一种ECM paper支架的简易制备及其应用

技术领域

本发明属于医疗材料技术领域，具体涉及一种ECM paper支架的简易制备及其应用。

背景技术

脱细胞ECM(细胞外基质，extracellular matrix)作为一种生物材料，因具有生理性功能和微结构及含有促进细胞生长的蛋白及生长因子等生物活性物质而被广泛的应用于组织工程中，继而促进细胞迁移、增殖、分化及功能的表达。目前应用的ECM生物材料主要有来源于动物组织、器官的脱细胞ECM以及细胞培养源性的脱细胞ECM。然而在应用研究中发现，动物组织或器官源性的脱细胞ECM存在批次间差异、组成成分复杂、不稳定性且具有较强的免疫原性、病毒携带的风险及来源的局限性等因素，极大程度上限制了动物组织或器官源性的脱细胞ECM在组织工程中的应用。而细胞源性的脱细胞ECM在培养过程中可通过体外规模性、调控性培养实现批次、成分稳定的脱细胞ECM生产，且可实现较小的免疫原性及规避病毒携带的风险。

干细胞治疗作为再生医学中的一种有效的治疗方法，是广泛损伤和退行性疾病潜在的治疗方案。目前研究表明干细胞治疗在临床上具有广泛的应用前景。然而其治疗效果仍存在局限性，因为目前的干细胞注射治疗无法使植入的细胞长时间汇集于特定的植入部位，并且需要大量细胞的植入方可达到治疗的效果。因此基于其局限性，生物材料作为细胞递送载体被应用干细胞治疗中，通过生物材料促进细胞附着、增殖，继而将细胞递送并长时间汇聚于植入部位，并且促进植入细胞迁移、增殖、分化及功能表达等。而作为细胞递送载体的生物材料须具有优良的生物相容性、机械性能、较低的免疫原性及维持并促进细胞迁移及功能表达等。基于脱细胞ECM优良的细胞相容性、低免疫原性及可调控的机械性能，其可作为细胞递送载体的理想生物材料，促进细胞植入及迁移、增殖、分化及功能表达。

然而利用生物材料作为细胞递送载体目前仍面临着一定的困难。如生物材料上培养的细胞是先于材料表面生长，后逐渐迁移进入材料内部，为达到理想的生物材料-细胞体的构建其需要较长的构建周期，因此不利于其应用。而且基于生物材料基体的细胞培养，材料自身的微结构、孔隙率、材料大小及厚度等均能影响材料内部氧气及营养物质的渗入，继而影响材料内部细胞的生存及生长；而且生物材料构建的单一基体也无法模拟生物组织多层的生理结构，因此构建理想的生物材料-细胞体需要设计尺寸恰当及具有合理微结构及孔隙率的材料，方可有效促进氧气、营养物质透过材料促进材料内部细胞的生存、生长，继而利于实现仿生多层结构三维组织的构建，达到更好贴合不同损伤组织部位并植入细胞促进组织损伤的修复治疗。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现状及现有技术中存在的技术问题之一。

本发明第一方面的目的，在于提供一种ECM paper支架。

本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的ECM paper支架的制备方法。

本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的ECM paper支架和/或本发明第二方面的制备方法在制备组织代替物中的应用。

本发明第四方面的目的，在于提供本发明第一方面的ECM paper支架和/或本发明第二方面的制备方法在细胞培养中的应用。

本发明第五方面的目的，在于提供本发明第一方面的ECM paper支架和/或本发明第二方面的制备方法在制备组织修复的产品中的应用。

本发明第六方面的目的，在于提供一种产品。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种ECM paper支架，由包括以下原料制得：脱细胞ECM和六氟异丙醇。

