Gln Val AsnAsn Pro Lys Glu TrpLeu Gln Val
1325 1330 1335
Asp PheGln Lys Thr Met LysVal Thr Gly Val ThrThr Gln Gly
1340 1345 1350
Val LysSer Leu Leu Thr SerMet Tyr Val Lys GluPhe Leu Ile
1355 1360 1365
Ser SerSer Gln Asp Gly HisGln Trp Thr Leu PhePhe Gln Asn
1370 1375 1380
Gly LysVal Lys Val Phe GlnGly Asn Gln Asp SerPhe Thr Pro
1385 1390 1395
Val ValAsn Ser Leu Asp ProPro Leu Leu Thr ArgTyr Leu Arg
1400 1405 1410
Ile HisPro Gln Ser Trp ValHis Gln Ile Ala LeuArg Met Glu
1415 1420 1425
Val LeuGly Cys Glu Ala GlnAsp Leu Tyr
1430 1435
<210>7
<211>745
<212>PRT
<213>hBDDF8 中的人因子 VIII 重链 (无信号肽)
<400>7
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 1015
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
202530
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
354045
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
505560
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65707580
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
859095
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn
740 745
<210>8
<211>13
<212>PRT
<213>hBDDF8 中的截短的B结构域
<400>8
Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln
1 5 10
<210>9
<211>693
<212>PRT
<213>hBDDF8 中的人 FVIII 轻链
<400>9
Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu
1 5 1015
Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu
202530
Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser
354045
Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val
505560
Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg
65707580
Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe
859095
Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu
100 105 110
Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val
115 120 125
Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr
130 135 140
Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly
145 150 155 160
Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr
165 170 175
Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp
180 185 190
Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val
195 200 205
His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu
210 215 220
Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe
225 230 235 240
Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met
245 250 255
Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr
260 265 270
Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp
275 280 285
Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr
290 295 300
Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser
305 310 315 320
Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu
325 330 335
Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser
340 345 350
Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His
355 360 365
Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr
370 375 380
Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala
385 390 395 400
Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr
405 410 415
Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile
420 425 430
Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln
435 440 445
Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile
450 455 460
Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser
465 470 475 480
Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile
485 490 495
Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu
500 505 510
His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met
515 520 525
Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys
530 535 540
Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met
545 550 555 560
Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg
565 570 575
Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln
580 585 590
Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly
595 600 605
Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser
610 615 620
Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys
625 630 635 640
Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn
645 650 655
Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln
660 665 670
Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu
675 680 685
Ala Gln Asp Leu Tyr
690
<210>10
<211>1457
<212>PRT
<213>具有信号肽的 hHC-cLC
<400>10
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 1015
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
202530
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
354045
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
505560
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65707580
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
859095
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Ser
755 760 765
Lys His His Gln Arg Glu Ile Thr Val Thr Thr Leu Gln Pro Glu Glu
770 775 780
Asp Lys Phe Glu Tyr Asp Asp Thr Phe Ser Ile Glu Met Lys Arg Glu
785 790 795 800
