治疗脓毒症的硝唑尼特

本发明涉及硝唑尼特(nitazoxanide)、替唑尼特(tizoxanide)或替唑尼特葡糖苷酸，用于治疗或预防脓毒症。

背景技术

脓毒症是一种对感染的免疫应答失调，导致器官功能障碍。它的发展是宿主对感染、大多数情况下是细菌感染的复杂的应答失调的结果。这种宿主应答失调不仅以炎症增加为特征，还以免疫抑制为特征。这种对感染的应答失当导致了细胞功能障碍，并最终导致器官衰竭。在脓毒症中单器官功能障碍是少见的，通常会累及几个器官。脓毒症患者的死亡率与受累器官的数量有关。

许多脓毒症患者发生循环衰竭，导致细胞氧代谢异常。细胞氧代谢异常表现为血乳酸水平升高，通常达到>2mEq/升的值。尽管进行了充分的容量复苏但仍需要血管加压剂来维持最低平均动脉压并且具有升高的血乳酸水平的患者，被临床诊断为有脓毒性休克。

脓毒症是对感染的全身性炎症反应，以两个或更多个定义全身性炎症反应综合征的标准来表现。严重脓毒症是一种合并器官功能障碍和脓毒性休克的情况(尽管进行了充分的液体复苏仍然血压过低)。该谱系的终末是多器官功能障碍综合征，其定义是急性染病的患者存在器官功能改变并且在没有干预的情况下无法维持体内稳态。

脓毒症及其引起的多器官衰竭是许多重症监护病房最常见的死亡原因。据估计，美国每年发生750,000例严重脓毒症，死亡率高。脓毒症现在是美国第12大最常见的死亡原因。事实上，脓毒症的定义是“感染引起的全身性炎症反应综合征”，反映了脓毒症是炎症级联失控的结果的概念。

现在越来越多的证据提示，广泛的凋亡性死亡导致免疫细胞耗尽，并可能危害患者消灭感染的能力。

凋亡代表ATP依赖性死亡程序的执行，该程序经常由死亡受体连接启动，导致半胱天冬酶(caspase)激活级联，包括半胱天冬酶-9的激活和随后效应半胱天冬酶的激活。一旦激活，半胱天冬酶-9可以直接切割并激活半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-7。

半胱天冬酶基因家族由15个哺乳动物成员组成，基于其前结构域(prodomain)的结构和功能进行分类。半胱天冬酶家族基于其功能可以分为两个功能亚组。炎症性半胱天冬酶(半胱天冬酶-1、-4、-5、11、-12、-13和-14)在细胞因子成熟和炎症反应中发挥作用。参与凋亡的半胱天冬酶进一步分为两个功能亚群，即引发凋亡的半胱天冬酶(半胱天冬酶-2、-8、-9、-10和-15)和效应半胱天冬酶(半胱天冬酶-3、6、7)。

效应半胱天冬酶负责启动凋亡的降解阶段的标志，包括DNA片段化、细胞收缩和胞膜起泡。

此外，脓毒症患者在严重脓毒症诊断时的血清半胱天冬酶-3水平与死亡率之间存在关联。血清半胱天冬酶3水平因此可以用作预后性生物标志。在脓毒症动物模型中，在不同的身体部位发现半胱天冬酶3活性增加。另外发现，脓毒症患者的淋巴细胞中的半胱天冬酶3活性高于健康对照，并且脓毒症患者的脾中的半胱天冬酶3活性高于非脓毒症患者。

目前对脓毒症的治疗旨在通过提供迅速控制感染、稳定血液动力学和尽可能的器官支持以确保器官功能恢复来制约器官功能障碍的发展。但脓毒症和脓毒性休克的治疗仍然是一个实质上未得到满足的医疗需求。

NTZ(硝唑尼特，[2-[(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)氨基甲酰基]苯基]乙酸酯)，于1975年被首次描述，显示出对厌氧原生动物、蠕虫以及包括厌氧和好氧细菌在内的广谱微生物都高度有效。NTZ是一种在美国被批准用于治疗由原生动物寄生虫小隐孢子虫(Crystosporidium parvum)和肠贾第虫(Giardia intestinalis)引起的腹泻的药物。