在本发明一些实施方式中，所述脱细胞ECM与六氟异丙醇的质量体积比为(7～20):1。

在本发明一些实施方式中，所述脱细胞ECM与六氟异丙醇的质量体积比为(7～15):1。

在本发明一些实施方式中，所述脱细胞ECM与六氟异丙醇的质量体积比为(10～15):1。

在本发明一些实施方式中，所述脱细胞ECM包括细胞源性脱细胞ECM或组织源性脱细胞ECM。

在本发明一些实施方式中，所述ECM paper为圆形、正方形或长方形等不同形状中的任意一种。

在本发明一些实施方式中，所述ECM paper大小为0.787～2.362mg/cm

本发明的第二个方面，提供本发明第一方面的ECM paper支架的制备方法，包括以下步骤：脱细胞ECM与六氟异丙醇混合，固化成型，即得到ECM paper支架。

在本发明一些实施方式中，所述混合的时间为15～40h。

在本发明一些实施方式中，所述混合的时间为18～36h。

在本发明一些实施方式中，所述混合的时间为20～30h。

在本发明一些实施方式中，所述脱细胞ECM来源于干细胞、成纤维细胞和肿瘤细胞的任意一种。

在本发明一些实施方式中，所述脱细胞ECM的制备方法为将细胞消化、重悬贴壁培养后，使用分化培养基进行分化培养成原始内胚层样细胞；原始内胚层样细胞经氨水进行脱细胞处理，即得到脱细胞ECM。

在本发明一些实施方式中，所述固化成型包括但不限于采用如下方法进行，将脱细胞ECM与六氟异丙醇的混合液注入模具，晾干，脱模，即可。

在本发明一些实施方式中，所述模具的材质包括但不限于硅胶或聚四氟乙烯等疏水材料。

在本发明一些实施方式中，所述模具是由硅胶或聚四氟乙烯等疏水材料制备的基底和上部中空的柱体组成。

在本发明一些实施方式中，所述上部中空的柱体的形状可为圆形、正方形或长方形等不同形状中的任意一种。

在本发明一些实施方式中，所述晾干的时长为2～6h。

本发明的第三个方面，提供本发明第一方面的ECM paper支架和/或本发明第二方面的制备方法在(1)～(4)中任一项中的应用：

(1)制备组织代替物；

(2)药物筛选；

(3)病例模型研究；

(4)体外3D组织模型。

本发明的第四个方面，提供本发明第一方面的ECM paper支架和/或本发明第二方面的制备方法在(5)～(8)中任一项中的应用：

(5)细胞培养；

(6)制备培养细胞的产品；

(7)促进细胞功能表达；

(8)制备促进细胞功能表达的产品。

在本发明一些实施方式中，所述细胞包括干细胞、成纤维细胞、上皮细胞、肌细胞、肿瘤细胞、软骨细胞、骨细胞、肾小球系膜细胞和内皮细胞等。

本发明的第五个方面，提供本发明第一方面的ECM paper支架和/或本发明第二方面的制备方法在(9)～(10)中任一项中的应用：

(9)组织修复；

(10)制备组织修复的产品。

本发明的第六个方面，在于提供一种包括本发明第一方面的ECM paper支架的产品。

在本发明一些实施方式中，所述产品包括但不限于试剂、试剂盒、组织代替物。

在本发明一些实施方式中，所述产品的作用包括药物筛选、培养细胞、促进细胞功能表达。

本发明的有益效果是：

本发明提供的ECM paper支架存在不同深度的凹陷褶皱，同时也可见有明显的贯穿凹孔，具有较好的溶胀率、亲水性以及渗透性，且组织状态稳定性较高。细胞(如HUVECs)在ECM paper支架上能实现快速地粘附，并可见明显的触角粘附于ECM paper支架上，并能很好地延伸、铺展，促进细胞的增殖，有效促进细胞功能表达(如促进HUVECs NO的分泌)，有效地促进营养物质及氧气的深入内部渗出，促进细胞生长。

本发明提供的ECM paper支架可作为一种理想的种子细胞载体用于干细胞治疗研究以及可以结合细胞和ECM paper支架构建多层结构的体外3D组织模型用于类器官相关研究。

本发明提供的ECM paper支架的制备方法，操作简单、周期短、成本低廉，可以实现量化及批量生产(批次间ECM paper结构稳定)。

附图说明

图1为不同ECM浓度和不同溶解时间对ECM paper制备影响的检测结果图。

图2为本发明ECM paper制备流程图及宏观和微观结构；其中，A为ECM paper支架制备的具体流程，B为制备的圆形ECM paper支架，C为制备的ECM paper支架的表面形貌。

图3不同溶解时间对ECM paper凹孔形成的影响的检测结果图。

图4为不同批次ECM paper表面形貌及蛋白成分的检测结果图。

图5为ECM paper支架亲疏水性检测；其中，A为ECM paper支架的溶胀率检测，B为ECM paper支架的稳定性检测，C为ECM paper支架的接触角检测。

