人IL-18突变体及其应用

技术领域

本发明涉及蛋白质工程技术领域，具体涉及一种人IL-18突变体及其应用。

背景技术

白细胞介素18(IL-18)，又名干扰素γ诱导因子，是一种促炎性细胞因子，在人类中由IL18基因编码；IL-18由巨噬细胞和其它细胞分泌产生，可以调节先天性和适应性免疫，其失调可引起自身免疫或炎症性疾病。

人体中IL-18的检测需要制备高亲和力和高纯度的单克隆抗体；其中，为了获取高纯度的单克隆抗体一般需要对单克隆抗体进行纯化，单克隆抗体纯化方式主要是采用偶联IL-18抗原的亲和层析柱、Protein A柱和Protein G柱等进行处理。

目前，亲和层析柱、Protein A柱和Protein G柱进行IL-18单克隆抗体纯化各有优劣；其中，Protein A柱、Protein G柱纯化单克隆抗体虽然收率较高，但相对纯度较低；偶联IL-18抗原的亲和层析柱纯化的单克隆抗体，虽然特异性好，纯度相对较高，但由于偶联IL-18抗原的亲和层析柱与抗体结合力强，对抗体的洗脱非常困难，收率较低。

基于上述分析，发明人认为，在亲和层析柱纯化技术上，如何找到一种与IL-18单克隆抗体低亲和力的IL-18突变体，以及如何提高亲和层析柱对IL-18单克隆抗体的纯化收率，是本领域的技术人员急需解决的技术问题。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

针对上述技术问题，本发明实施例提供了一种人IL-18突变体及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

本发明提供了以下技术方案：

一种人IL-18突变体，突变位点为L29R。

优选的，所述人IL-18突变体为氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，碱基序列如SEQID NO:2所示的IL-18的突变体。

一种人IL-18突变体，所述人IL-18突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

一种人IL-18突变体，所述人IL-18突变体的碱基序列如SEQ ID NO:4所示。

一种构建如上述所述IL-18突变体的引物对，其上游引物核苷酸序列如SEQ IDNo:5所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ ID No:6所示。

一种如上述所述的IL-18突变体在抗体制备中的应用。

优选的，所述IL-18突变体用于制备亲和层析柱。

优选的，所述IL-18突变体在亲和层析柱中作为抗原。

优选的，所述IL-18突变体偶联在亲和层析柱中的载体上。

优选的，所述载体为琼脂糖凝胶颗粒。

本发明实施例提供的一种人IL-18突变体及其应用，具有以下有益效果：本发明提供了一种IL-18突变体，蛋白结构发生改变，其降低了与IL-18单克隆抗体的亲和力；本发明将IL-18突变体偶联到亲和层析柱中的载体上，使得IL-18单克隆抗体更容易洗脱分离，制备了一种具有较高回收率和较高回收纯度的亲和层析柱。

附图说明

图1是IL-18突变体蛋白纯度分析结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下，所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。以下实施例中所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可以从商业途径获得。

本发明方案的设计原理是：

根据已有IL-18序列信息，对IL-18氨基酸序列进行分析，筛选出对IL-18构象有明显影响的氨基酸位点，并通过引物设计对相应位点通过定向突变技术进行氨基酸突变，使IL-18蛋白构象发生变化，从而影响IL-18与抗体的结合力；

实验通过对IL-18蛋白突变，经过大量筛选，确定了C端的L29R突变位点能引起IL-18抗原与抗体亲和力的减弱，从而促成本发明；同时，为了更好的验证IL-18蛋白突变位点的可行性，具体做了以下相关实验。

实施例1IL-18基因突变库的构建

IL-18抗原(购自上海友科生物科技有限公司，人工合成)的氨基酸序列如表SEQID No:1所示，即：YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFI ISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHD NKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED；

其碱基序列如表SEQ ID No:2所示，即：TACTTTGGCAAGCTTGAATCTAAATTAT CAGTCATAAGAAATTTGAATGACCAAGTTCTCTTCATTGACCAAGGAAATCGGCCTCTATTTGAAGATATGACTGATTCTGACTGTAGAGATAATGCACCCCGGACCATATTTATTATAAGTATGTATAAAGATAGCCAGCCTAGAGGTATGGCTGTAACTATCTCTGTGAAGTGTGAGAAAATTTCAACTCTCTCCTGTGAGAACAAAATTATTTCCTTTAAGGAAATGAATCCTCCTGATAACATCAAGGATACAAAAAGTGACATCATATTCTTTCAGAGAAGTGTCCCAGGACATGATAATAAGATGCAATTTGAATCTTCATCATACGAAGGATACTTTCTAGCTTGTGAAAAAGAGAGAGACCTTTTTAAACTCATTTTGAAAAAAGAGGATGAATTGGGGGATAGATCTATAATGTTCACTGTTCAAAACGAAGACTAG。

