自身荧光消光装置

技术领域

本发明涉及一种对生物试样等的自身荧光进行消光的自身荧光消光装置。

背景技术

由于光学机械和染色技法的发展，能够解析到生命现象的作用机制的本质，并且研究进展到了细胞、细胞以下的水平。在利用了荧光探针的荧光成像技术中，为了获得准确的生物的器官、组织的肉眼上可见的特征，需要考虑荧光淬灭、荧光强度、光褪色、荧光本底之类的现象、特性来进行，如果没有对源自生物体所产生的脂褐素等自身荧光物质、组织固定液处理的荧光进行消光或遮蔽的方法，则实质上不可能与组织、细胞的状态无关地均一地获取荧光染色的信号并进行图像化。因此，在生命科学领域、尤其是组织学(病理学)中，期望一种能够高效地对自身荧光进行消光的技术。

在此，作为现有技术中的对自身荧光进行消光的技术，能够分类为使用专用试剂来进行化学消光的技术、以及使用汞灯等光源向组织切片进行照射来进行物理消光的技术。

作为化学消光的技术，虽然自身荧光消失，但是残留了很多缺点，例如导致本来想要观察的荧光也消失了、导致在其它的波长范围内噪声增加了、花费与样本数量有关的费用等，利用了它们的论文报告并未有实际成果。

另一方面，在物理消光的技术中也同样，虽然自身荧光消失，但是残留了很多缺点，例如消光时间需要4小时～48小时，照射时间内的温度上升所致的组织切片的不可逆的变质等，由于需要避免该情况(非专利文献1)，因此利用物理消光的技术的论文报告仍然没有实际成果。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Doung H and Han M 2013Amultispectral LED array for thereduction of background autofluorescence in brain tissue.Journal ofneuroscience methods,220:46-54

发明内容

发明要解决的问题

本发明是鉴于上述现有技术的情况而完成的，其课题的目的在于提供如下一种技术：在短时间内不使组织切片的本来想要观察的荧光消光而仅使自身荧光消光，在各种各样的波长范围都不出现噪声，而且能够控制温度上升，该技术操作简单，能够重复使用，并且能够稳定地对自身荧光进行消光。

用于解决问题的方案

本申请发明人等潜心研究发现：通过将白色LED照明用作照射源，能够在短时间内不使组织切片的本来想要观察的荧光消光而仅使自身荧光消光，并且在各种各样的波长范围都不出现噪声。并且，想到如下的自身荧光消光装置并完成了本发明：该自身荧光消光装置是将白色LED照明用作照射源的自身荧光消光装置，能够抑制温度上升，并能够通过简单的操作重复利用。

即，本发明提供以下技术。

(1)一种自身荧光消光装置，是具备试样配置单元以及载置于该试样配置单元上的照射单元的试样的自身荧光消光装置，其中，

所述试样配置单元具备平板、设置于该平板的对试样进行配置的1个或多个试样配置凹部以及对该试样配置凹部进行冷却的冷却部件，

所述照射单元具备分别配置于各个所述试样配置凹部的上方的1个或多个白色LED照明。

(2)根据(1)所记载的自身荧光消光装置，其中，所述冷却部件是设置于所述平板之下的散热器和/或冷却风扇。

(3)根据(1)～(3)中的任一项所记载的自身荧光消光装置，其中，所述照射单元具备第二平板，所述白色LED照明配置于该第二平板。

(4)根据(3)所记载的自身荧光消光装置，其中，所述照射单元还具备第二冷却部件。

(5)根据(4)所记载的自身荧光消光装置，其中，所述第二冷却部件是设置于所述第二平板之上的散热器和/或冷却风扇。

(6)根据(3)～(5)中的任一项所记载的自身荧光消光装置，其中，所述照射单元经由肋而被载置在所述试样配置单元上，通过该肋来对所述平板与所述第二平板之间赋予空间。

发明的效果

根据本发明，提供一种自身荧光消光装置，其是在短时间内不使组织切片的本来想要观察的荧光消光而仅使自身荧光消光并在各种各样的波长范围都不出现噪声而且能够控制温度上升的技术，操作简单，能够重复使用，并且能够稳定地进行自身荧光进行消光。