图6为ECM paper支架细胞粘附、增殖检测；其中，A为细胞粘附结果，B为荧光染色结果，C为CCK8检测结果。

图7为ECM paper支架促进内皮细胞功能表达的检测结果图。

图8为ECM paper渗透性检测结果图。

具体实施方式

现结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。

本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。

F9细胞分化培养并提取脱细胞ECM的具体过程如下：

(1)将小鼠畸胎瘤细胞(F9细胞)复苏、扩增培养：将F9细胞加入完全培养基中(以高糖DMEM为基础培养液，双抗占培养液体积为1％、FBS占培养液体积为10％)，37℃培养30h；

(2)将步骤(1)细胞消化(加入1mL消化液(0.25％Trypsin-0.53mM EDTA)置于室温下消化1min)，800rpm离心5min后弃去上清，加5mL含10％血清的完全培养基进行重悬细胞和计数；

(3)将步骤(2)中计数的细胞按4.5×10

(4)将步骤(3)培养基替换为分化培养基(以DMEM(高糖，4g/L)为基础培养液，其中，双抗占培养液体积为1％、FBS占培养液体积为10％、全反式维甲酸的浓度为0.1μM及联丁酰-环磷酸腺苷的浓度为250μM)，对F9细胞进行分化培养3天，形成原始内胚层样细胞；

(5)将步骤(4)培养所得的原始内胚层样细胞经去离子水清洗2遍，加入浓度为25mM的氨水，细胞置于4℃脱色摇床上下摇摆进行脱细胞处理1h；

(6)将步骤(5)脱细胞处理后的细胞样品置于透析袋(1000D)中，于去离子水中室温(约25℃)搅拌24h，中途换水5～10次；

(7)将步骤(6)水洗后的细胞样品-80℃冷冻干燥制得含层粘连蛋白和胶原IV脱细胞外基质，即脱细胞ECM。

实施例1

一种ECM paper支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)F9细胞分化培养并提取脱细胞ECM；

(2)将20mg步骤(1)中F9分化的脱细胞ECM加入到2mL六氟异丙醇(HFIP，Macklin,H811026，99.5％)溶液中；

(3)将步骤(2)混有脱细胞ECM的HFIP溶液于室温(25℃，下同)下搅拌24h促进ECM溶解，得到溶液；

(4)吸取400uL步骤(3)的溶液滴入ECM paper支架制备模型(中空硅胶圆柱体，内径直径为1.85cm)，于室温下自然晾干3h；

(5)将步骤(4)晾干的ECM paper支架从模型中脱模，即得到ECM paper支架。

实施例2

一种ECM paper支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)F9细胞分化培养并提取脱细胞ECM；

(2)将20mg步骤(1)中F9分化的脱细胞ECM加入到2mL六氟异丙醇(HFIP，Macklin,H811026，99.5％)溶液中；

(3)将步骤(2)混有脱细胞ECM的HFIP溶液于室温(25℃，下同)下搅拌30h促进ECM溶解，得到溶液；

(4)吸取400uL步骤(3)的溶液滴入ECM paper支架制备模型(中空硅胶圆柱体，内径直径为1.85cm)，于室温下自然晾干3h；

(5)将步骤(4)晾干的ECM paper支架从模型中脱模，即得到ECM paper支架。

实施例3

一种ECM paper支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)F9细胞分化培养并提取脱细胞ECM；

(2)将16mg步骤(1)中F9分化的脱细胞ECM加入到2mL六氟异丙醇(HFIP，Macklin,H811026，99.5％)溶液中；

(3)将步骤(2)混有脱细胞ECM的HFIP溶液于室温(25℃，下同)下搅拌24h促进ECM溶解，得到溶液；

(4)吸取400uL步骤(3)的溶液滴入ECM paper支架制备模型(中空硅胶圆柱体，内径直径为1.85cm)，于室温下自然晾干3h；

(5)将步骤(4)晾干的ECM paper支架从模型中脱模，即得到ECM paper支架。

实施例4

一种ECM paper支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)F9细胞分化培养并提取脱细胞ECM；

