一株乳酸乳球菌及其在草莓藤条发酵中的应用

技术领域

本发明属于乳酸菌发酵技术领域，具体涉及一株乳酸乳球菌及其在草莓藤条发酵中的应用。

背景技术

青贮饲料(Silage)是将新鲜的青饲料在厌氧条件下经乳酸菌发酵而形成的一类多汁、耐贮、营养丰富的饲料，可突破时间限制，更是反刍动物越冬饲料的重要保证，青贮(Ensile)过程中乳酸菌代谢产生大量乳酸、乙酸、甲酸等有机酸形成酸性环境，使青贮体系pH快速降低至4.0左右，抑制其他微生物的活动，同时产生乳酸链球菌素(Nisin)、ε-聚赖氨酸(ε-poly-lysine，ε-PL)、苯乳酸(Phenyllactic acid，PLA)等拮抗代谢物，抑制腐败和致病菌生长，并提高青贮饲料的营养品质。

我国草莓种植量巨大，仅仅安徽省长丰县就种植草莓超20万亩，年产量超60万吨，每年采摘草莓后剩余的草莓藤条是可利用的宝贵生物资源。目前，草莓藤条饲料利用化较低，在优质粗饲料资源如此紧张情况下，将草莓藤条青贮后将缓解一部分优质粗饲料不足的状况。

经过研究发现废弃的草莓藤条中含有大量的单宁、槲皮素等抑菌物质，同时，草莓藤条富集了种植过程中的农药，发酵试验发现，由于单宁和药残均影响细菌的繁殖，一般的乳酸菌难以适应草莓藤条发酵环境。

单宁,又称为鞣酸或鞣质,是广泛存在于植物体内的一类多元酚化合物,是植物进化过程中由碳水化合物代谢衍生出来的一种自身保护性物质,是植物与环境相互作用的产物，是一种抗营养因子。植物大量的单宁存在会影响动物适口性，同时，会抑制乳酸菌的活性，降低草莓藤条的青贮效果。

苯醚甲环唑是一种在草莓种植中常用的杂环类杀菌剂农药，易溶于有机溶剂，但降解缓慢，容易在植物中残留超标。以国标GB 23200.49-2016标准检测草莓藤条苯醚甲环唑含量，结果显示草莓藤条青贮前鲜样约为0.25mg/Kg。

青贮是以乳酸菌为主导的厌氧发酵过程。可提高饲草的消化利用率，改善饲草的适口性，减少饲草的营养损失。草莓藤条因其高浓度单宁含量和苯醚甲环唑等广谱抑菌物质，不利于制备青贮饲料。因此，至今未发现有用草莓藤条发酵制备青贮饲料的相关报道。

发明内容

本发明的目的提供一种乳酸乳球菌，该菌株为在MRS培养基上观察的周围均匀，平整光滑，呈乳白色圆形菌落，最适生长温度37℃，最高生长温度45-47℃。

该菌株已于2022年11月03日保藏于在中国典型培养物保藏中心，该乳酸乳球菌的保藏号为：CCTCC No：M20221722，拉丁名：Lactococcus lactisAll6，地址：湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，电话：027-68754052。其菌落状态和革兰氏染色图见图1。

其中，所述乳酸乳球菌用于在具有单宁和苯醚甲环唑的环境中生长和发酵。

其中，所述单宁的浓度为0.05～0.4g/L。

其中，所述苯醚甲环唑的浓度为0.25～1mg/L。

所述乳酸乳球菌用于含有单宁和苯醚甲环唑的草莓藤条发酵中，并将草莓藤条制备成青贮饲料。

同时，本发明还提供一种草莓藤条青贮饲料的制备方法，包括在草莓藤条中添加乳酸乳球菌All6发酵，所述乳酸乳球菌保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCCNo:M20221722。

其中，所述乳酸乳球菌All6的接种量是2.5×10

有益效果

本发明分离出来一株耐单宁和苯醚甲环唑的乳酸乳球菌，该乳酸乳球菌可以快速适应单宁和苯醚甲环唑的环境，并进入对数期生长，而且能抑制杂菌，保证发酵过程不受杂菌干扰。与此同时，本发明保藏的乳酸菌还可以显著降低草莓藤条中苯醚甲环唑的含量，根据检测，草莓藤条经过青贮后，其苯醚甲环唑的含量下降到0.13mg/kg，很显然降低了苯醚甲环唑的含量，对于动物的健康也有很大的好处。本发明的保藏的乳酸乳球菌也是对人体和动物体有益的菌株，通过发酵观察不产生有害物质，也提高了草莓藤条的营养价值，具有很好的实用性，对于草莓藤条的在利用有很高的实用性，同时降低了苯醚甲环唑的含量，具有很高的商业价值。

因此，利用从草莓藤条中分离的耐单宁的乳酸菌，将有利于草莓藤条青贮pH迅速下降，从而提高草莓藤条的青贮品质。

本发明是从草莓藤条中分离出的乳酸乳球菌，对粉碎后的草莓藤条青贮环境适应良好，在草莓藤条粉碎后释放出的高浓度单宁环境下耐受较好，快速降低草莓藤条的pH。该菌在草莓藤条的青贮中使用有利于草莓藤条青贮品质的提升。

附图说明

图1为本发明的乳酸乳球菌生长状况图。

图2为本发明乳酸乳球菌对苯醚甲环唑耐受生长情况图。

图3本发明乳酸乳球菌对单宁耐受生长情况图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明进行详细说明。所有方法及技术，如无特别说明，均为常规方法和技术。

