一种含酶生物传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物传感器件领域，涉及一种含酶生物传感器及其制备方法和应用。

背景技术

随着社会的发展和人们生活水平的提高，实时监测人体生物标志物的传感器越来越引起人们的重视，该类传感器可以将基于生物标志物浓度变化的生化响应信号转化为电信号，在临床和生活中应用广泛。可通过该类传感器在临床中测量生物标志物，包括：葡萄糖、乳酸盐、肾上腺素、尿素、氨基酸、多巴胺等。

该类传感器检测生物标志物的反应中涉及到电子转移，因此至少包含一个工作电极，工作电极的表面具有含酶敏感材料。

壳聚糖是一种良好保持酶活的材料，添加壳聚糖可以延长生物酶活性；PEDOT:PSS具备良好的离子-电子导电性，常作为电子传输层使用；二茂铁是一种良好的电子传输媒介，添加二茂铁可以提高电子传输效率，因此，壳聚糖、PEDOT:PSS、二茂铁常被用于制备含酶敏感材料。

文献1《Sens.Actuators B Chem.2022,373:132703.》中是利用生物友好的壳聚糖作为PEDOT:PSS的交联剂和酶活保存剂，实现了PEDOT:PSS的低温固化及很高的酶活性保存率(94％)，同时证明了该体系具有较低的电子转移阻抗。然而，如图1所示，该体系中的壳聚糖不具备电活性，因此生物酶需要在氧气的参与下催化底物产生双氧水，双氧水再进一步扩散到电极材料中被氧化产生传感电流。在可穿戴传感器的实际使用场景中，传感器芯片贴敷到皮肤表面，氧气很难扩散进敏感层，导致实际使用环境受限。

文献2《A fully inkjet-printed disposable glucose sensor on paper[J].npj Flexible Electronics,2018,2(1):30.》公开了一种同时含有壳聚糖、二茂铁、PEDOT:PSS、生物酶的含酶生物传感器，其在纸基上通过喷墨打印一层PEDOT:PSS作为电子传导层，随后在PEDOT:PSS表面吸附一层生物酶，并进一步将小分子二茂铁混合壳聚糖涂敷在酶层之上，最终使用全氟磺酸作为封装层得到最终的传感器的工作电极，但是该传感器的电子传输效率较低，稳定性较差，在4℃的储存条件下，其传感性能在14天储存期后就开始衰减，一个月的储存期后只剩80％左右的初始传感性能(信噪比)。可能的原因是：1)游离的二茂铁与酶之间的结合距离太远，降低了一部分电子传输效率；2)游离的二茂铁无法保证其在使用过程中的稳定性，会从电极表面迁移出去；3)壳聚糖是一种绝缘材料，同样会降低电子传输效率；4)PEDOT:PSS自身的强酸性及强负电性，会导致生物酶失活(因此它常常作为电子传导层，而少用与酶共混的案例)，同样会降低电子传输效率；5)PEDOT、壳聚糖和生物传感的酶是层层组装，这样无法保证酶和PEDOT之间的紧密链接(酶层存在厚度，酶层内部的分子离导电的PEDOT距离较远)。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中存在的问题，提供一种含酶生物传感器及其制备方法和应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种含酶生物传感器的制备方法，将包裹了生物酶的CS-Fc(壳聚糖-二茂铁)作为固化稳定剂，在工作电极表面对PEDOT:PSS(聚(3,4-乙烯二氧噻吩):聚苯乙烯磺酸盐)进行固化交联形成含酶敏感材料后，将工作电极、对电极和参比电极进行组装，得到含酶生物传感器；

生物酶为氧化还原酶；

CS-Fc的结构式如下：

式中，R为

本发明先用CS-Fc将生物酶包裹，再加入PEDOT:PSS构筑导电网络，利用其优良的导电性，获得高效的电子传输效率，由于先用CS-Fc将生物酶包裹，因此一方面能够阻止PEDOT:PSS对酶的伤害，构筑稳定的酶活环境，另一方面使得Fc与生物酶距离较近，可进一步提高电子转移效率。

壳聚糖是自然界唯一大量存在的氨基功能化多糖，它具备良好的生物相容性，并且在大多数条件下具有良好的离子导电性。同时，壳聚糖的氨基可以于PEDOT:PSS的磺酸根产生静电作用。利用这种静电作用，就可以实现对PEDOT:PSS的固化交联，使其在液相中保持稳定状态。另外，为了进一步提高PEDOT:PSS本身的电子转移效率，可在壳聚糖上引入可氧化还原的基团，这些氧化还原基团已被大量研究证明可以提高电子传输效率。