通过定向进化技术对该蛋白进行了大量突变的筛选，优化并构建了IL-18突变体的引物对：

上游引物如序列表SEQ ID No:5所述，即：

5’-GGAATTCGGATCCTACTTTGGCAAGCTTGAAT-3’；

下游引物如序列表SEQ ID No:6所述，即：

5’-ACGCCTCGAGCTAGTCTTCGTTTTGAACAGTG-3’。

实施例2IL-18突变体表达菌株的构建和发酵

1、以IL-18基因为模板，使用上述引物，加入2×TransStart FastPfu PCRSuperMix扩增整个质粒基因。PCR反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸5min，30个循环后，72℃充分延伸10min，4℃保存。PCR结束后加入DMT酶消化体外降解非突变型质粒模板，胶回收目的基因。

2、将胶回收突变体基因和pET-28a载体用BamHI和XhoI酶切后暴露出相同的末端，T4连接酶室温连接，转化DMT感受态细胞中，涂布LB+Kan平板，37℃过夜培养。次日，筛选得到重组菌株。

3、从培养平板挑取单克隆菌落接种到10ml LB+Kan培养基中，37℃培养后，提取质粒，送测序公司检测。

4、检测成功的质粒转化到BL21(DE3)感受态中，涂布LB+Kan平板，37℃过夜培养。挑取单克隆菌落接种到接种到5ml LB+Kan培养基中，37℃培养后接种到500ml LB+Kan培养基中，37℃扩大培养至OD

IL-18突变体蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No:3所示，IL-18突变体蛋白的突变位点为L29R，即：

YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPRFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQP RGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSS YEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED；

该IL-18突变体蛋白的编码基因序列如序列表SEQ ID No:4所示，即：TACTTTGGCAAGCTTGAATCTAAATTATCAGTCATAAGAAATTTGAATGACCAAGTTCTCTTCATTGACCAAGGAAATCGGCCTCGATTTGAAGATATGACTGATTCTGACTGTAGAGATAATGCACCCCGGACCATATTTATTATAAGTATGTATAAAGATAGCCAGCCTAGAGGTATGGCTGTAACTATCTCTGTGAAGTGTGAGAAAATTTCAACTCTCTCCTGTGAGAACAAAATTATTTCCTTTAAGGAAATGAATCCTCCTGATAACATCAAGGATACAAAAAGTGACATCATATTCTTTCAGAGAAGTGTCCCAGGACATGATAATAAGATGCAATTTGAATCTTCATCATACGAAGGATACTTTCTAGCTTGTGAAAAAGAGAGAGACCTTTTTAAACTCATTTTGAAAAAAGAGGATGAATTGGGGGATAGATCTATAATGTTCACTGTTCAAAACGAAGACTAG。

实施例3IL-18突变体纯化

缓冲液A:50mM PBS，500mM NaCl

缓冲液B:50mM PBS，500mMNaCl，500mM imidazole

1、诱导表达后的菌液8000rpm离心5min，缓冲液A重悬菌体，超声破碎30min后12000rpm离心30min收集上清液。

2、将上清液加入到Ni-NTA中结合1h，使用缓冲液A和缓冲液B配制咪唑浓度为10mM，20mM，50mM，200mM缓冲液分步洗脱目的蛋白。

3、启动蠕动泵，流速30rpm，同时打开蛋白检测仪，用各种梯度的缓冲液冲至检测仪基线至平稳。

4、收集各种梯度洗脱的蛋白样品，并取少量样品制备SDS-PAGE所需要的样品。

5、收集目的蛋白并浓缩换液，测定蛋白浓度。

实施例4IL-18突变体亲和柱偶联工艺及使用方法

1、偶联

1.1、活化sepharose 4b树脂

称取1.00g的sepharose4b树脂于烧杯中，加入50mL的1mM盐酸室温下溶胀5min，转入抽滤瓶抽滤后，直接加50mL的1mM盐酸，室温浸没5min后再抽滤，反复共5次；(少量多次)加入15-20mL的1mM盐酸将树脂吸取转入小三角瓶准备偶联；其中，sepharose4b树脂是一种琼脂糖凝胶。