(2)将30mg步骤(1)中F9分化的脱细胞ECM加入到2mL六氟异丙醇(HFIP，Macklin,H811026，99.5％)溶液中；

(3)将步骤(2)混有脱细胞ECM的HFIP溶液于室温(25℃，下同)下搅拌24h促进ECM溶解，得到溶液；

(4)吸取400uL步骤(3)的溶液滴入ECM paper支架制备模型(中空硅胶圆柱体，内径直径为1.85cm)，于室温下自然晾干3h；

(5)将步骤(4)晾干的ECM paper支架从模型中脱模，即得到ECM paper支架。

实施例5

一种ECM paper支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)F9细胞分化培养并提取脱细胞ECM；

(2)将30mg步骤(1)中F9分化的脱细胞ECM加入到2mL六氟异丙醇(HFIP，Macklin,H811026，99.5％)溶液中；

(3)将步骤(2)混有脱细胞ECM的HFIP溶液于室温(25℃，下同)下搅拌30h促进ECM溶解，得到溶液；

(4)吸取400uL步骤(3)的溶液滴入ECM paper支架制备模型(中空硅胶圆柱体，内径直径为1.85cm)，于室温下自然晾干3h；

(5)将步骤(4)晾干的ECM paper支架从模型中脱模，即得到ECM paper支架。

实施例6

一种ECM paper支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)F9细胞分化培养并提取脱细胞ECM；

(2)将5mg步骤(1)中F9分化的脱细胞ECM加入到2mL六氟异丙醇(HFIP，Macklin,H811026，99.5％)溶液中；

(3)将步骤(2)混有脱细胞ECM的HFIP溶液于室温(25℃，下同)下搅拌24h促进ECM溶解，得到溶液；

(4)吸取400uL步骤(3)的溶液滴入ECM paper支架制备模型(中空硅胶圆柱体，内径直径为1.85cm)，于室温下自然晾干3h；

(5)将步骤(4)晾干的ECM paper支架从模型中脱模，即得到ECM paper支架。

实施例7

一种ECM paper支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)F9细胞分化培养并提取脱细胞ECM；

(2)将10mg步骤(1)中F9分化的脱细胞ECM加入到2mL六氟异丙醇(HFIP，Macklin,H811026，99.5％)溶液中；

(3)将步骤(2)混有脱细胞ECM的HFIP溶液于室温下搅拌24h促进ECM溶解，得到溶液；

(4)吸取400uL步骤(3)的溶液滴入ECM paper支架制备模型(中空硅胶圆柱体，内径直径为1.85cm)，于室温下自然晾干3h；

(5)将步骤(4)晾干的ECM paper支架从模型中脱模，即得到ECM paper支架。

实施例8

一种ECM paper支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)F9细胞分化培养并提取脱细胞ECM；

(2)将20mg步骤(1)中F9分化的脱细胞ECM加入到2mL六氟异丙醇(HFIP，Macklin,H811026，99.5％)溶液中；

(3)将步骤(2)混有脱细胞ECM的HFIP溶液于室温下搅拌6h促进ECM溶解，得到溶液；

(4)吸取400uL步骤(3)的溶液滴入ECM paper支架制备模型(中空硅胶圆柱体，内径直径为1.85cm)，于室温下自然晾干3h；

(5)将步骤(4)晾干的ECM paper支架从模型中脱模，即得到ECM paper支架。

实施例9

一种ECM paper支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)F9细胞分化培养并提取脱细胞ECM；

(2)将20mg步骤(1)中F9分化的脱细胞ECM加入到2mL六氟异丙醇(HFIP，Macklin,H811026，99.5％)溶液中；

(3)将步骤(2)混有脱细胞ECM的HFIP溶液于室温(25℃，下同)下搅拌12h促进ECM溶解，得到溶液；

(4)吸取400uL步骤(3)的溶液滴入ECM paper支架制备模型(中空硅胶圆柱体，内径直径为1.85cm)，于室温下自然晾干3h；

(5)将步骤(4)晾干的ECM paper支架从模型中脱模，即得到ECM paper支架。

效果实施例

1.ECM溶液的浓度对制备ECM paper支架的影响

通过比较实施例1、实施例6以及实施例7的ECM paper支架，由图1可以看出，2.5mg/mL的ECM溶液(实施例6)无法制备成功ECM paper，5mg/mL的ECM溶液(实施例7)可制备成膜，但无法制备完整的ECM paper，而10mg/mL的ECM溶液(实施例1)可成功制备出完整的ECM paper，表明ECM溶液的浓度能够影响ECM paper的成功制备，是ECM paper成功制备的一个影响因素。

