一种蒙古鲌卵母细胞冷冻保存的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及生物材料/组织冷冻保存领域，尤其是一种卵母细胞冷冻保存方法。

背景技术

冷冻保存是在超低温下长期保存生物配子的技术，可以减少遗传漂变，保持活跃的繁殖群体，为保护种质资源提供一种方案。由于母体遗传的存在，母本基因组在种质资源保护中十分重要，卵母细胞的冷冻保存将提高物种的保护效率。目前常用的冷冻保存方法包括慢速冷冻法和玻璃化冷冻法。鱼类卵母细胞体积大、卵膜通透性差、卵黄含量多、对抗冻剂毒性敏感等特点，导致鱼类卵母细胞的冻存成为研究的难点问题。Lujic使用3mol/LDMSO和3mol/L PG的玻璃化溶液冷冻保存海鳟鱼幼鱼卵巢组织，获得卵母细胞存活率高达40％；曹俊国发现在水貂GⅤ期卵母细胞玻璃化冷冻及体外成熟过程中添加10-9mol/L的褪黑素，能够提高卵母细胞的冷冻保存效率。鱼类是脊椎动物中种类最多的一类，不同鱼的卵母细胞形态结构有很大的差异，其对低温和毒性的敏感性也不同，而目前蒙古鲌卵母细胞的冷冻保存技术尚未有研究。

David M Rawson等人于2010年发表的论文《Cryopreservation of zebrafish(Danio rerio)oocytes by vitrification》研究了斑马鱼卵母细胞冷冻保存的稀释液、抗冻剂、保存容器，并总结出一种较优的斑马鱼卵母细胞冷冻保存的方法：稀释液为一种包含KCl的溶液，具体配方未公开；抗冻剂配方为3M二甲基亚砜(DMSO)，2M甲醇(MeOH)，2M丙二醇(PG)；保存容器采用CryoLogic公司的CVA65冷冻钩和0.25mL麦管。具体操作流程为：(1)采集三期斑马鱼卵母细胞，放于稀释液中；(2)在ES1(1M DMSO，1M MeOH，0.75M PG)中平衡15min，再转移至ES2(2M DMSO，2M MeOH，1.5M PG)中平衡10分钟，最后转移至抗冻剂中平衡5min；(3)转移至CVA65冷冻钩中，并迅速插入液氮保存；(4)10min后取出在26±1℃水浴解冻，转移至ES2或0.5M蔗糖中，然后经过四步平衡到稀释液中；(5)使用台盼蓝检测存活率。该方法使用CVA65冷冻钩保存的卵母细胞存活率在解冻后30min可达到68.5±7.2％。该研究中使用相同配方与流程但采用0.25mL麦管保存的卵母细胞存活率则为48.3±4.6％。

对于David M Rawson斑马鱼卵母细胞这种冷冻保存方法，其不足之处在于，(1)由于鱼类卵母细胞在物种间存在较大的性状差异，在经济鱼类中往往不可行；(2)由于采用的CryoLogic公司的CVA65冷冻钩每次只能保存一枚卵母细胞，但是鱼类属于卵生生物，每次产卵量极大，鱼类卵母细胞的冷冻保存往往需要大量保存，在生产实践中使用不具有可行性；冷冻钩与冷冻环等保存单个生殖细胞的容器由于其保存体积极小，导热能力远强于麦管、冷冻管等容器，所以价格高昂、使用繁琐的冷冻钩无法满足需要；(3)由于玻璃化冷冻需要保持溶液处于液态与固体之间的玻璃态，对保存环境的变化较为敏感，长期保存过程中容易逐渐出现结晶，导致存活率下降甚至保存失败，所以此方法对于卵母细胞的冷冻保存时间仅为10min,未实现长期冷冻保存，对于卵母细胞的存活率具有较大的影响。

因此，需要对现有方法加以改进，提供一种能够改善冷冻保存效果的方法和试剂，使鱼类卵母细胞能够在采用麦管为容器的情况下，也能够实现长期冷冻保存并提高存活率，同时使用方便。

发明内容

针对现有技术缺乏针对蒙古鲌的卵母细胞的冷冻保存技术的问题，本发明提供一种蒙古鲌的卵母细胞冷冻保存方法。

一种蒙古鲌卵母细胞冷冻保存的方法，包括如下步骤：

(1)分散后的蒙古鲌卵母细胞先后在平衡液一和平衡液二中，分别平衡8-12min；

(2)转移到冷冻保护剂中，分装至冻存容器，插入液氮保存；

所述平衡液一含有50-60mM氯化钾、50-60mM醋酸钾、0.5-1.5mM氯化镁、5-15mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾盐、0.5-1.5M二甲基亚砜、0.5-1.0M甲醇、0.5-1.0M丙二醇和0.1-0.5mM褪黑素；