Asp Phe Asp Ile Tyr Gly Asp Tyr Glu Asn Gln Gly Leu Arg Ser Phe
805 810 815
Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp
820 825 830
Asp Tyr Gly Met Ser Arg Ser Pro His Ile Leu Arg Asn Arg Ala Gln
835 840 845
Ser Gly Asp Val Gln Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr
850 855 860
Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His
865 870 875 880
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile
885 890 895
Val Val Thr Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser
900 905 910
Ser Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Asp Glu Gly Gln Gly Ala Glu Pro Arg
915 920 925
Arg Lys Phe Val Asn Pro Asn Glu Thr Lys Ile Tyr Phe Trp Lys Val
930 935 940
Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp
945 950 955 960
Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu
965 970 975
Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Arg Ser Asn Thr Leu Asn Pro Ala His
980 985 990
Gly Arg Gln Val Thr Val Gln GluPhe Ala Leu Val PheThr Ile Phe
995 1000 1005
Asp GluThr Lys Ser Trp TyrPhe Thr Glu Asn LeuGlu Arg Asn
1010 1015 1020
Cys ArgAla Pro Cys Asn ValGln Lys Glu Asp ProThr Leu Lys
1025 1030 1035
Glu AsnPhe Arg Phe His AlaIle Asn Gly Tyr ValLys Asp Thr
1040 1045 1050
Leu ProGly Leu Val Met AlaGln Asp Gln Lys ValArg Trp Tyr
1055 1060 1065
Leu LeuSer Met Gly Ser AsnGlu Asn Ile His SerIle His Phe
1070 1075 1080
Ser GlyHis Val Phe Thr ValArg Lys Lys Glu GluTyr Lys Met
1085 1090 1095
Ala ValTyr Asn Leu Tyr ProGly Val Phe Glu ThrVal Glu Met
1100 1105 1110
Leu ProSer Gln Val Gly IleTrp Arg Ile Glu CysLeu Ile Gly
1115 1120 1125
Glu HisLeu Gln Ala Gly MetSer Thr Leu Phe LeuVal Tyr Ser
1130 1135 1140
Lys LysCys Gln Thr Pro LeuGly Met Ala Ser GlyHis Ile Arg
1145 1150 1155
Asp PheGln Ile Thr Ala SerGly Gln Tyr Gly GlnTrp Ala Pro
1160 1165 1170
Lys LeuAla Arg Leu His TyrSer Gly Ser Ile AsnAla Trp Ser
1175 1180 1185
Thr LysAsp Pro Phe Ser TrpIle Lys Val Asp LeuLeu Ala Pro
1190 1195 1200
Met IleIle His Gly Ile MetThr Gln Gly Ala ArgGln Lys Phe
1205 1210 1215
Ser SerLeu Tyr Val Ser GlnPhe Ile Ile Met TyrSer Leu Asp
1220 1225 1230
Gly AsnLys Trp His Ser TyrArg Gly Asn Ser ThrGly Thr Leu
1235 1240 1245
Met ValPhe Phe Gly Asn ValAsp Ser Ser Gly IleLys His Asn
1250 1255 1260
Ile PheAsn Pro Pro Ile IleAla Gln Tyr Ile ArgLeu His Pro
1265 1270 1275
Thr HisTyr Ser Ile Arg SerThr Leu Arg Met GluLeu Leu Gly
1280 1285 1290
Cys AspPhe Asn Ser Cys SerMet Pro Leu Gly MetGlu Ser Lys
1295 1300 1305
Ala IleSer Asp Ala Gln IleThr Ala Ser Ser TyrLeu Ser Ser
1310 1315 1320
Met LeuAla Thr Trp Ser ProSer Gln Ala Arg LeuHis Leu Gln
1325 1330 1335
Gly ArgThr Asn Ala Trp ArgPro Gln Ala Asn AsnPro Lys Glu
1340 1345 1350
Trp LeuGln Val Asp Phe ArgLys Thr Met Lys ValThr Gly Ile
1355 1360 1365
Thr ThrGln Gly Val Lys SerLeu Leu Ile Ser MetTyr Val Lys
1370 1375 1380
Glu PheLeu Ile Ser Ser SerGln Asp Gly His AsnTrp Thr Leu
1385 1390 1395
Phe LeuGln Asn Gly Lys ValLys Val Phe Gln GlyAsn Arg Asp
1400 1405 1410
Ser SerThr Pro Val Arg AsnAla Leu Glu Pro ProLeu Val Ala
1415 1420 1425
Arg TyrVal Arg Leu His ProGln Ser Trp Ala HisHis Ile Ala
1430 1435 1440
Leu ArgLeu Glu Val Leu GlyCys Asp Thr Gln GlnPro Ala
1445 1450 1455
<210>11
<211>4374
<212>DNA
<213>hHC-cLC 的 cDNA
<400>11
atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc60
accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120
ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180
acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240
gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300
gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360
ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420
gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480
aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540
gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600
gggagtctgg ccaaggaaaa gacacagacc ttgcacaaat ttatactact ttttgctgta 660
tttgatgaag ggaaaagttg gcactcagaa acaaagaact ccttgatgca ggatagggat 720
gctgcatctg ctcgtgcctg gcctaaaatg cacacagtca atggttatgt aaacaggtct 780
ctgccaggtc tgattggatg ccacaggaaa tcagtctatt ggcatgtgat tggaatgggc 840
accactcctg aagtgcactc aatattcctc gaaggtcaca catttcttgt gaggaaccat 900
cgccaggcgt ccttggaaat ctcgccaata actttcctta ctgctcaaac actcttgatg 960
gaccttggac agtttctact gttttgtcat atctcttccc accaacatga tggcatggaa1020
gcttatgtca aagtagacag ctgtccagag gaaccccaac tacgaatgaa aaataatgaa1080
gaagcggaag actatgatga tgatcttact gattctgaaa tggatgtggt caggtttgat1140
gatgacaact ctccttcctt tatccaaatt cgctcagttg ccaagaagca tcctaaaact1200
tgggtacatt acattgctgc tgaagaggag gactgggact atgctccctt agtcctcgcc1260
cccgatgaca gaagttataa aagtcaatat ttgaacaatg gccctcagcg gattggtagg1320
aagtacaaaa aagtccgatt tatggcatac acagatgaaa cctttaagac tcgtgaagct1380
attcagcatg aatcaggaat cttgggacct ttactttatg gggaagttgg agacacactg1440