作为优选的技术方案：

如上所述的一种含酶生物传感器的制备方法，生物酶为葡萄糖氧化酶、漆酶、尿酸氧化酶、乳酸氧化酶、过氧化氢酶和尿素酶中的一种以上。

如上所述的一种含酶生物传感器的制备方法，工作电极的表面含酶敏感材料的厚度为0.2-10μm。

如上所述的一种含酶生物传感器的制备方法，工作电极为金、银、铂、碳、铜或氧化铟锡；对电极为金、银、铂或碳；参比电极为Ag/AgCl、Hg/Hg

如上任一项所述的一种含酶生物传感器的制备方法，具体过程为：首先将CS-Fc溶液和生物酶溶液混合均匀得到混合溶液I，然后向混合溶液I中加入PEDOT:PSS溶液混合均匀得到混合溶液II，接着将混合溶液II施加(具体方式不限，可以为滴涂、打印、丝网印刷等)到工作电极的表面后干燥形成含酶敏感材料，最后将工作电极、对电极和参比电极进行组装，得到含酶生物传感器。

如上所述的一种含酶生物传感器的制备方法，干燥的温度为4-37℃，这个温度范围内干燥能最大化保存生物酶的活性。

如上所述的一种含酶生物传感器的制备方法，CS-Fc溶液的浓度为0.06-5mg/mL，溶剂为体积百分比浓度为0.5-1.0％(v/v)的醋酸水溶液；生物酶溶液的浓度为1-20mg/mL，溶剂为水；PEDOT:PSS溶液的浓度为1-13mg/mL，溶剂为水。

如上所述的一种含酶生物传感器的制备方法，CS-Fc溶液、生物酶溶液、PEDOT:PSS溶液的体积比为1:0.5-2:1-3。

本发明还提供一种含酶生物传感器，采用如上任一项所述的一种含酶生物传感器的制备方法制得。

本发明还提供如上所述的一种含酶生物传感器的应用，用于实时监测体液(如汗液、唾液、眼泪、血液、尿液、间质液等)中的生物标志物。

作为优选的技术方案：

如上所述的应用，含酶生物传感器可在无氧气的环境下实现传感，数据检测极限为1-100μM，检测灵敏度为10-500μA·mM

本发明制得的含酶生物传感器能够在液相中保持稳定状态，因此可利用含酶生物传感器实时监测生物标志物的浓度。对含酶生物传感器的工作电极施加电流或者电压时，当生物标志物被工作电极捕获后，会导致工作电极上电压或者电流的变化，该电压或电流的变化量与生物标志物的浓度存在数学相关性。本发明制得的含酶生物传感器的电子传输效率高，其中一个具体指标就是该传感器可在无氧气的环境下实现传感。本发明制得的含酶生物传感器的稳定性也较高。

本发明的原理如下：

本发明的含酶生物传感器的组装过程如图2所示，先将CS-Fc与生物酶混合，再将PEDOT材料加入其中，最终该材料以生物酶为核心，包覆一层CS-Fc作为电子中介，最外围由导电高分子PEDOT包覆，三者呈现夹心结构。

现以葡萄糖氧化酶为生物酶活中心为例，阐述本发明的含酶生物传感器的传感原理，如图3所示，葡萄糖失去电子生成葡萄糖酮，电子被氧化态葡萄糖氧化酶捕获生成还原态葡萄糖氧化酶，接着氧化态CS-Fc从还原态葡萄糖氧化酶夺取电子生成还原态CS-Fc，电极表面施加氧化电势后，还原态PEDOT材料被氧化为氧化态PEDOT材料，并进一步氧化CS-Fc，构成完整的电子传输路径。

针对文献1存在的问题，本发明通过在壳聚糖分子上接枝可与生物分子发生直接电子转移的二茂铁分子予以解决，在壳聚糖上引入二茂铁后，二茂铁充当了电子媒介，即电子直接从酶活性中心转移给二茂铁，再转移给PEDOT，再到电极，不会出现过氧化氢，也不需要氧气参与，因此可在无氧气的环境下实现传感，因此本发明更适用于实际使用环境。

