一种多萜醇磷酸甘露糖基转移酶活性测定的HPLC方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种多萜醇磷酸甘露糖基转移酶活性测定的HPLC方法。

背景技术

蛋白质糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰过程。糖基化修饰蛋白可参与调控细胞中蛋白质定位、细胞功能和活性、细胞信号传递等生命活动，然而糖基化异常可导致肿瘤、糖尿病和心血管疾病等等。多萜醇磷酸甘露糖基转移酶是一类催化鸟苷二磷酸甘露糖中的甘露糖残基转移至磷酸多萜醇上，合成多萜磷酸醇甘露糖的糖基转移酶，其催化产物多萜醇磷酸甘露糖为内质网腔中多种蛋白质糖基化反应的甘露糖供体。该酶在真核细胞中主要负责蛋白翻译后糖基化修饰，对于维持细胞结构和功能、细胞内糖基化修饰的正常运行具有重要作用。该蛋白的表达及活性异常容易造成先天性糖基化障碍、Thy-1淋巴瘤等多种疾病。以往有关蛋白酶活性的测定通常采用放射性同位素标记法，但该方法存在同位素底物合成困难、价格昂贵和对人体有害等缺点。对于多萜醇磷酸甘露糖基转移酶活性测定目前没有简单易行，准确可靠的有效方法。

因此现有技术，需要一种对多萜醇磷酸甘露糖基转移酶活性易于检测且检测灵敏、重现性好的检测方法，以解决现有多萜醇磷酸甘露糖基转移酶活性测定困难、准确性低的问题。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种多萜醇磷酸甘露糖基转移酶活性测定的HPLC方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种多萜醇磷酸甘露糖基转移酶活性测定的HPLC方法，包括以下步骤：

S1：配制反应缓冲液；

S2：将磷酸植烷醇溶于甲醇，鸟苷二磷酸甘露糖溶于水配制成一定浓度的母液；

S3：建立反应体系，孵育出样品；

S4：设定高效液相的色谱条件，将以上步骤处理好的样品，注入高效液相色谱仪，完成梯度洗脱；

S5：记录色谱图。

具体的是，所述步骤S1中的反应缓冲液为80mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、200mM氯化钠、10mM氯化镁和1％乙基苯基聚乙二醇，反应缓冲液的pH值为7.5。

具体的是，所述步骤S3中的反应体系100μL，取相应体积终浓度100μM的磷酸植烷醇，加入离心管中，蒸发有机溶剂，加入相应体积的反应缓冲液漩涡震荡使之充分溶解，超声60s，加入酶溶液，37℃预孵育5min，加入终浓度200μM的鸟苷二磷酸甘露糖，开始反应，37℃孵育2h，离心取上清，经0.45μm有机滤膜过滤。

具体的是，所述步骤S4中的高效液相的色谱条件为：

流动相：A液：125mM磷酸二氢钾、53mM氢氧化钾和10mM四丁基溴化铵；B液：125mM磷酸二氢钾、53mM氢氧化钾、10mM四丁基溴化铵和20％甲醇(v/v)；

检测波长：254nm；

柱温：室温25℃。

具体的是，所述步骤S4中的梯度洗脱的程序为0-8min，100％A；8-21.5min，梯度下降到0％A；21.5-25min，梯度上升到100％A。

具体的是，所述步骤S5中的色谱图的记录时间为30min以内。

本发明具有以下有益效果：

本发明设计的多萜醇磷酸甘露糖基转移酶活性测定的HPLC方法，采用化学合成多萜醇磷酸甘露糖基转移酶的两个催化底物，通过大肠杆菌原核表达酵母多萜醇磷酸甘露糖基转移酶，进行体外酶催化反应，利用高效液相色谱法检测和分离产物鸟苷二磷酸，从而使得多萜醇磷酸甘露糖基转移酶活性测定成为可能；该方法分析速度快、灵敏度高。

附图说明

图1是鸟苷二磷酸标准品的色谱图。

图2是鸟苷二磷酸甘露糖标准品的色谱图。

图3是酶反应产物的色谱图。

具体实施方式

以下将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地进一步详细的说明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种采用高效液相色谱法测定多萜醇磷酸甘露糖基转移酶活性的方法，利用大肠杆菌原核表达酵母多萜醇磷酸甘露糖基转移酶，然后化学合成该酶的底物鸟苷二磷酸甘露糖以及磷酸多萜醇类似物磷酸植烷醇，通过体外检测重组多萜醇磷酸甘露糖基转移酶的催化产物鸟苷二磷酸的含量，进而测定该蛋白酶活性。采用本方法，在紫外254nm处检测，分析速度快，灵敏度高。