ttgattatat ttaagaatca agcaagcaga ccatataaca tctaccctca cggaatcact1500
gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt1560
ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca1620
actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga1680
gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa1740
agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag1800
aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg1860
cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt1920
tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc1980
attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa2040
atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg2100
atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc2160
atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac2220
agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc2280
ttctcccaga atccaccagt ctcaaaacac catcaaaggg aaataaccgt tactactctt2340
cagccagagg aagacaaatt tgagtatgat gacaccttct caattgaaat gaagagagaa2400
gattttgaca tctacggcga ctatgaaaat cagggcctcc gcagctttca aaagaaaaca2460
cgacactatt tcattgctgc agtggagcgt ctctgggatt atgggatgag tagatctccc2520
catatactaa gaaacagggc tcaaagtggg gatgtccagc agttcaagaa ggtggttttc2580
caggaattta ctgatggatc ctttactcag cccttatacc gtggagaact gaatgaacac2640
ttgggactct tggggccata tataagagca gaagttgaag acaatatcgt ggtaactttc2700
aaaaaccagg cctctcgtcc ctactccttc tattctagtc ttatttctta tgacgaagat2760
gagggacaag gagcagaacc tagaagaaag tttgtcaacc ctaatgaaac caaaatttac2820
ttttggaaag tgcagcatca tatggcaccc actaaagatg agtttgactg caaagcctgg2880
gcttattttt ctgatgttga tttggagaaa gatgtgcact caggcttgat tggacccctt2940
ctgatctgcc gcagtaacac actgaaccct gctcatggga gacaagtgac agtgcaggag3000
tttgccctgg ttttcactat attcgatgag actaagagct ggtacttcac tgaaaacctg3060
gaaaggaact gtagagctcc ctgcaatgtc cagaaggagg accctactct aaaagaaaac3120
ttccgcttcc atgcaatcaa cggctatgtg aaggatacac tccctggctt agtaatggct3180
caggatcaaa aggttcgatg gtatctgctc agcatgggca gcaacgaaaa cattcattcc3240
attcacttca gtggacatgt gttcactgta cggaaaaaag aggaatataa aatggcagtc3300
tacaacctct atccaggtgt ttttgagact gtggaaatgc taccatccca agttggaatc3360
tggcggatag aatgccttat cggcgagcac ctgcaagccg ggatgagcac tctgtttctg3420
gtgtacagca agaagtgtca gactccactg gggatggctt ccggacacat tagagatttt3480
cagattacag cttcaggaca atatggacag tgggccccaa agctggccag acttcattat3540
tccggatcaa tcaatgcctg gagcaccaag gatccctttt cctggatcaa ggtggatctc3600
ttggcaccga tgattattca cggcatcatg acccaggggg cccgccagaa gttctccagc3660
ctctacgtgt ctcagtttat catcatgtac agtctggatg gcaacaagtg gcacagttac3720
cgagggaatt ccacggggac cttaatggtc ttctttggca acgtggattc atctgggatc3780
aaacacaata tttttaaccc tccgattatt gctcagtaca tccgtttgca cccaacccat3840
tacagcatcc gcagcactct tcgcatggag ctcttgggct gtgacttcaa cagttgcagc3900
atgccgctgg ggatggagag taaagcaata tcagatgctc agatcactgc ctcgtcctac3960
ctaagcagta tgcttgccac ttggtctcct tcccaagccc ggctgcacct gcagggcagg4020
actaatgcct ggagacctca ggcaaataac ccaaaagagt ggctgcaagt ggacttccgg4080
aagaccatga aagtcacagg aataaccacc cagggggtga aatctctcct catcagcatg4140
tatgtgaagg agttcctcat ctccagtagt caagatggcc ataactggac tctgtttctt4200
cagaatggca aagtcaaggt cttccaggga aaccgggact cctccacgcc tgtgcggaac4260
gctctcgaac ccccgctggt ggctcgctac gtgcgcctgc acccgcagag ctgggcgcac4320
cacatcgccc tgaggctgga ggtcctgggc tgcgacaccc agcagcccgc ctga4374
<210>12
<211>1438
<212>PRT
<213>无信号肽的 hHC-cLC
<400>12
Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr
1 5 1015
Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro
202530
Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys
354045
Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro
505560
Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val
65707580
Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val
859095
Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val
115 120 125
Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn
130 135 140
Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser
145 150 155 160
His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu
165 170 175
Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu
180 185 190
His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp
195 200 205
His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser
210 215 220
Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg
225 230 235 240
Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His
245 250 255
Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu
260 265 270
Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile
275 280 285
Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly
290 295 300
Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg
325 330 335
Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp
340 345 350
Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe
355 360 365
Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His
370 375 380
Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu
385 390 395 400
Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro
405 410 415
Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr
420 425 430
Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile
435 440 445
Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile
450 455 460
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile
465 470 475 480
Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys
485 490 495
His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys
500 505 510
Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys
515 520 525
Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala
530 535 540
Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp
545 550 555 560
Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe
565 570 575
Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln
580 585 590
Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe
595 600 605
Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser
610 615 620
Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu
625 630 635 640
Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr
645 650 655
Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro
660 665 670
Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp
675 680 685
Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala
690 695 700
Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu
705 710 715 720
Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala
725 730 735
Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Ser Lys His His
740 745 750
Gln Arg Glu Ile Thr Val Thr Thr Leu Gln Pro Glu Glu Asp Lys Phe
755 760 765
Glu Tyr Asp Asp Thr Phe Ser Ile Glu Met Lys Arg Glu Asp Phe Asp
770 775 780
Ile Tyr Gly Asp Tyr Glu Asn Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gln Lys Lys
785 790 795 800
Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly
805 810 815
Met Ser Arg Ser Pro His Ile Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Asp
820 825 830
Val Gln Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser
835 840 845
Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu
850 855 860
Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Val Val Thr
865 870 875 880
Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile
885 890 895
Ser Tyr Asp Glu Asp Glu Gly Gln Gly Ala Glu Pro Arg Arg Lys Phe
900 905 910
Val Asn Pro Asn Glu Thr Lys Ile Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His
915 920 925
Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe
930 935 940
Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro
945 950 955 960
Leu Leu Ile Cys Arg Ser Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln
965 970 975
Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Val Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr
980 985 990
Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu AsnLeu Glu Arg Asn CysArg Ala Pro
995 1000 1005
Cys AsnVal Gln Lys Glu AspPro Thr Leu Lys GluAsn Phe Arg
1010 1015 1020
Phe HisAla Ile Asn Gly TyrVal Lys Asp Thr LeuPro Gly Leu
1025 1030 1035
Val MetAla Gln Asp Gln LysVal Arg Trp Tyr LeuLeu Ser Met
1040 1045 1050
Gly SerAsn Glu Asn Ile HisSer Ile His Phe SerGly His Val
1055 1060 1065
Phe ThrVal Arg Lys Lys GluGlu Tyr Lys Met AlaVal Tyr Asn
1070 1075 1080
Leu TyrPro Gly Val Phe GluThr Val Glu Met LeuPro Ser Gln
1085 1090 1095
Val GlyIle Trp Arg Ile GluCys Leu Ile Gly GluHis Leu Gln
1100 1105 1110
Ala GlyMet Ser Thr Leu PheLeu Val Tyr Ser LysLys Cys Gln
1115 1120 1125
Thr ProLeu Gly Met Ala SerGly His Ile Arg AspPhe Gln Ile
1130 1135 1140
Thr AlaSer Gly Gln Tyr GlyGln Trp Ala Pro LysLeu Ala Arg
1145 1150 1155
Leu HisTyr Ser Gly Ser IleAsn Ala Trp Ser ThrLys Asp Pro
1160 1165 1170
Phe SerTrp Ile Lys Val AspLeu Leu Ala Pro MetIle Ile His
1175 1180 1185
Gly IleMet Thr Gln Gly AlaArg Gln Lys Phe SerSer Leu Tyr
1190 1195 1200
Val SerGln Phe Ile Ile MetTyr Ser Leu Asp GlyAsn Lys Trp
1205 1210 1215
His SerTyr Arg Gly Asn SerThr Gly Thr Leu MetVal Phe Phe
1220 1225 1230
Gly AsnVal Asp Ser Ser GlyIle Lys His Asn IlePhe Asn Pro
1235 1240 1245
Pro IleIle Ala Gln Tyr IleArg Leu His Pro ThrHis Tyr Ser
1250 1255 1260
Ile ArgSer Thr Leu Arg MetGlu Leu Leu Gly CysAsp Phe Asn
1265 1270 1275
Ser CysSer Met Pro Leu GlyMet Glu Ser Lys AlaIle Ser Asp
1280 1285 1290
Ala GlnIle Thr Ala Ser SerTyr Leu Ser Ser MetLeu Ala Thr
1295 1300 1305
Trp SerPro Ser Gln Ala ArgLeu His Leu Gln GlyArg Thr Asn
1310 1315 1320
Ala TrpArg Pro Gln Ala AsnAsn Pro Lys Glu TrpLeu Gln Val
1325 1330 1335
Asp PheArg Lys Thr Met LysVal Thr Gly Ile ThrThr Gln Gly
1340 1345 1350
Val LysSer Leu Leu Ile SerMet Tyr Val Lys GluPhe Leu Ile
1355 1360 1365
Ser SerSer Gln Asp Gly HisAsn Trp Thr Leu PheLeu Gln Asn
1370 1375 1380
Gly LysVal Lys Val Phe GlnGly Asn Arg Asp SerSer Thr Pro