NTZ还可以赋予抗病毒活性，并且还显示出通过干扰关键的代谢信号通路和促死亡信号通路而具有广泛的抗癌性质。

在这里令人惊讶地表明NTZ可以用于治疗有需要的对象的脓毒症。

发明内容

本发明源于一项令人惊讶的观察，即在临床前脓毒症模型中，NTZ改善了存活率。本发明人还表明，NTZ的活性代谢物——替唑尼特(TZ)通过抑制半胱天冬酶活性而直接保护肝细胞免于细胞因子诱导的细胞死亡。

因此，本发明涉及NTZ、TZ、TZ葡糖苷酸(TZG)或其药学上可接受的盐，用于治疗脓毒症的方法中。

本发明更特别地涉及一种选自NTZ、TZ和TZG的化合物，用于治疗有需要的对象的脓毒症的方法中。在一个特定的实施方案中，所述化合物是NTZ。

在一个特定的实施方案中，所述脓毒症是由细菌感染引起的。

在另一个特定的实施方案中，所述化合物用于通过抑制在脓毒症期间发生的细胞因子诱导的凋亡来保护重要器官。在又一个实施方案中，所述化合物用于通过抑制半胱天冬酶活性来防御细胞因子诱导的细胞死亡。

在一个特定的实施方案中，所述对象患有脓毒症伴多器官衰竭或有脓毒症伴多器官衰竭的风险。在另一个实施方案中，所述对象患有脓毒性休克或有脓毒性休克的风险。

在另一个实施方案中，所述化合物用于减缓或终止脓毒症进展。

在又一个实施方案中，所述化合物作为单一活性剂用于所述方法中。或者，在另一个实施方案中，所述化合物与抗微生物剂如抗生素联合用于所述方法中。在一个特定的实施方案中，所述抗微生物剂是碳青霉烯类抗生素，如厄他培南(ertapenem)。

附图说明

图1：NTZ治疗改善CLP手术后的存活率

用NTZ处理和未处理(介质)的小鼠在CLP手术后的存活曲线

用对数秩Mantel-Cox检验比较NTZ和介质组之间的存活曲线，P＝0.07

图2：TZ抑制HepG2中TNFα诱导的半胱天冬酶3/7活性

对于用ANOVA和Fisher LSD检验进行多重比较来进行TNFα或星形孢菌素与未处理之间(A)以及TZ与介质之间(B)的比较，*、**、***分别代表p<0.05、p<0.01和p<0.001

###代表使用Student T检验p<0.001

图3：TZ预处理抑制HepG2细胞中星形孢菌素诱导的半胱天冬酶3/7活性

A.星形孢菌素对HepG2细胞中半胱天冬酶3/7活性的效应(n＝24)。使用Student t检验来评估统计显著性。***p<0.001

B.TZ预处理对HepG2细胞中星形孢菌素诱导的凋亡的效应(n＝8至24)。在添加星形孢菌素之前，用TZ预处理细胞16小时。采用单因素ANOVA与Dunnett检验进行多重检验以评估统计显著性(TZ处理的细胞与未处理的细胞比较)。***p<0.001

图4：伴随星形孢菌素的TZ和NTZ处理抑制HepG2细胞中的半胱天冬酶3/7活性

A.TZ对星形孢菌素诱导的HepG2细胞凋亡的效应(n＝6)。同时添加TZ和星形孢菌素，然后测量半胱天冬酶3/7活性

B.NTZ对星形孢菌素诱导的HepG2细胞凋亡的效应(n＝6)。同时添加NTZ和星形孢菌素，然后测量半胱天冬酶3/7活性。

对于A和B，采用单因素ANOVA与Dunnett检验进行多重检验以评估统计显著性(TZ或NTZ处理的细胞与未处理的细胞比较)。**p<0.01，***p<0.001

图5：伴或不伴预处理的NTZ改善CLP诱导的脓毒症后的存活率

A.研究概要-白色方块表示未处理(对照小鼠)，黑色三角形表示小鼠用NTZ BID处理

B.对照小鼠、伴3天预处理的接受NTZ的小鼠和从CLP手术当天起接受NTZ的小鼠的存活曲线。采用Gehan-Breslow-Wilcoxon比较组之间的存活曲线。**p<0.01，***p<0.001