酶反应条件：80mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH 7.5)、200mM氯化钠、10mM氯化镁、1％乙基苯基聚乙二醇、100μM磷酸植烷醇、200μM鸟苷二磷酸甘露糖、含多萜醇磷酸甘露糖基转移酶的大肠杆菌菌膜成分。37℃孵育2h。

具体的本发明的检测方法包括以下步骤：

(1)配制反应缓冲液：80mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、200mM氯化钠、10mM氯化镁和1％乙基苯基聚乙二醇(pH 7.5)。

(2)将磷酸植烷醇溶于甲醇，鸟苷二磷酸甘露糖溶于水配制成一定浓度的母液。

(3)反应体系100μL，取相应体积的磷酸植烷醇(终浓度100μM)加入离心管中，蒸发有机溶剂，加入相应体积的反应缓冲液漩涡震荡使之充分溶解，超声60s，加入酶溶液，37℃预孵育5min，加入鸟苷二磷酸甘露糖(终浓度200μM)开始反应，37℃孵育2h。离心取上清，经0.45μm有机滤膜过滤。

(4)将以上步骤处理好的样品，注入高效液相色谱仪。

(5)记录色谱图。

梯度洗脱条件如下表1所示：

表1.HPLC梯度洗脱条件

色谱图的记录时间为30min以内。

采用本发明的方法，主成分的出峰时间为：两主峰的保留时间为：产物鸟苷二磷酸(10.2min)，底物鸟苷二磷酸甘露糖(6.8min)。

以下实施例中，采用的高效液相色谱仪为安捷伦高效液相色谱仪，色谱柱为安捷伦Eclipse XD-C18(5μm 4.6×150mm)，进样体积为10μL。当然也可以采用其他厂家和型号的高效液相色谱仪，其他粒径和长度的氨基色谱柱、以及其他进样体积，都能达到本发明的目的。

实施例1：

色谱条件

色谱柱：安捷伦Eclipse XD-C18(5μm 4.6×150mm)；

流动相：A液：125mM磷酸二氢钾、53mM氢氧化钾和10mM四丁基溴化铵；B液：125mM磷酸二氢钾、53mM氢氧化钾、10mM四丁基溴化铵和20％甲醇(v/v)；

梯度洗脱：梯度洗脱的程序为0-8min，100％A；8-21.5min，梯度下降到0％A；21.5-25min，梯度上升到100％A；

检测波长：254nm；

柱温：室温(25℃)；

样品流速：0.8mL/min。

实验步骤：

供试验样品：625μM浓度鸟苷二磷酸样品，置于1.5mL棕色小量瓶中。

精密吸取供实验样品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见附图1。由图可知，鸟苷二磷酸的出峰时间适中，基线稳定，且峰形可观。

实施例2：

色谱条件

色谱柱：安捷伦Eclipse XD-C18(5μm 4.6×150mm)；

流动相：A液：125mM磷酸二氢钾、53mM氢氧化钾和10mM四丁基溴化铵；B液：125mM磷酸二氢钾、53mM氢氧化钾、10mM四丁基溴化铵和20％甲醇(v/v)；

梯度洗脱：梯度洗脱的程序为0-8min，100％ A；8-21.5min，梯度下降到0％A；21.5-25min，梯度上升到100％A；

检测波长：254nm；

柱温：室温(25℃)；

样品流速：0.8mL/min。

实验步骤：

供试验样品：250μM浓度鸟苷二磷酸甘露糖样品，置于1.5mL棕色小量瓶中。

精密吸取供实验样品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见附图2。由图可知，鸟苷二磷酸甘露糖的出峰时间适中，基线稳定，且峰形可观。

实施例3：

色谱条件

色谱柱：安捷伦Eclipse XD-C18(5μm 4.6×150mm)；

流动相：A液：125mM磷酸二氢钾、53mM氢氧化钾和10mM四丁基溴化铵；B液：125mM磷酸二氢钾、53mM氢氧化钾、10mM四丁基溴化铵和20％甲醇(v/v)；

梯度洗脱：梯度洗脱的程序为0-8min，100％A；8-21.5min，梯度下降到0％A；21.5-25min，梯度上升到100％A；

检测波长：254nm；

柱温：室温(25℃)；

样品流速：0.8mL/min。

实验步骤：

供试验样品：将酶反应液样品置于1.5mL棕色小量瓶中。

精密吸取供实验样品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见附图3。由附图3可知，样品的主峰产物峰和底物峰与各杂质峰分离良好，峰1为底物峰(6.963min)，峰2为产物峰(10.236min)。

本发明不局限于上述实施方式，任何人应得知在本发明的启示下作出的结构变化，凡是与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。

本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。