附图说明

图1是本发明的自身荧光消光装置的优选的一个具体例的示意性立体图。

图2是图1所示的具体例的局部透视截面图。

图3是图1所示的具体例的、将照射单元上下翻转后示出的示意性立体图。

图4是图1所示的具体例的、示出试样配置单元的示意性立体图。

图5-1是示出实施例1中的各波长范围的消光时间和消光的程度的相对量的图。示出在425nm-475nm(蓝)、500nm-550nm(绿)、570nm-620nm(红)、650nm-750nm(红外)各自的波长范围内在实验鼠大脑皮质中存在细胞组织的部位能够看到的自身荧光的光量。将光照射0分钟设为100％，将不存在实验鼠组织的血管的内腔等处的光量设为0％。数值用平均值和标准偏差来表示。

图5-2是示出与图5-1相同的实验的结果并且用最大值来表示数值的图。

具体实施方式

下面，基于附图来说明本发明的优选的一个具体例。

图1是本发明的自身荧光消光装置优选的一个具体例的示意性立体图，图2是图1所示的具体例的局部透视截面图，图3是图1所示的具体例的、将照射单元上下翻转后示出的示意性立体图，图4是图1所示的具体例的、示出试样配置单元的示意性立体图。

如图1所示，本发明的自身荧光消光装置具备试样配置单元10以及载置于该试样配置单元10上的照射单元12。如图4中清楚示出的那样，试样配置单元10具备平板103。平板103的材质没有特别限定，但是优选易于散热的金属，例如能够列举银、铜、铝等。另外，也可以对平板103的上表面进行镜面加工以容易反射光。另外，也可以是使用玻璃、丙烯酸等热吸收低的原材料并通过在液体中照射光来抑制发热的方法。在平板103形成有多个试样配置凹部107。试样配置凹部107可以为1个，但如果有多个，则优选能够对多个试样同时进行处理。在图示的例子中，试样配置凹部107为圆筒形，但是形状并没有特别限定。例如，也能够设为能够直接配置承物玻璃片、培养皿、盖玻片等的形状。在试样配置凹部107为圆筒形的情况下，尺寸没有特别限定，但是通常来说圆的直径为10mm～20mm左右，深度为2mm～8mm左右。

在平板103之下配置有作为试样配置凹部107的冷却部件的散热器102，在更下面配置有风扇101(参照图2)。此外，作为冷却部件，可以仅为散热器102和风扇101中的任一者，但是两者都存在则冷却性能更高，因此是优选的。此外，作为冷却部件，除了散热器、风扇以外，还能够使用帕尔贴冷却单元、冷水机单元等。

另一方面，照射单元12具备第二平板108。如图3中清楚示出的那样，在第二平板108配置有多个白色LED照明106。第二平板108的材质没有特别限定，但是优选易于散热的金属，例如能够列举银、铜、铝等。另外，也可以对第二平板108的上表面进行镜面加工以容易反射光。多个白色LED照明106与多个试样配置凹部107对应地配置，被设置于在将照射单元12载置在试样配置单元10上时会在各试样配置凹部107的正上方配置各多个白色LED照明的位置。白色LED照明106的下表面与试样配置凹部107的底面的距离通常为3mm～20mm左右，优选为4mm～10mm左右。白色LED照明106与未图示的电源连接，在使用时被点亮。使用时的白色LED照明的强度被适当地设定，通常为1000流明～8000流明左右，优选为1500流明～5000流明左右。此外，白色LED照明的输出优选为能够在0W～1000W、优选为0W～500W、更优选为0W～400W之间调节，输出的设定分辨率优选为100W单位，更优选为10W单位。此外，白色LED照明通常通过蓝色的LED与作为其补色的黄色荧光体的组合来发出白色光，但是作为该蓝色LED，优选主波长(峰值波长)为450nm～520nm左右的LED。更优选的是，470nm～500nm较好。

在第二平板108与试样配置单元10的平板103之间配置有肋104(参照图3)。肋104作为用于空出试样配置单元10的平板103与照射单元12的第二平板108之间的距离的隔离件发挥功能，由此，白色LED照明106的下表面与试样配置凹部107的底面之间的距离成为期望的值。

在第二平板108上配置有作为冷却部件的第二散热器109，在更上面配置有同样作为冷却部件的第二风扇110。此外，在照射单元12中，也可以没有冷却部件，但是有的话能够更加抑制试样的温度上升，因此是优选的，另外，也可以仅为散热器109和风扇110中的任一者，但是两者都存在则冷却性能更高，因此是优选的。

另外，也可以设为，在平板103形成有温度计探针插入口105，将温度计探针插入此处从而能够测定平板103内的温度(接近试样配置凹部107的温度)。在该情况下，也可以具备对照射单元12的驱动电流进行控制的控制部件、对试样配置单元12的冷却部件的驱动电流进行控制的控制部件、检测试样配置单元12的温度的温度检测部件、设定所考虑的规定温度的阈值的设定部件、温度检测部件、基于由设定部件设定的阈值来判定是否发生异常的判定部件、以及通过该判定部件的判定来自动使所述驱动电流停止的停止部件，由此能够防止试样被意外地加热而受到损伤。