针对文献2存在的问题，本发明通过调整含酶敏感材料的制备方法予以解决，其中，壳聚糖和二茂铁二者是化学键合在一起的，是一个整体，而不是单独分开的部分；三者组合方法不是简单共混，而是存在先后顺序，先将CS-Fc与生物酶结合，构筑酶活保护层，同时其中的Fc起到和生物酶之间的电子传输作用，再与PEDOT:PSS结合，构筑导电网络，将电子传导至电极；

CS-Fc起到三个作用：(a)CS-Fc中的CS作为生物多糖可以保存生物酶的活性；(b)CS-Fc中的CS作为阳离子聚合物可以和PEDOT:PSS中的聚苯乙烯磺酸根阴离子通过静电作用，交联PEDOT:PSS，使其物理结构稳定，不会被水溶解；(c)CS-Fc中的Fc可以作为高效电子传输媒介；

PEDOT:PSS起到一个作用：作为导电网络将电子信号从生物酶传向金属电极；

由于本发明中Fc和壳聚糖是化学键合的大分子聚合物，Fc和生物酶之间的结合距离较近，且Fc和生物酶活性中心可以发生快速的电荷交换，而不需要氧气的参与，另外未被Fc取代的壳聚糖又可以为生物酶提供良好的生物微环境，保持较高的生物酶活性；同时，PEDOT:PSS呈现负电性，又可以与带正电性的Fc功能化壳聚糖产生静电作用，形成紧密的导电网络，实现Fc和电极之间快速的电荷交换，因此，本发明的含酶生物传感器能保持酶活的前提下，具有较高的电子传输速度，同时由于生物酶被静电作用嵌在PEDOT和壳聚糖中，不会轻易被溶液浸出，因此可以保持很好的稳定性。

有益效果：

(1)本发明的敏感电极(表面有含酶敏感材料的工作电极)具有较好的灵敏度和传感效果，对电流的变化具有较好的响应性，通过构建电流和浓度的关系，可以用于检测浓度的变化；

(2)本发明的含酶敏感材料中，具有良好生物相容性的CS-Fc可以使包埋在其中的生物酶具有长期稳定的生物活性，PEDOT:PSS可以将化学信号转化为电信号，同时降低过氧化氢的氧化电势，实现低电势检测；

(3)本发明制备的生物传感器可以用于人体的生物标志物的实时监测，从而评估人体的生理状况；

(4)本发明通过将CS-Fc与PEDOT:PSS的简单共混，既可以实现对PEDOT:PSS的固化，并且不降低PEDOT:PSS本身的电学性能；本发明方法有助于拓宽PEDOT:PSS在生物分子包埋，生物传感器制备领域的工业化应用。

附图说明

图1为本发明以无二茂铁作为电子中介的需氧型含酶传感材料的敏感机理示意图；其中，Gluconolactone为葡萄糖酮，Glucose为葡萄糖，Chitosan为壳聚糖，GOX

图2为本发明基于CS-Fc固化PEDOT:PSS的含酶传感材料的组装过程示意图；

图3为本发明基于CS-Fc固化PEDOT:PSS的含酶传感器的敏感机理示意图；其中，Gluconolactone为葡萄糖酮，Glucose为葡萄糖，GOX

图4为本发明含有Fc和不含有Fc的敏感材料对葡萄糖的电流响应示意图；图中对比在含有Fc和不含Fc情况下对葡萄糖的传感能力，可以看出含有Fc的电极对葡萄糖的电流响应更大，检测极限为10μM，检测灵敏度为14.8μA·mM

图5为本发明的含酶生物传感器在组装过程中粒径尺寸的变化示意图；其中，CS-Fc粒径为3nm，GOX粒径为6nm，CS-Fc/GOX组装粒径为10nm，PEDOT:PSS粒径为30nm，在与CS-Fc/GOX进一步组装后，其粒径扩大到500nm以上。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