图6：伴或不伴预处理的NTZ改善CLP诱导的脓毒症后7天的存活率

研究结束时，用介质、NTZ 3天预处理或NTZ处理进行处理的小鼠的存活率

图7：NTZ改善CLP诱导的脓毒症小鼠的健康(welfare)评分

在用介质、NTZ 3天预处理或NTZ处理进行处理的小鼠的CLP手术后4天期间，考虑6个独立参数的演变来评价动物健康。严重程度从0(无体征)到3(更严重)来评价。

图8：脓毒症诱导后施用NTZ有效改善存活率

A.研究概要。白色方块表示未处理(对照小鼠)，三角形表示用NTZ处理的小鼠(1个三角形＝每天一次或QD，两个三角形＝每天两次或BID)。

B.对照小鼠、在CLP之前1小时和之后3.5小时接受NTZ BID的小鼠和仅在CLP手术后3.5小时接受NTZ的小鼠的存活曲线。采用Gehan-Breslow-Wilcoxon比较组之间的存活曲线。**p<0.01，***p<0.001

C.研究结束时，对照小鼠、在CLP之前1小时和之后3.5小时接受NTZ BID的小鼠和仅在CLP手术后3.5小时接受NTZ的小鼠的存活率

图9：脓毒症诱导后施用NTZ有效改善健康评分

在对照小鼠、在CLP之前1小时和之后3.5小时接受NTZ BID的小鼠和仅在CLP手术后3.5小时接受NTZ的小鼠的脓毒症诱导后4天期间，考虑6个独立参数的演变来评价动物健康。严重程度从0(无体征)到3(最严重)来评价。

具体实施方式

本发明涉及用于治疗或预防脓毒症的NTZ或TZ(G)。

本文中使用的术语“对象”或“患者”是指哺乳动物，优选人类。

如上所述，本文中使用的术语“脓毒症”是指对感染的有害的全身性炎症反应，正式定义为感染的存在连同感染的全身性表现。本文中使用的术语脓毒症包括任何严重程度的脓毒症及其并发症，如脓毒症伴多器官衰竭和脓毒性休克。

在本发明的一个特定实施方案中，所述对象患有脓毒症或其并发症或有脓毒症或其并发症的风险。

在另一个特定的实施方案中，所述对象患有由一种或多种微生物物种引起的脓毒症。特别是，所述对象可患有由细菌、真菌或病毒感染引起的脓毒症。在又一个实施方案中，所述脓毒症是由细菌感染引起的。

在一个特定的实施方案中，所述治疗或预防的方法由施用作为单一活性成分的NTZ、TZ或TZG组成。

本文中使用的术语“治疗”涉及治疗性措施和预防性措施两种，其中目标是防止或减缓(减轻)不希望的生理性变化或紊乱。有益或期望的临床结果包括但不限于缓解症状、稳定病理状态(具体是不恶化)、减缓或终止疾病的进展、改善或减轻病理。特别是，为了本发明的目的，治疗旨在减缓脓毒症的进展和降低进一步并发症的风险。与如果没有接受治疗的情况下的预期存活期相比，它还可以涉及延长存活期。在一个特定的实施方案中，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐用于降低与脓毒症相关的死亡率。NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐也可以用于减缓或终止脓毒症的进展。特别是，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐用于预防患有脓毒症的对象的脓毒症进展，特别是预防脓毒症进展为脓毒性休克。在另一个实施方案中，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐用于预防患有脓毒症的对象的器官衰竭，特别是多器官衰竭。

在本发明的上下文中，NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐以治疗有效的量施用于所述对象。在一个特定的实施方案中，施用NTZ或TZ或其药学上可接受的盐。在一个进一步的实施方案中，给所述对象施用NTZ或其药学上可接受的盐，特别是NTZ。

“治疗有效量”是指有效达到期望的治疗效果的药物量。药物的治疗有效量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及药物在个体中引起预期反应的能力等因素而异。治疗有效量也是药剂的治疗有益效果胜过任何毒性或有害效果的量。药物的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或状况，并且可以由本领域技术人员确定。具有本领域普通技术的医师可以容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医师可以将药物组合物中所用药物的剂量以低于达到预期治疗效果所需的水平开始，并逐渐增加剂量，直到达到预期效果。一般而言，本发明的组合物的适当剂量是根据特定剂量方案产生治疗效果的最低有效剂量的化合物量。这样的有效剂量通常将取决于上述因素。

NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐可以配制成药物组合物，所述药物组合物还包含一种或几种药学上可接受的赋形剂或介质(例如，盐水溶液、生理溶液、等渗溶液等)，所述赋形剂或介质与药物用途相容并且是本领域普通技术人员公知的。

这些组合物还可以进一步包含一种或几种从分散剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂等中选择的剂或介质。可用于这些制剂(液体和/或注射剂和/或固体)的剂或介质特别是甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚山梨醇酯80、甘露醇、明胶、乳糖、植物油、阿拉伯胶、脂质体等。