所述平衡液二含有50-60mM氯化钾、50-60mM醋酸钾、0.5-1.5mM氯化镁、5-15mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾盐、1.5-2.5M二甲基亚砜、1.0-2.0M甲醇、1.0-2.0M丙二醇，0.5-1.0mM褪黑素；

所述的冷冻保护剂含有50-60mM氯化钾、50-60mM醋酸钾、0.5-1.5mM氯化镁、5-15mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾盐、2.5-3.5M二甲基亚砜、1.5-2.5M甲醇、1.5-2.5M丙二醇和0.5-1.5mM褪黑素；

作为优选，所述平衡液一含有53-57mM氯化钾、53-57mM醋酸钾、0.8-1.2mM氯化镁、8-12mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾盐、0.9-1.1M二甲基亚砜、0.66-0.67M甲醇、0.66-0.67M丙二醇，0.33mM-0.34mM褪黑素；

作为优选，所述平衡液二含有53-57mM氯化钾、53-57mM醋酸钾、0.8-1.2mM氯化镁、8-12mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾盐、1.9-2.1M二甲基亚砜、1.33-1.34M甲醇、1.33-1.34M丙二醇，0.66-0.67mM褪黑素；

更优选，所述的冷冻保护剂含有53-57mM氯化钾、53-57mM醋酸钾、0.8-1.2mM氯化镁、8-12mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾盐、3M二甲基亚砜、2M甲醇、2M丙二醇和1mM褪黑素。更优选，所述平衡液二ES2，包括55mM氯化钾、55mM醋酸钾、1mM氯化镁、10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾盐、1.9-2.1M二甲基亚砜、1.33-1.34M甲醇、1.33-1.34M丙二醇，0.66-0.67mM褪黑素；

在本发明的一个更优选方式中，所述平衡液一ES1含有55mM氯化钾、55mM醋酸钾、1mM氯化镁、10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾盐、1M二甲基亚砜、0.66-0.67M甲醇、0.66-0.67M丙二醇，0.33-0.34mM褪黑素；所述平衡液二ES2含有55mM氯化钾、55mM醋酸钾、1mM氯化镁、10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾盐、2M二甲基亚砜、1.33-1.34M甲醇、1.33-1.34M丙二醇，0.66-0.67mM褪黑素；所述冷冻保护剂含有55mM氯化钾、55mM醋酸钾、1mM氯化镁、10mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾盐、3M二甲基亚砜、2M甲醇、2M丙二醇和1mM褪黑素。

作为优选，所述冷冻保存方法中使用的冻存容器为麦管。每支麦管可保存5-10枚蒙古鲌卵母细胞。

本发明还提供了一种蒙古鲌卵母细胞冷冻保存试剂，包括稀释液和冷冻保护剂(CPA)中的至少一种。

所述冷冻保护剂含有50-60mM氯化钾、50-60mM醋酸钾、0.5-1.5mM氯化镁、5-15mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾盐、2.5-3.5M二甲基亚砜、1.5-2.5M甲醇、1.5-2.5M丙二醇，0.5-1.5mM褪黑素。

所述稀释液，含有50-60mM氯化钾、50-60mM醋酸钾、0.5-1.5mM氯化镁、5-15mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾盐。

作为优选，所述冷冻保护液(CPA)，含有55mM氯化钾、55mM醋酸钾、1mM氯化镁、10mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾盐、3M二甲基亚砜、2M甲醇、2M丙二醇，1mM褪黑素。

作为优选，所述稀释液，含有55mM氯化钾、55mM醋酸钾、1mM氯化镁、10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾盐。

使用时可以用稀释液和冷冻保护剂混合，分别配制平衡液一和平衡液二。

将稀释液和冷冻保护剂CPA按1.8-2.4：1体积比混合，可以配制平衡液一；优选的，稀释液和冷冻保护剂CPA按2：1体积比混合，配制平衡液一。

将稀释液和冷冻保护剂CPA按1：2体积比混合，可以配制平衡液二；优选的，稀释液和冷冻保护剂CPA按1：2体积比混合，配制平衡液二。

采用上述方法将蒙古鲌卵母细胞冷冻保存后，进行解冻的方法包括如下步骤：冷冻的蒙古鲌卵母细胞在室温下静置8-12s，38-42℃解冻，转移至0.4-0.6mol/L蔗糖溶液中，室温平衡8-12min后，再转移至0.15-0.35mol/L蔗糖溶液中，室温平衡8-12min，最后转移至稀释液中。

进一步优选，蒙古鲌的卵母细胞在室温下静置9-11s，39-41℃解冻，依次转移至0.45-0.55mol/L和0.2-0.3mol/L蔗糖溶液中，室温平衡9-11min。