以下为实施例中涉及到的原料的厂商和牌号：

葡萄糖氧化酶：厂商为Sigma-Aldrich，牌号为G7141；

漆酶：厂商为Sigma-Aldrich，牌号为L2157；

尿酸氧化酶：厂商为Sigma-Aldrich，牌号为U7128；

乳酸氧化酶：厂商为Sigma-Aldrich，牌号为L9795；

过氧化氢酶：厂商为Sigma-Aldrich，牌号为02071；

尿素酶：厂商为Sigma-Aldrich，牌号为94281。

以下为实施例中各性能的检测方法：

数据检测极限：配制浓度已知的不同浓度的生物标志物溶液，分别将工作电极、对电极和参比电极放入不同浓度的生物标志物溶液中，施加相对于参比电极的恒电势+0.7V的电压，平衡5min后获取不同浓度的生物标志物溶液的电流响应曲线，计算各电流响应曲线的信噪比，将浓度为0的生物标志物溶液对应的电流响应曲线的信噪比记为a，将信噪比为3a的电流响应曲线对应的生物标志物溶液的浓度作为数据检测极限。

线性范围、检测灵敏度：配制浓度已知的不同浓度的生物标志物溶液，分别将工作电极、对电极和参比电极放入不同浓度的生物标志物溶液中，施加相对于参比电极的恒电势+0.7V的电压，平衡5min后获取不同浓度的生物标志物溶液的电流响应值(即电流响应曲线中电流最终保持不变的数值)，绘制横坐标为生物标志物溶液的浓度、纵坐标为电流响应值的散点图，从中选取能利用一次方程拟合且系数R

剩余的初始传感性能：配制浓度为0.2mM的生物标志物溶液，分别将工作电极、对电极和参比电极放入浓度为0.2mM的生物标志物溶液中，施加相对于参比电极的恒电势+0.7V的电压，平衡5min后获取浓度为0.2mM的生物标志物溶液的电流响应值，记为A

实施例1

一种含酶生物传感器的制备方法，步骤如下：

(1)原料的准备；

生物酶：葡萄糖氧化酶；

溶剂I：水；

CS-Fc：

溶剂II：体积百分比浓度为0.5％(v/v)的醋酸水溶液；

PEDOT:PSS：厂商为贺利氏，牌号为PH1000；

溶剂III：水；

工作电极：金；

对电极：金；

参比电极：Ag/AgCl；

(2)将CS-Fc溶液(由CS-Fc和溶剂II组成，浓度为1.2mg/mL)和生物酶溶液(由生物酶和溶剂I组成，浓度为1mg/mL)混合均匀得到混合溶液I，然后向混合溶液I中加入PEDOT:PSS溶液(由PEDOT:PSS和溶剂III组成，浓度为1mg/mL)并通过漩涡振荡器混合1min后得到混合溶液II；其中，CS-Fc溶液、生物酶溶液、PEDOT:PSS溶液的体积比为1:0.5:1；在此过程中，利用DLS对组装过程进行表征，如图5所示，CS-Fc在和酶组装之后其粒径显著增大，再与PEDOT:PSS组装后进一步增大其分布相对均匀，证明了该组装方法的可控性；

(3)将混合溶液II滴涂到工作电极的表面后在4℃下干燥形成厚度为0.2μm的含酶敏感材料，最后将工作电极、对电极和参比电极进行组装，得到含酶生物传感器。

一种含酶生物传感器的应用，采用上述制得的含酶生物传感器，在无氧气的环境下实时监测汗液中的葡萄糖。

测试表明，本实施例制得的含酶生物传感器的数据检测极限为10μM，检测灵敏度为15μA·mM

对比例1

一种含酶生物传感器的制备方法，基本同实施例1，不同之处仅在于：CS-Fc的结构式中

一种含酶生物传感器的应用，基本同实施例1。

测试表明，本对比例制得的含酶生物传感器的数据检测极限为120μM，检测灵敏度为0.796μA·mM

将对比例1和实施例1对比可知，由于对比例1中敏感材料中不含Fc，会导致检测极限升高，检测灵敏度降低，且线性范围变窄，这是因为在无氧条件下，生物酶无法利用氧气氧化葡萄糖生成双氧水，同时壳聚糖作为绝缘层隔绝了酶活中心与导电高分子之间的直接电子转移，仅有少量自由生物酶与导电高分子接触紧密形成传感电流，而存在Fc的情况下时，生物酶不需要氧气参与既可以利用Fc作为电子中介将信号传输给电极进而产生传感信号。如图4所示，对比由不含Fc的CS制备的电极，由CS-Fc制备的电极拥有更高的灵敏度以及更宽的线性范围。