1385 1390 1395
Val ArgAsn Ala Leu Glu ProPro Leu Val Ala ArgTyr Val Arg
1400 1405 1410
Leu HisPro Gln Ser Trp AlaHis His Ile Ala LeuArg Leu Glu
1415 1420 1425
Val LeuGly Cys Asp Thr GlnGln Pro Ala
1430 1435
<210>13
<211>13
<212>PRT
<213>hHC-cLC 中的截短的B结构域
<400>13
Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Ser Lys His His Gln
1 5 10
<210>14
<211>693
<212>PRT
<213>hHC-cLC 中的犬 FVIII 轻链
<400>14
Pro Pro Val Ser Lys His His Gln Arg Glu Ile Thr Val Thr Thr Leu
1 5 1015
Gln Pro Glu Glu Asp Lys Phe Glu Tyr Asp Asp Thr Phe Ser Ile Glu
202530
Met Lys Arg Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Gly Asp Tyr Glu Asn Gln Gly
354045
Leu Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val
505560
Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Arg Ser Pro His Ile Leu Arg
65707580
Asn Arg Ala Gln Ser Gly Asp Val Gln Gln Phe Lys Lys Val Val Phe
859095
Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu
100 105 110
Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val
115 120 125
Glu Asp Asn Ile Val Val Thr Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr
130 135 140
Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Asp Glu Asp Glu Gly Gln Gly
145 150 155 160
Ala Glu Pro Arg Arg Lys Phe Val Asn Pro Asn Glu Thr Lys Ile Tyr
165 170 175
Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp
180 185 190
Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val
195 200 205
His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Arg Ser Asn Thr Leu
210 215 220
Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Val
225 230 235 240
Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Leu
245 250 255
Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Val Gln Lys Glu Asp Pro Thr
260 265 270
Leu Lys Glu Asn Phe Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Val Lys Asp
275 280 285
Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Lys Val Arg Trp Tyr
290 295 300
Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe Ser
305 310 315 320
Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Val
325 330 335
Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser
340 345 350
Gln Val Gly Ile Trp Arg Ile Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu Gln
355 360 365
Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Lys Lys Cys Gln Thr
370 375 380
Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala
385 390 395 400
Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr
405 410 415
Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Asp Pro Phe Ser Trp Ile
420 425 430
Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Met Thr Gln
435 440 445
Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Val Ser Gln Phe Ile Ile
450 455 460
Met Tyr Ser Leu Asp Gly Asn Lys Trp His Ser Tyr Arg Gly Asn Ser
465 470 475 480
Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile
485 490 495
Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Gln Tyr Ile Arg Leu
500 505 510
His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Leu
515 520 525
Gly Cys Asp Phe Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys
530 535 540
Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Ser Met
545 550 555 560
Leu Ala Thr Trp Ser Pro Ser Gln Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg
565 570 575
Thr Asn Ala Trp Arg Pro Gln Ala Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln
580 585 590
Val Asp Phe Arg Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Ile Thr Thr Gln Gly
595 600 605
Val Lys Ser Leu Leu Ile Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser
610 615 620
Ser Ser Gln Asp Gly His Asn Trp Thr Leu Phe Leu Gln Asn Gly Lys
625 630 635 640
Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Arg Asp Ser Ser Thr Pro Val Arg Asn
645 650 655
Ala Leu Glu Pro Pro Leu Val Ala Arg Tyr Val Arg Leu His Pro Gln
660 665 670
Ser Trp Ala His His Ile Ala Leu Arg Leu Glu Val Leu Gly Cys Asp
675 680 685
Thr Gln Gln Pro Ala
690
<210>15
<211>9618
<212>DNA
<213>pANG-CAG-hBDDF8
<400>15
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtgccaac tccatcacta 120
ggggttcctt gtagttaatg attaacccgc catgctactt atttacgtag ccatgctcta 180
ggtaccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca 240
ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta 300
tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta 360
tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat 420
cgctattacc atgtcgaggc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca 480
cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg 540
gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag 600
gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc 660
ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc gggagcaagc tctagccgcg 720
cggcgggcgg gagtcgctgc gcgctgcctt cgccccgtgc cccgctccgc cgccgcctcg 780