在本发明的一个更优选方式中，蒙古鲌卵母细胞在室温下静置时间为10s，解冻温度40℃，依次转移至0.5mol/L和0.25mol/L蔗糖溶液中，室温平衡均为10min。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种蒙古鲌的卵母细胞冷冻保存方法，采用多种溶剂和抗氧化剂褪黑素混合的冷冻保存液的配方，在达到玻璃化所需的高浓度有机溶剂的同时，降低了单一有机溶剂的毒性，减少了细胞受到的毒性损伤和在冷冻保存过程中的主要伤害之一的氧化损伤；在冷冻保存和解冻过程均采用三步法平衡，降低了卵母细胞在高渗溶液与低渗溶液间转移时受到的机械损伤，提升了冷冻保存效果。本方法可实现卵母细胞的长时间保存，保存7天后存活率达到63.08±2.50％；保存30天后存活率达到53.23±3.07％，使发明能够在生产实践中具有应用价值。

本发明提供了一种新的蒙古鲌卵母细胞冷冻保存试剂，方便平衡液的配制，可用于蒙古鲌卵母细胞冷冻保存及后续解冻，并且有效提高卵母细胞冷冻保存的存活率。

本发明可以采用麦管作为冷冻保存容器，每支麦管可保存5-10枚蒙古鲌卵母细胞，成本较低、操作便捷，使发明适用于鱼类种质保存的生产需要。

附图说明

图1为蒙古鲌卵母细胞冷冻保存7天后台盼蓝染色图片

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例及对比例作详细说明：

实施例1

使用本发明的蒙古鲌卵母细胞冷冻保存技术，保存卵母细胞并检测存活情况，具体如下：

步骤1)稀释液的配制，溶剂为ddH

表1稀释液的成分配比

步骤2)：冷冻保护剂(CPA)的配制，溶剂为步骤1)配制的稀释液，溶质添加顺序无特别要求，配方如表2：

表2冷冻保护剂(CPA)的成分配比

步骤3)：平衡液ES1与ES2的配制，将步骤2)配制的CPA与步骤1配制的稀释液按照1:2的比例混合，得到三分之一CPA浓度的平衡液一ES1；将步骤2)配制的CPA与步骤1配制的稀释液按照2:1的比例混合，得到三分之二CPA浓度的平衡液二ES2。

步骤4)：在蒙古鲌繁殖期捞取雌性成年蒙古鲌，解剖蒙古鲌取出卵巢，在步骤1配制的稀释液中将Ⅲ期卵母细胞分离成单个。

步骤5)：将蒙古鲌卵母细胞转移至平衡液一ES1中，平衡10min后再转移到平衡液二ES2中平衡10min，最后转移到冷冻保护剂CPA中。

步骤6)：将CPA中的卵母细胞分装至0.25mL麦管中，每支麦管装5-10枚卵母细胞，然后迅速插入液氮中保存。

通过上述方法将蒙古鲌卵母细胞冷冻保存7天及30天后，按照以下方法进行解冻并体外复苏：

a)从液氮中取出保存有蒙古鲌卵母细胞的麦管，在空气中静置10s后迅速插入40℃水浴锅中解冻。

b)将解冻后的卵母细胞转移至0.5mol/L蔗糖溶液中，室温平衡10min后，再转移至0.25mol/L蔗糖溶液中，室温平衡10min，最后转移至表1的稀释液中。

解冻后的蒙古鲌卵母细胞，可使用0.4％台盼蓝溶液检测卵母细胞的存活率。方法为：将解冻后的蒙古鲌卵母细胞转移至干净的培养皿中，吸尽稀释液，加入0.4％台盼蓝染液，室温孵育2min后，吸取台盼蓝染液，观察卵母细胞形态，内部透明未被染色的即为存活细胞，计算存活率。

蒙古鲌卵母细胞冷冻保存7天后解冻，台盼蓝染色结果如图1。图中红框中卵母细胞内部透明，台盼蓝未渗入细胞内，为存活状态；蓝框内卵母细胞内部呈深蓝色，台盼蓝已渗入细胞内，为死亡状态。

冻存7天及30天的蒙古鲌卵母细胞解冻后经过体外复苏，存活率如表3和表4所示。

表3实施例1蒙古鲌卵母细胞冷冻保存7天后解冻存活率结果

表4实施例1蒙古鲌卵母细胞冷冻保存30天后解冻存活率结果

对比例1

本对比例冷冻保护剂(CPA)以步骤1配制的稀释液(KCl buffer)为溶剂，溶质添加顺序无特别要求，配方a和b分别为表5和表6。

表5对比例1使用冷冻保护剂(CPA)的配方a

表6对比例1中冷冻保护剂(CPA)的配方b

除冷冻保护剂的配方，其余实施例1。

在该对比例中，我们通过本发明的蒙古鲌卵母细胞冷冻保存的方法，成功冻存斑马鱼卵母细胞，且斑马鱼卵母细胞冻存7天，解冻后经过体外复苏，存活率如下表7和表8所示：

表7冷冻保护剂配方a冷冻保存7天后解冻存活率结果

表8冷冻保护剂配方b冷冻保存7天后解冻存活率结果