在使用时，将生物的组织切片等试样放入到试样配置凹部107。此外，生物的组织切片等试样不被特别限定，只要是放入到试样配置凹部107的程度的大小即可，生物种类和组织材料不限。接着，将照射单元12载置在试样载置单元10之上。由此，各白色LED照明106被配置在各试样配置凹部107的正上方。在该状态下，点亮各白色LED照明106。点亮时间能够适当地设定，但是通常为15分钟～1小时左右。通过以上的操作，能够对试样的自身荧光进行消光。此外，在使用时，也可以将自身荧光消光装置整体安装于振荡机来一边使其振荡一边进行照射。在该情况下，试样配置凹部107内的试样在该凹部内进行某种程度的相对移动，因此具有能够使针对试样的照射更加均匀的优点。

下面，基于实施例来对本发明进行具体的说明。可是，本发明并不限定于下述实施例。

实施例1

所有的动物实验是按照东方国家大学实验动物委员会的方针进行的，由东方国家大学实验动物委员会确认了步骤(批准编号19-51-405)。C57/BL6品系实验鼠的交配对是从日本SLC株式会社和日本CLEA株式会社购买的。实验鼠是在大学内的繁殖设施内在12小时的亮暗周期和23±2℃、55％±5％湿度的控制条件下饲养的。对20周岁-30周岁的雄鼠大脑进行了采样。实验鼠通过向腹腔内投放50mg/ml的戊巴比妥钠来进行深度麻醉，并经心脏用4％的多聚甲醛磷酸盐缓冲液进行了灌流固定。取出的大脑用4％的福尔马林在4℃下固定一晚后在30％的蔗糖溶液中浸渗两天来进行冻结防止处理，封入Surgipath(商品名：LeicaBiosystems社制造)之后以-80℃进行保管直至使用。大脑切片被以40μM的厚度制作出冻结切片。

准备了图1～图4所示的、成为上述的本发明的一个具体例的自身荧光消光装置。此外，构成白色LED照明106的蓝色LED的主波长为475nm。切片在用磷酸缓冲液清洗之后，用笔移动到充满了缓冲液的试样配置凹部107，不进行光照射、以及进行15分钟、30分钟、45分钟、60分钟中的任一种的光照射。光照射是各LED以成为24W的条件均一地进行的。LED在32W时的强度为4022流明，试样配置凹部107在直径15mm时深度设为4mm，从LED到试样配置凹部107的底面的距离设为5.5mm。在光照射期间，通过振荡机以60rpm的速度使组织切片振荡从而得到均一的光照射条件，并且连续地进行冷却以使试样配置凹部107的温度成为37℃以下。

染色了的组织切片的荧光照片是通过具备A1R共聚焦检测系统的Nikon EclipeNi显微镜对大脑皮质区域进行拍摄得到的。荧光的激发所使用的激光波长为405nm、488nm、560nm、640nm，荧光在425nm-475nm(蓝)、500nm-550nm(绿)、570nm-620nm(红)、650nm-750nm(红外)的波长时获取了图像。获取到的图像通过ImageJ来对光度进行了解析。

在未进行光照射的组织切片中，明确地观察到脂褐素颗粒等颗粒状的荧光，在红外的波长时尤为显著。从光照射开始起颗粒状的荧光逐渐减弱，在30分钟后变得观察不到了。即，在425nm-475nm(蓝)、500nm-550nm(绿)、570nm-620nm(红)、650nm-750nm(红外)各自的波长范围内，观察到了实验鼠大脑皮质的无染色切片的荧光组织切片。光照射前在全部的波长观察到颗粒状的信号，但是从光照射开始起15分钟后大致消失，在30分钟后确认不到颗粒状的信号。另外，不仅颗粒状的荧光，在组织切片整体观察到的自身荧光也同样因光照射而消光，在30分钟后在蓝色以外的波长时变为开始时的50％以下。对于蓝色荧光，能够确认到从开始时褪色了约20％(图5-1)。同样，切片上的荧光的最大值也大幅减少，30分钟后在蓝色以外的波长时变为开始时的20％左右(图5-2)。

附图标记说明

10：试样配置单元；12：照射单元；101：风扇；102：散热器；103：平板；104：肋；105：温度计探针插入口；106：白色LED照明；107：试样配置凹部；108：第二平板；109：第二散热器；110：第二风扇。