2.ECM溶解时间对制备ECM paper支架的影响

通过比较实施例1、实施例8以及实施例9的ECM paper支架，由于ECM溶解时间不同，当ECM溶解时间为6h(实施例8)和12h(实施例9)时，虽然能促进成膜，但无法促进整体完整且无破损的ECM paper的制备，而溶解24h(实施例1)的ECM能够促进完整且无破损的ECMpaper的制备(图1)，表明不同溶解时间能够影响ECM paper的成功制备，是ECM paper成功制备的一个影响因素。

3.ECM paper支架进行形貌检测

对实施例1制备得到的ECM Paper支架进行拍照；并将制备的ECM Paper支架裁剪成方形，将方形ECM paper粘附在贴有导电胶的载物台，并置于离子溅射仪中进行真空喷金溅射60s，溅射后将制备样品置于扫描电子显微镜中进行表面形貌观察并拍照。

结果如图2所示，实施例1制备的ECM paper支架的表面具有褶皱，而且存在不同深度的凹孔，有的可贯穿整个ECM paper支架。

4.ECM paper支架进行凹孔检测

将实施例1以及对比例3和对比例4制备得到的ECM Paper支架裁剪成方形，喷金后使用扫描电子显微镜观测其表面凹孔情况。

结果如图3所示，6h(对比例3)和12h(对比例4)溶解的ECM溶液制备的ECM paper可见不同深度的凹陷褶皱，未见有明显的贯穿凹孔存在；而24h(实施例1)溶解的ECM溶液制备的ECM paper可见有不同深度的凹陷褶皱，同时也可见有明显的贯穿凹孔，均匀分布于ECMpaper上，表明ECM的充分溶解促进ECM paper凹孔形成。

5.不同批次制备得到的ECM paper的成分及形貌检测

按实施例1制备方法制备得到不同批次的ECM paper支架，并将其裁剪成方形，喷金后使用扫描电子显微镜观测其表面形貌。同时将裁减的ECM paper支架进行免疫荧光染色(大致步骤如下：1)ECM paper用PBS清洗2遍；2)2％牛血清白蛋白25℃封闭30min；3)Collagen IV和Laminin蛋白一抗25℃孵育2h；4)PBS清洗4遍，每遍5min；5)二抗AlexaFluor 488标记山羊抗兔IgG(H+L)(碧云天，A0423，1:500)25℃孵育1h；6)PBS清洗4遍，每遍5min；7)荧光显微镜观察并拍照)。

结果如图4所示，显示相同制备条件下，不同批次间制备的ECM paper表面具有相似的结构，均具有褶皱，且存在不同深度的凹孔，有的可贯穿整个ECM paper支架；CollagenIV和Laminin荧光染色显示不同批次间的ECM paper具有相似强度的荧光染色，以上结果表明在保障相同制备条件下，批次间ECM paper结构稳定，同时Collagen IV和Laminin蛋白成分保存较多且相对稳定，保障了批次间ECM paper的稳定性。

6.ECM paper支架的溶胀率检测

对实施例1制备得到的ECM paper支架进行溶胀率的检测，检测过程如下：

称取ECM paper支架干重(m

结果显示，1h后ECM paper支架的溶胀率达到189％，浸泡24h，溶胀率与1h没有显著性差异，为192.6％(图5中A)，表明ECM paper支架溶胀较快的且维持相对稳定。

7.ECM paper支架进行支架稳定性的评估

对实施例1制备得到的ECM paper支架进行支架稳定性的评估，具体如下：

称取实施例1制备的ECM paper支架干重(m

实验结果显示，浸泡1～7天，ECM paper支架在PBS中逐渐降解，第10天后，ECMpaper支架的降解达到相对稳定(图5中B)。需要注意的是，虽然图中第10天ECM paper支架降解率比第7天略高，这是因为检测存在一定的误差，这是实验所能接受的，且通过统计学比较发现差异无统计学意义。