cgccgcccgc cccggctctg actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg gcgggacggc 840
ccttctcctc cgggctgtaa ttagcgcttg gtttaatgac ggcttgtttc ttttctgtgg 900
ctgcgtgaaa gccttgaggg gctccgggag ggccctttgt gcggggggag cggctcgggg 960
ctgtccgcgg ggggacggct gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg1020
gcgtgtgacc ggcggctcta gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct1080
acagctcctg ggcaacgtgc tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattgat1140
ccacactttt tctttttctc cacaggtatc gattccacca tgcaaataga gctctccacc1200
tgcttctttc tgtgcctttt gcgattctgc tttagtgcca ccagaagata ctacctgggt1260
gcagtggaac tgtcatggga ctatatgcaa agtgatctcg gtgagctgcc tgtggacgca1320
agatttcctc ctagagtgcc aaaatctttt ccattcaaca cctcagtcgt gtacaaaaag1380
actctgtttg tagaattcac ggatcacctt ttcaacatcg ctaagccaag gccaccctgg1440
atgggtctgc taggtcctac catccaggct gaggtttatg atacagtggt cattacactt1500
aagaacatgg cttcccatcc tgtcagtctt catgctgttg gtgtatccta ctggaaagct1560
tctgagggag ctgaatatga tgatcagacc agtcaaaggg agaaagaaga tgataaagtc1620
ttccctggtg gaagccatac atatgtctgg caggtcctga aagagaatgg tccaatggcc1680
tctgacccac tgtgccttac ctactcatat ctttctcatg tggacctggt aaaagacttg1740
aattcaggcc tcattggagc cctactagta tgtagagaag ggagtctggc caaggaaaag1800
acacagacct tgcacaaatt tatactactt tttgctgtat ttgatgaagg gaaaagttgg1860
cactcagaaa caaagaactc cttgatgcag gatagggatg ctgcatctgc tcgggcctgg1920
cctaaaatgc acacagtcaa tggttatgta aacaggtctc tgccaggtct gattggatgc1980
cacaggaaat cagtctattg gcatgtgatt ggaatgggca ccactcctga agtgcactca2040
atattcctcg aaggtcacac atttcttgtg aggaaccatc gccaggcgtc cttggaaatc2100
tcgccaataa ctttccttac tgctcaaaca ctcttgatgg accttggaca gtttctactg2160
ttttgtcata tctcttccca ccaacatgat ggcatggaag cttatgtcaa agtagacagc2220
tgtccagagg aaccccaact acgaatgaaa aataatgaag aagcggaaga ctatgatgat2280
gatcttactg attctgaaat ggatgtggtc aggtttgatg atgacaactc tccttccttt2340
atccaaattc gctcagttgc caagaagcat cctaaaactt gggtacatta cattgctgct2400
gaagaggagg actgggacta tgctccctta gtcctcgccc ccgatgacag aagttataaa2460
agtcaatatt tgaacaatgg ccctcagcgg attggtagga agtacaaaaa agtccgattt2520
atggcataca cagatgaaac ctttaagact cgtgaagcta ttcagcatga atcaggaatc2580
ttgggacctt tactttatgg ggaagttgga gacacactgt tgattatatt taagaatcaa2640
gcaagcagac catataacat ctaccctcac ggaatcactg atgtccgtcc tttgtattca2700
aggagattac caaaaggtgt aaaacatttg aaggattttc caattctgcc aggagaaata2760
ttcaaatata aatggacagt gactgtagaa gatgggccaa ctaaatcaga tcctcggtgc2820
ctgacccgct attactctag tttcgttaat atggagagag atctagcttc aggactcatt2880
ggccctctcc tcatctgcta caaagaatct gtagatcaaa gaggaaacca gataatgtca2940
gacaagagga atgtcatcct gttttctgta tttgatgaga accgaagctg gtacctcaca3000
gagaatatac aacgctttct ccccaatcca gctggagtgc agcttgagga tccagagttc3060
caagcctcca acatcatgca cagcatcaat ggctatgttt ttgatagttt gcagttgtca3120
gtttgtttgc atgaggtggc atactggtac attctaagca ttggagcaca gactgacttc3180
ctttctgtct tcttctctgg atataccttc aaacacaaaa tggtctatga agacacactc3240
accctattcc cattctcagg agaaactgtc ttcatgtcga tggaaaaccc aggtctatgg3300
attctggggt gccacaactc agactttcgg aacagaggca tgaccgcctt actgaaggtt3360
tctagttgtg acaagaacac tggtgattat tacgaggaca gttatgaaga tatttcagca3420
tacttgctga gtaaaaacaa tgccattgaa ccaagaagct tctcccagaa tccaccagtc3480
ttgaaacgcc atcaacgcga aataactcgt actactcttc agtcagatca agaggaaatt3540
gactatgatg ataccatatc agttgaaatg aagaaggaag attttgacat ttatgatgag3600
gatgaaaatc agagcccccg cagctttcaa aagaaaacac gacactattt tattgctgca3660
gtggagaggc tctgggatta tgggatgagt agctccccac atgttctaag aaacagggct3720
cagagtggca gtgtccctca gttcaagaaa gttgttttcc aggaatttac tgatggctcc3780
tttactcagc ccttataccg tggagaacta aatgaacatt tgggactcct ggggccatat3840
ataagagcag aagttgaaga taatatcatg gtaactttca gaaatcaggc ctctcgtccc3900
tattccttct attctagcct tatttcttat gaggaagatc agaggcaagg agcagaacct3960
agaaaaaact ttgtcaagcc taatgaaacc aaaacttact tttggaaagt gcaacatcat4020
atggcaccca ctaaagatga gtttgactgc aaagcctggg cttatttctc tgatgttgac4080
ctggaaaaag atgtgcactc aggcctgatt ggaccccttc tggtctgcca cactaacaca4140
ctgaaccctg ctcatgggag acaagtgaca gtacaggaat ttgctctgtt tttcaccatc4200
tttgatgaga ccaaaagctg gtacttcact gaaaatatgg aaagaaactg cagggctccc4260
tgcaatatcc agatggaaga tcccactttt aaagagaatt atcgcttcca tgcaatcaat4320
ggctacataa tggatacact acctggctta gtaatggctc aggatcaaag gattcgatgg4380
tatctgctca gcatgggcag caatgaaaac atccattcta ttcatttcag tggacatgtg4440
ttcactgtac gaaaaaaaga ggagtataaa atggcactgt acaatctcta tccaggtgtt4500
tttgagacag tggaaatgtt accatccaaa gctggaattt ggcgggtgga atgccttatt4560
ggcgagcatc tacatgctgg gatgagcaca ctttttctgg tgtacagcaa taagtgtcag4620
actcccctgg gaatggcttc tggacacatt agagattttc agattacagc ttcaggacaa4680
tatggacagt gggccccaaa gctggccaga cttcattatt ccggatcaat caatgcctgg4740
agcaccaagg agcccttttc ttggatcaag gtggatctgt tggcaccaat gattattcac4800
ggcatcaaga cccagggtgc ccgtcagaag ttctccagcc tctacatctc tcagtttatc4860