这些组合物可以配制成可注射悬浮液、糖浆、凝胶、油、软膏、丸剂、片剂、栓剂、粉剂、凝胶胶囊、胶囊、气雾剂等的形式，最终借助于盖伦形式或装置来确保延长释放和/或缓慢释放。对于这种制剂，可以有利地使用诸如纤维素、碳酸酯或淀粉之类的剂。

NTZ或TZ(G)可以是药学上可接受的盐的形式，特别是与药物用途相容的酸或碱盐。NTZ和TZ(G)的盐包括药学上可接受的酸加成盐、药学上可接受的碱加成盐、药学上可接受的金属盐、铵盐和烷基化铵盐。这些盐可以在所述化合物的最终纯化步骤期间获得，或者通过将所述盐纳入先前纯化的化合物中获得。

NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐可以通过不同的途径以不同的形式施用。例如，所述化合物可以通过全身性方式、经口、胃肠外、通过吸入、通过鼻腔喷雾、通过鼻腔滴注、或通过注射例如静脉注射、通过肌内途径、通过皮下途径、通过经皮途径、通过局部途径、通过动脉内途径等施用。当然，根据本领域技术人员公知的程序，所述施用途径将适应药物的形式。

在一个特定的实施方案中，所述化合物被配制为片剂。在另一个特定的实施方案中，所述化合物是口服施用的。

有关施用的频率和/或剂量可以由本领域普通技术人员针对患者的功能、病理、施用形式方面进行调整。通常，NTZ或TZ(G)可以按0.01mg/天至4000mg/天之间的剂量施用，例如从50mg/天至2000mg/天，例如从100mg/天至2000mg/天；特别是从100mg/天至1000mg/天。在一个特定的实施方案中，所述NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐以约1000mg/天、特别是以1000mg/天的剂量施用。在一个特定的实施方案中，所述NTZ、TZ(G)或其药学上可接受的盐以约1000mg/天、特别是以1000mg/天的剂量、特别是作为片剂口服施用。如有必要，可以每天一次或甚至每天数次施用。在一个实施方案中，所述化合物以每天至少一次施用，如每天一次、每天两次、或每天三次施用。在一个特定的实施方案中，所述化合物每天施用一或两次。特别是，口服施用可以在用餐期间，例如在早餐、午餐或晚餐期间，通过服用包含约1000mg剂量、特别是1000mg剂量的所述化合物的片剂来每天一次进行。在另一个实施方案中，每天两次口服施用片剂，例如通过在一餐期间施用包含约400mg、约500mg或约600mg剂量、特别是500mg剂量的所述化合物的第一片，并在同一天的另一餐期间，施用包含约500mg剂量、特别是500mg剂量的所述化合物的第二片。

在另一个特定的实施方案中，NTZ或TZ(G)的施用与另一活性成分相结合进行，优选与抗微生物剂如抗生素、抗真菌剂或抗病毒剂相结合。当然，如本领域所公知的，最合适的抗微生物剂将根据造成感染的生物体或病毒来选择。在一个特定的实施方案中，脓毒症是由细菌感染引起的，而所述抗微生物剂是抗生素。可用于治疗细菌感染的抗生素是在本领域中公知的。说明性的抗生素家族包括但不限于β-内酰胺类抗生素(例如青霉素类)、四环素类、头孢菌素类、喹诺酮类、林可霉素类、大环内酯类、磺胺类、糖肽类、氨基糖苷类和碳青霉烯类。在一个特定的实施方案中，NTZ或TZ(G)可以与碳青霉烯类家族如厄他培南联合。

NTZ或TZ(G)和所述抗微生物剂可以在同一个或分开的药物组合物中施用于所述对象。在一个特定的实施方案中，本发明提供了一种包含NTZ或TZ(G)、抗微生物剂和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。这种药物组合物可以在本发明的方法中用于治疗或预防脓毒症。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中

包含NTZ或TZ(G)和药学上可接受的赋形剂的第一药物组合物；和

包含抗微生物剂的第二药物组合物；

均被施用于所述对象以治疗或预防脓毒症。

所述第一和第二药物组合物可以同时、分别或顺序(即，所述第一药物组合物可以在所述第二药物组合物之前或之后施用)使用。因此，本发明还提供了一种药盒(kit-of-parts)，所述药盒包括：