1.2、突变体蛋白准备

将IL-18突变体蛋白换液至100mM NaHCO3，pH8.3，500mM NaCl中，浓度10mg/mL。

1.3、偶联突变体

上述步骤1.1中小三角瓶中让树脂自然沉降后吸取上清，再将瓶子倾斜后用200μL枪吸取上清；

加入前处理过的突变体，补加1mL的NaHCO3缓冲液，25℃下50rpm摇床上振荡1-2h。

1.4、测定蛋白浓度

偶联体转入离心管中8000rpm 4℃下离心10min后取上清，计量体积和检测蛋白含量。计算偶联率。

1.5、抗原偶联体清洗处理

用50mL的0.1M碳酸氢钠(pH8.3，含0.5M的氯化钠)冲洗偶联体于抽滤瓶中；抽滤后，再用碳酸氢钠50mL冲洗一遍；抽滤后，加入0.1M的pH8的Tris-HCl缓冲液100mL，将抽滤瓶下端用保鲜膜堵好，使其室温下浸泡封闭2h。

封闭之后用抽滤掉封闭液，用0.1M的pH4的醋酸钠-醋酸缓冲液和0.1M的pH8的Tris-HCl(含0.5M的氯化钠)缓冲液各50mL轮换冲洗，再抽滤，反复四次。最后加入50mL的0.02M的pH8.0的PBS洗涤、抽滤，反复3次。

1.6、装柱

用10mL 0.02M的PBS混匀，取出来装柱；自然沉淀后，拧紧柱子；进0.02M的pH7.4的PBS冲洗，检查是否遗漏。

装柱前可以取0.1mL偶联体重悬液，进行BCA测定，沉淀中显示较深的蓝色，说明抗原在偶联和封闭、冲洗时均为正常偶联。

实施例5IL-18抗体纯化方法的比较

人IL-18蛋白刺激小鼠，杂交瘤细胞，收集腹水，纯化抗体等步骤，制备得到IL-18单克隆抗体，根据IL-18抗体的特点，从抗体纯度、回收率、稳定性等为出发点，设计并验证了三套实验方法，并对纯化方案做了相关比较。

方法(1)：protein G亲和层析柱纯化IL-18抗体

方法(2)：IL-18抗原亲和层析柱纯化IL-18抗体

方法(3)：IL-18抗原突变体亲和层析柱纯化IL-18抗体

1.1平衡：用20mL纯水清洗protein G层析柱、IL-18抗原亲和柱、IL-18抗原突变体亲和柱，再用20mL结合缓冲液(0.02M PBS，pH8.0)以1mL/min的速度冲洗三种层析柱。

1.2上样：样品用结合缓冲液稀释5倍，用0.22um除菌器除菌。用注射器上样，收集穿透液。

1.3洗脱：用结合缓冲液冲洗柱子至蛋白检测仪基线不变，弃流出液。用洗脱缓冲液(0.1M glycine-HCl，pH＝2.8)冲洗柱子至蛋白检测仪基线不变，并收集流出液(即洗脱液)。目的蛋白洗脱液进行SDS-PAGE和Western-Blot，Bandscan扫描分析抗体纯度。

一、单克隆抗体亲和常数测定

亲和常数表示抗体与抗原结合的紧密程度，是确定抗体性质的重要参数之一，同时也是单克隆抗体稳定性的重要指标。三种方法洗脱的目的蛋白经过SDS-PAGE和Western-Blot验证后进行浓度测定。

二、非竞争ELISA测定mAb的相对亲和常数

实验步骤如下：

①分别以20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL三种浓度的人源IL-18蛋白包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜；

②洗板，PBST 200μL/孔，洗涤3次，5min/次；

③封闭：用3％的BSA作为封闭液，110μL/孔，37℃保温孵育2h；

④洗板：同②；

⑤一抗：加入梯度稀释的单克隆抗体，100μL/孔，37℃保温孵育2h；

⑥洗板：同②；

⑦二抗：1：3000稀释酶标二抗，100μL/孔，37℃保温孵育45min；

⑧洗板：同②；

⑨显色：加入底物使用液，100μL/孔，37℃保温避光显色10min；

⑩终止：每孔加入50μL终止液，450nm处测Abs值。

三、单克隆抗体稳定性实验

同样采用间接ELISA测定冻存前和冻存3个月后抗体与抗原的结合力，测定OD

分析结果：

(1)IL-18抗原突变体的纯度分析，如图1所示，经过Bandscan扫描分析软件，IL-18抗原突变体纯度大于95％。

(2)三种抗体纯化方法的比较：

表1三种抗体纯化方法的比较

表1说明三种纯化方法均能获得有活性的IL-18抗体，其中，protein G亲和层析纯化的抗体纯度和活性偏低；IL-18抗原亲和层析纯化的抗体回收率低；IL-18抗原突变体亲和层析纯化活性和回收率都高，IL-18抗原突变体且相对于IL-18抗原亲和层析纯化来说，IL-18抗原突变体亲和层析纯化具有更低的亲和常数值，表现出了与抗体更低的亲和性。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。