atcatgtata gtcttgatgg gaagaagtgg cagacttatc gaggaaattc cactggaacc4920
ttaatggtct tctttggcaa tgtggattca tctgggataa aacacaatat ttttaaccct4980
ccaattattg ctcgatacat ccgtttgcac ccaactcatt atagcattcg cagcactctt5040
cgcatggagt tgatgggctg tgatttaaat agttgcagca tgccattggg aatggagagt5100
aaagcaatat cagatgcaca gattactgct tcatcctact ttaccaatat gtttgccacc5160
tggtctcctt caaaagctcg acttcacctc caagggagga gtaatgcctg gagacctcag5220
gtgaataatc caaaagagtg gctgcaagtg gacttccaga agacaatgaa agtcacagga5280
gtaactactc agggagtaaa atctctgctt accagcatgt atgtgaagga gttcctcatc5340
tccagcagtc aagatggcca tcagtggact ctcttttttc agaatggcaa agtaaaggtt5400
tttcagggaa atcaagactc cttcacacct gtggtgaact ctctagaccc accgttactg5460
actcgctacc ttcgaattca cccccagagt tgggtgcacc agattgccct gaggatggag5520
gttctgggct gcgaggcaca ggacctctac tgactcgaga ataaaagatc agagctctag5580
agatctgtgt gttggttttt tgtgtgcggc cgggatctga ggaaccccta gtgatggagt5640
tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgcccgggca aagcccgggc5700
gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag tgagcgagcg agcgcgcaga gagggagtgg5760
ccaacccccc cccccccccc cctgcaggcg attctcttgt ttgctccaga ctctcaggca5820
atgacctgat agcctttgta gagacctctc aaaaatagct accctctccg gcatgaattt5880
atcagctaga acggttgaat atcatattga tggtgatttg actgtctccg gcctttctca5940
cccgtttgaa tctttaccta cacattactc aggcattgca tttaaaatat atgagggttc6000
taaaaatttt tatccttgcg ttgaaataaa ggcttctccc gcaaaagtat tacagggtca6060
taatgttttt ggtacaaccg atttagcttt atgctctgag gctttattgc ttaattttgc6120
taattctttg ccttgcctgt atgatttatt ggatgttgga attcctgatg cggtattttc6180
tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg cactctcagt acaatctgct6240
ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac6300
gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca6360
tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac6420
gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt6480
ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt6540
atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta6600
tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg6660
tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac6720
gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg6780
aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc6840
gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg6900
ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat6960
gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg7020
gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg7080
atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc7140
ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt7200
cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct7260
cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc7320
gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca7380
cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct7440
cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt7500
taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga7560
ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca7620
aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac7680
caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg7740
taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag7800
gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac7860
cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt7920
taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg7980
agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc8040
ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc8100
gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc8160
acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa8220
acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt8280
tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg8340
ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag8400
agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagaattc8460
ccatcatcaa taatatacct tattttggat tgaagccaat atgataatga gggggtggag8520
tttgtgacgt ggcgcggggc gtgggaacgg ggcgggtgac gtagtagtct ctagaggtcc8580
ccagcgacct tgacgggcat ctgcccggca tttctgacag ctttgtgaac tgggtggccg8640
agaaggaatg ggagttgccg ccagattctg acatggatct gaatctgatt gagcaggcac8700
ccctgaccgt ggccgagaag ctgcatcgct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc8760
gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggcg attccgttgc aatggctggc8820
ggtaatattg ttctggatat taccagcaag gccgatagtt tgagttcttc tactcaggca8880
agtgatgtta ttactaatca aagaagtatt gcgacaacgg ttaatttgcg tgatggacag8940
actcttttac tcggtggcct cactgattat aaaaacactt ctcaggattc tggcgtaccg9000
ttcctgtcta aaatcccttt aatcggcctc ctgtttagct cccgctctga ttctaacgag9060
gaaagcacgt tatacgtgct cgtcaaagca accatagtac gcgccctgta gcggcgcatt9120
aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc9180
gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggcg aacgtggcga9240
gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt gtagcggtca9300
cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc gcgtcccatt9360
cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac9420
gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt9480
cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgaattagg ttaattaagg cacacccgcc9540
gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg caactgttgg9600
gaagggcgat cggtgcgg9618
<210>16
<211>791
<212>PRT
<213>图2中的 hBDDF8 序列
<400>16
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 1015
Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
202530
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
354045
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
505560
Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile
65707580
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
859095
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu
755 760 765
Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln
770 775 780
Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp
785 790
<210>17
<211>791
<212>PRT
<213>图2中的具有取代的 hBDDF8 序列
<400>17
Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe
1 5 1015
Cys Phe Ser Lys Val Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser
202530
Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg
354045
Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Leu Pro Phe Asn Thr Ser Val Val
505560
Tyr Lys Lys Thr Val Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Val
65707580
Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln
859095
Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser
100 105 110
His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser
115 120 125
Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp
130 135 140
Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu
145 150 155 160
Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser
165 170 175
Tyr Phe Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile
180 185 190
Gly Ala Leu Leu Val Cys Lys Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr
195 200 205
Gln Thr Leu Gln Lys Phe Val Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly
210 215 220
Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr
245 250 255
Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Lys Lys Ser Val
260 265 270
Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile
275 280 285
Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser
290 295 300
Leu Glu Ile Ser Pro Val Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Phe Leu Met
305 310 315 320
Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Pro Ser His Gln His
325 330 335
Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro
340 345 350
Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp
355 360 365
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Ser Phe Asp Asp Asp Asn Ser
370 375 380
Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr
385 390 395 400
Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro
405 410 415
Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn
420 425 430
Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met
435 440 445
Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu
450 455 460
Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu
465 470 475 480
Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro
485 490 495
His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys
500 505 510
Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe
515 520 525
Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp
530 535 540
Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg
545 550 555 560
Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu
565 570 575
Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val
580 585 590
Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu
595 600 605
Asn Met Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp
610 615 620
Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val
625 630 635 640
Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp
645 650 655
Tyr Ile Leu Ser Val Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe
660 665 670
Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr
675 680 685
Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro
690 695 700
Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly
705 710 715 720
Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp
725 730 735
Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys
740 745 750
Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu
755 760 765
Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln
770 775 780
Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp
785 790
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aaagct 8106
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