实施例2

一种含酶生物传感器的制备方法，步骤如下：

(1)原料的准备；

生物酶：漆酶；

溶剂I：水；

CS-Fc：

溶剂II：体积百分比浓度为0.6％(v/v)的醋酸水溶液；

PEDOT:PSS：厂商为贺利氏，牌号为PH1000；

溶剂III：水；

工作电极：银；

对电极：银；

参比电极：Hg/Hg

(2)将CS-Fc溶液(由CS-Fc和溶剂II组成，浓度为1mg/mL)和生物酶溶液(由生物酶和溶剂I组成，浓度为2mg/mL)混合均匀得到混合溶液I，然后向混合溶液I中加入PEDOT:PSS溶液(由PEDOT:PSS和溶剂III组成，浓度为3mg/mL)并通过漩涡振荡器混合2min后得到混合溶液II；其中，CS-Fc溶液、生物酶溶液、PEDOT:PSS溶液的体积比为1:0.5:2；

(3)将混合溶液II滴涂到工作电极的表面后在6℃下干燥形成厚度为0.4μm的含酶敏感材料，最后将工作电极、对电极和参比电极进行组装，得到含酶生物传感器。

一种含酶生物传感器的应用，采用上述制得的含酶生物传感器，在无氧气的环境下实时监测汗液中的肾上腺素。

测试表明，本实施例制得的含酶生物传感器的数据检测极限为1μM，检测灵敏度为100μA·mM

实施例3

一种含酶生物传感器的制备方法，步骤如下：

(1)原料的准备；

生物酶：尿酸氧化酶；

溶剂I：水；

CS-Fc：

溶剂II：体积百分比浓度为0.7％(v/v)的醋酸水溶液；

PEDOT:PSS：厂商为贺利氏，牌号为PH1000；

溶剂III：水；

工作电极：铂；

对电极：铂；

参比电极：Hg/HgO；

(2)将CS-Fc溶液(由CS-Fc和溶剂II组成，浓度为0.6mg/mL)和生物酶溶液(由生物酶和溶剂I组成，浓度为4mg/mL)混合均匀得到混合溶液I，然后向混合溶液I中加入PEDOT:PSS溶液(由PEDOT:PSS和溶剂III组成，浓度为5mg/mL)并通过漩涡振荡器混合3min后得到混合溶液II；其中，CS-Fc溶液、生物酶溶液、PEDOT:PSS溶液的体积比为1:1:3；

(3)将混合溶液II滴涂到工作电极的表面后在10℃下干燥形成厚度为0.8μm的含酶敏感材料，最后将工作电极、对电极和参比电极进行组装，得到含酶生物传感器；

一种含酶生物传感器的应用，采用上述制得的含酶生物传感器，在无氧气的环境下实时监测血液中的尿酸。

测试表明，本实施例制得的含酶生物传感器的数据检测极限为20μM，检测灵敏度为200μA·mM

实施例4

一种含酶生物传感器的制备方法，步骤如下：

(1)原料的准备；

生物酶：乳酸氧化酶；

溶剂I：水；

CS-Fc：

溶剂II：体积百分比浓度为0.8％(v/v)的醋酸水溶液；

PEDOT:PSS：厂商为贺利氏，牌号为PH1000；

溶剂III：水；

工作电极：碳；

对电极：碳；

参比电极：Ag/Ag

(2)将CS-Fc溶液(由CS-Fc和溶剂II组成，浓度为0.3mg/mL)和生物酶溶液(由生物酶和溶剂I组成，浓度为6mg/mL)混合均匀得到混合溶液I，然后向混合溶液I中加入PEDOT:PSS溶液(由PEDOT:PSS和溶剂III组成，浓度为6mg/mL)并通过漩涡振荡器混合4min后得到混合溶液II；其中，CS-Fc溶液、生物酶溶液、PEDOT:PSS溶液的体积比为1:1.5:2；