8.ECM paper支架进行亲水性检测

对实施例1制备得到的ECM paper支架进行亲水性检测，具体如下：

将ECM paper支架进行裁剪成小方形并平铺于载玻片上，置于接触角测量仪上测量ECM paper支架水滴接触角的大小。

结果显示水滴接触ECM paper支架后，接触角的大小在5s内迅速减小至30°左右，并且在60s内降至20°左右(图5中C)。

9.ECM paper支架在细胞培养中的应用

将实施例1中制备得到的ECM paper支架浸泡于75％酒精消毒30min；移除酒精，并用无菌1×PBS清洗ECM paper支架两遍；将清洗后的ECM paper支架在湿润状态下置于紫外光下照射30min；然后浸泡于无菌1×PBS液体中，于4℃中浸泡2天；同时，将人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)复苏、扩增培养，并经0.25％胰酶消化、离心、重悬并计数；将HUVECs按5×10

免疫荧光：将ECM paper支架及control上粘附24h的HUVECs于显微镜下拍照，并将粘附的细胞进行骨架蛋白F-actin染色并拍照。步骤为：1)对control及ECM paper的HUVECs进行PBS清洗3遍；2)3.7％多聚甲醛固定10min；3)PBS清洗3遍；4)0.1％ Triton X-100PBS细胞破膜10min；5)PBS清洗3遍；6)Actin-Tracker Red-Rhodamine(微丝红色荧光探针，碧云天，C2207S)染色20min；7)PBS清洗2遍；8)DAPI染色5min；9)PBS清洗，荧光显微镜观察并拍照。

CCK8：在ECM paper支架上培养HUVECs细胞，并于1天、3天、5天、7天和10天使用CCK8试剂盒(GLPBIO，GK10001)检测细胞增殖情况，步骤为：首先吸除培养基，并对细胞进行PBS清洗2遍，重新加入新的培养基，每孔200μL，同时加入20μL CCK-8试剂，混匀后细胞于培养箱中孵育1小时，后吸出培养液于96孔板，酶标仪450nm检测，测量OD值大小并计算。control亦采用相同的方式进行检测。

NO分泌检测：提取HUVECs细胞在ECM paper支架上培养1天、3天、5天、7天、10天和14天的上清液，并使用NO检测试剂盒(碧云天，S0021S)检测细胞NO分泌情况，步骤为：1)相应时间点吸取24h细胞培养上清并经1000rpm离心1min；2)试剂盒标准品梯度浓度稀释；3)标准品及样品各吸取50μL加入96孔板；4)每孔加入50μL试剂盒Griess I试剂；5)每孔加入50μL试剂盒Griess II试剂，混匀；6)酶标仪540nm测取吸光度；7)依据标准样品计算样品NO分泌浓度。control亦采用相同的方式进行检测。

结果如图6所示，相对于培养皿上的粘附，HUVECs在ECM paper支架上的也能实现快速的粘附，并可见明显的触角粘附于ECM paper支架上(图6中A黑色和红色箭头所示)；荧光染色结果进一步表明在ECM paper支架上的细胞具有更多的触角促进细胞在ECM paper支架上粘附，而且在ECM paper支架上粘附的细胞具有更大的细胞面积形态，表明细胞在ECM paper支架上能够更好地延伸、铺展(图6中B)。CCK8结果显示，细胞在ECM paper支架上培养时，1～7天内细胞明显逐渐增殖，7天后细胞增殖相对稳定(图6中B)，与control存在显著性差异(P＜0.05)。NO分泌检测结果显示，在培养1、3、10和14天，ECM paper支架上培养能够促进HUVECs NO的分泌，表明ECM paper支架促进HUVECs功能的表达(图7)。

10.ECM paper支架的渗透性检测

对实施例1制备得到的ECM paper支架进行渗透性检测，具体如下：

将实施例1中制备的ECM paper支架固定或双层层叠并置于滤纸上；吸取20μL PBS滴于ECM paper支架中心，观察PBS渗透情况。

结果如图8所示，单层ECM paper可见水滴快速地透过ECM paper并浸湿滤纸，双层层叠的ECM paper也可见滴入的水滴透过双层ECM paper并浸湿滤纸，表明制备的ECMpaper具有优良的渗透性，在应用于3D组织构建中能够有效地促进营养物质及氧气的深入内部渗出，促进细胞生长。

实施例2～5制备的ECM paper支架与实施例1的ECM paper支架在形貌以及所具备的特性均无明显区别，由于篇幅原因，就不一一说明。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。