本发明中，本试验所用的是从草莓藤条中分离出来的。试剂：单宁酸购至上海麦克林生化科技有限公司，其他试剂均为分析纯或更高纯度。

MRS肉汤培养基：青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

实施例1

本实施例提供一种乳酸乳球菌All6(Lactococcus lactisAll6)，于2022年11月03日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC No：M20221722。保藏中心的地址：湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，电话：027-68754052。

保藏的乳酸乳球菌All6在MRS培养基上观察的周围均匀，平整光滑，呈乳白色圆形菌落。

菌种的鉴定：取稳定期菌液进行基因组DNA提取，以基因组DNA为模板对其16SrDNA序列进行PCR扩增，采用细菌16S rDNA通用引物，序列为：27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT，PCR扩增体系20uL:20uL:5×FastPfu Buffer 4μL,2.5mmol/L dNTPs 2μL,上游引物(5μmol/L)0.8μL,下游引物(5μmol/L)0.8μL,DNA模板10ng，FastPfuPolymerase 0.4μL，用ddH

由于同一种、属间细菌的16S rDNA序列直接具有高度的保守性，所以16S rDNA序列的同源性分析通常被用作细菌之间的系统分类。通过16S rDNA分析，All6被鉴定为Lactococcus lactis(L.lactis)。该菌株的16S rDNA序列的Blast结果和GenBank登录号如表1所示。

表1：B1菌株16S rDNA序列分类鉴定

实施例2

本实施例提供乳酸乳球菌All6在苯醚甲环唑的环境的生长情况，具体如下：

首先，菌株All6对苯醚甲环唑耐受效果测定方法如下：取生长稳定的菌液，于5000r/min离心机内离心2分钟，将菌体沉淀用无菌PBS溶液洗涤三次，再加无菌生理盐水重悬，调整菌液浓度至OD＝0.800,吸取上述菌液各2.5mL分别添加至苯醚甲环唑浓度为0.25mg/L、0.5mg/L和10mg/L的50mL无菌苯醚甲环唑溶液中，在转速为150r/min的摇床中作用30min后取10uL菌液进行平板培养并进行活菌计数。

表2：菌株All6在苯醚甲环唑耐受性

实施例3

本实施例提供乳酸乳球菌All6在高单宁环境的生长情况，具体如下：

首先，菌株All6对单宁耐受效果测定方法如下：取生长稳定的菌液，于5000r/min离心机内离心2分钟，将菌体沉淀用无菌PBS溶液洗涤三次，再加无菌生理盐水重悬，调整菌液浓度至OD＝0.800,吸取上述菌液各2.5mL分别添加至单宁浓度为0.05g/L、0.1g/L和0.2g/L的50mL无菌单宁溶液中，在转速为150r/min的摇床中作用30min后取10uL菌液进行平板培养并进行活菌计数。

表3：菌株ALL6在单宁中耐受性

实施例4

根据本发明保藏的乳酸菌的特性，刚好可以用于草莓藤条青贮饲料的发酵，由于草莓藤条中含有大量的单宁，并且农残也富集了苯醚甲环唑，青贮饲料是一类饲料，由含水分多的植物性饲料经过密封、利用乳酸菌厌氧发酵后而成，主要用于喂养反刍动物。青贮草莓藤条比新鲜饲料耐储存，且营养成分优于草莓藤条干草。

草莓藤条青贮：取草莓藤条切短为2-3cm后混匀，乳酸乳球菌All6添加量为2.5×10

青贮前后检测单宁和苯醚甲环唑草莓藤条处理：将草莓藤条剪切至2-3厘米后，置于真空冷冻干燥机中，在真空度100Pa，功率1400W，–60℃条件下，干燥24h，冰上磨粉，过100目筛，得到草莓藤条冻干粉。按料液比1∶20(g∶mL)加入草莓藤条冻干粉和去离子水，在常温(20℃)，60Hz条件下超声辅助浸提0.5h后，于8000r/min离心10min，离心处理2次，取黄绿色上清液用孔径为0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。

采用Folin-ciocalte比色法测定单宁含量。经三次重复测定每千克草莓藤条总单宁含量为163.36±1.58毫克/克。

经过检测，苯醚甲环唑，是一种在草莓种植中常用的杂环类杀菌剂农药，易溶于有机溶剂，但降解缓慢，容易在植物中残留超标。以国标GB 23200.49-2016标准检测草莓藤条苯醚甲环唑含量，结果显示草莓藤条青贮前鲜样为0.25mg/Kg。

在草莓藤条中，传统乳酸菌无法生长或者生长缓慢，无法保证青贮饲料的安全稳定性，但本发明利用耐受单宁和苯醚甲环唑的乳酸菌对草莓藤条进行青贮发酵，获得优质草莓藤条青贮饲料。

采用MRS平板进行乳酸菌计数，将接种好的平板置于37℃、厌氧环境中培养3d后计菌落数；采用酸度计法测定青贮饲料pH；采用凯氏定氮法测定青贮饲料中的氨态氮(NH4

通过微生物量、营养品质、感官评分三个维度来评价本发明保藏的芽孢杆菌对青贮饲料品质的影响从而确定其对青贮熟料的氧稳定性的影响，结果如表4和表5所示。

表4：菌株ALL6青贮草莓藤条化学成分

表5：菌株ALL6青贮草莓藤青贮品质