(3)将混合溶液II滴涂到工作电极的表面后在14℃下干燥形成厚度为1.6μm的含酶敏感材料，最后将工作电极、对电极和参比电极进行组装，得到含酶生物传感器；

一种含酶生物传感器的应用，采用上述制得的含酶生物传感器，在无氧气的环境下实时监测汗液中的乳酸。

测试表明，本实施例制得的含酶生物传感器的数据检测极限为25μM，检测灵敏度为50μA·mM

实施例5

一种含酶生物传感器的制备方法，步骤如下：

(1)原料的准备；

生物酶：过氧化氢酶；

溶剂I：水；

CS-Fc：

溶剂II：体积百分比浓度为0.9％(v/v)的醋酸水溶液；

PEDOT:PSS：厂商为贺利氏，牌号为PH1000；

溶剂III：水；

工作电极：铜；

对电极：金；

参比电极：Ag/AgNO

(2)将CS-Fc溶液(由CS-Fc和溶剂II组成，浓度为0.1mg/mL)和生物酶溶液(由生物酶和溶剂I组成，浓度为10mg/mL)混合均匀得到混合溶液I，然后向混合溶液I中加入PEDOT:PSS溶液(由PEDOT:PSS和溶剂III组成，浓度为6.5mg/mL)并通过漩涡振荡器混合5min后得到混合溶液II；其中，CS-Fc溶液、生物酶溶液、PEDOT:PSS溶液的体积比为1:1.5:3；

(3)将混合溶液II滴涂到工作电极的表面后在20℃下干燥形成厚度为3.2μm的含酶敏感材料，最后将工作电极、对电极和参比电极进行组装，得到含酶生物传感器；

一种含酶生物传感器的应用，采用上述制得的含酶生物传感器，在无氧气的环境下实时监测血液中的过氧化氢。

测试表明，本实施例制得的含酶生物传感器的数据检测极限为100μM，检测灵敏度为300μA·mM

实施例6

一种含酶生物传感器的制备方法，步骤如下：

(1)原料的准备；

生物酶：尿素酶；

溶剂I：水；

CS-Fc：

溶剂II：体积百分比浓度为1％(v/v)的醋酸水溶液；

PEDOT:PSS：厂商为贺利氏，牌号为PH1000；

溶剂III：水；

工作电极：氧化铟锡；

对电极：银；

参比电极：Ag/AgCl；

(2)将CS-Fc溶液(由CS-Fc和溶剂II组成，浓度为0.06mg/mL)和生物酶溶液(由生物酶和溶剂I组成，浓度为15mg/mL)混合均匀得到混合溶液I，然后向混合溶液I中加入PEDOT:PSS溶液(由PEDOT:PSS和溶剂III组成，浓度为10mg/mL)并通过漩涡振荡器混合6min后得到混合溶液II；其中，CS-Fc溶液、生物酶溶液、PEDOT:PSS溶液的体积比为1:1.5:1；

(3)将混合溶液II滴涂到工作电极的表面后在25℃下干燥形成厚度为6.4μm的含酶敏感材料，最后将工作电极、对电极和参比电极进行组装，得到含酶生物传感器；

一种含酶生物传感器的应用，采用上述制得的含酶生物传感器，在无氧气的环境下实时监测汗液中的尿素。

测试表明，本实施例制得的含酶生物传感器的数据检测极限为50μM，检测灵敏度为500μA·mM

实施例7

一种含酶生物传感器的制备方法，步骤如下：

(1)原料的准备；

生物酶：葡萄糖氧化酶；

溶剂I：水；

CS-Fc：

溶剂II：体积百分比浓度为0.5％(v/v)的醋酸水溶液；

PEDOT:PSS：厂商为贺利氏，牌号为PH1000；

溶剂III：水；

工作电极：金；

对电极：铂；

参比电极：Hg/Hg

(2)将CS-Fc溶液(由CS-Fc和溶剂II组成，浓度为1.1mg/mL)和生物酶溶液(由生物酶和溶剂I组成，浓度为20mg/mL)混合均匀得到混合溶液I，然后向混合溶液I中加入PEDOT:PSS溶液(由PEDOT:PSS和溶剂III组成，浓度为13mg/mL)并通过漩涡振荡器混合6min后得到混合溶液II；其中，CS-Fc溶液、生物酶溶液、PEDOT:PSS溶液的体积比为1:2:1；

(3)将混合溶液II滴涂到工作电极的表面后在37℃下干燥形成厚度为10μm的含酶敏感材料，最后将工作电极、对电极和参比电极进行组装，得到含酶生物传感器；

一种含酶生物传感器的应用，采用上述制得的含酶生物传感器，在无氧气的环境下实时监测血液中的葡萄糖。

测试表明，本实施例制得的含酶生物传感器的数据检测极限为10μM，检测灵敏度为10μA·mM

上面结合附图对本发明实施例进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。