包含NTZ或TZ(G)和药学上可接受的赋形剂的第一药物组合物；和

包含抗微生物剂的第二药物组合物；

以在治疗或预防脓毒症中同时、分别或顺序使用。

以下实施例用于说明本发明，而决不能被视为限制其范围。

实施例

实施例1：NTZ在脓毒症临床前模型中改善存活率

通过盲肠结扎穿刺手术(CLP)诱导的多微生物脓毒症以全身性炎症反应失调继以免疫抑制为特征。小鼠的CLP模型模拟了人类脓毒症的进展和特征，因此也可用于确定药物在预防脓毒症向脓毒性休克的转变的处理中是否会有效。

该研究旨在调查在CLP模型中NTZ对C57BL6J(BL6)雄性小鼠的效力。基于研究时期内动物的存活率来评价试验化合物的效力。

为了最大限度地减少应激，对动物的的操控小心地进行。所有实验都遵照法国农业部(French Ministry of Agriculture)关于用实验室动物的实验的指导方针(第87-848号法律)进行。所述研究遵照动物健康法规(Animal Health Regulation)(关于动物保护的2010年9月22日的理事会第2010/63/UE号指令和2013年2月1日的法国第2013-118号法令)实行。

盲肠结扎穿刺手术

将9周龄且到达时体重23-25g的C57BL6J雄性小鼠(供应商Janvier-France)用250μL的赛拉嗪/氯胺酮溶液(氯胺酮(Imalgene，Boehringer，德国)6.75mg/kg和赛拉嗪(Rompund 2％，Bayer，德国)2.5mg/kg)通过腹膜内途径麻醉。在腹部中线作1-1.5cm切口，定位盲肠并在盲肠远端和底部之间距离的一半处用4-0丝线(轻度(mild grade))紧密结扎。中间结扎后，用21号针从肠系膜向肠系膜对向方向一次穿透盲肠。挤出少量的粪便以确保伤口是开放的。然后盲肠放回到其在腹部内的原始位置，并用缝线和创缘夹闭合腹部。跟踪小鼠的体重演变和死亡率，直到第7天。

处理方案

NTZ(Interchim，法国)以50mg/kg BID通过经口管饲法施用。NTZ处理在CLP之前3天开始。手术当天，在CLP之前1小时给予NTZ 1次(50mg/kg)，然后当动物从麻醉苏醒后第二次给予NTZ(50mg/kg)。然后每天继续BID处理，直到研究结束(n＝15)。接受NTZ介质(羧甲基纤维素(#C4888，Sigma-Aldrich，德国)BID的小鼠作为对照(n＝10)。

厄他培南10mg/kg(ORB134782/PO8952，Interchim/Biorbyt)用作药理参比对照，并在第0天手术之前1小时施用和CLP手术后每天继续施用(n＝10)。

结果

在仅接受所述介质的小鼠组中，CLP在手术后3天导致100％的致死率(图1)。相反，用NTZ处理的小鼠中的47％在手术后3天仍然存活，甚至在干预后7天仍有33％的小鼠存活。值得注意的是，NTZ甚至比药理参比厄他培南更好地改善了存活率，后者在研究结束时仅挽救了10％的小鼠。

结论，NTZ对CLP诱导的多微生物脓毒症小鼠的存活率具有有益的效应。

实施例2：NTZ保护肝细胞免于细胞因子诱导的凋亡

在脓毒症向脓毒性休克转变期间发生的失控的细胞因子风暴导致不同组织中的细胞死亡，从而可能危及重要器官如肝脏的功能。

该研究旨在调查NTZ保护肝细胞免受细胞损伤、特别是细胞因子诱导的凋亡的效力。

TNFα诱导的人肝细胞凋亡的评价

为了评价NTZ对经历细胞因子诱导的细胞应激的人肝细胞的效应，将人肝母细胞瘤衍生的HepG2细胞系(#85011430，ECACC，英国)在高葡萄糖DMEM培养基(#41965，Gibco，法国)中在有或者没有NTZ的活性代谢物TZ下在5％ CO2培养箱中37℃培养，所述高葡萄糖DMEM培养基补充有10％胎牛血清(FBS，#10270，Gibco)、1％青霉素/链霉素(#15140，Gibco)、1％丙酮酸钠(#11360，Gibco)和1％ MEM非必需氨基酸(#11140，Gibco)。

为了评价凋亡的替代标志——半胱天冬酶3/7的活性，将5×10

使用Caspase GlowTM 3/7测定法(#G8093，Promega，美国)测量半胱天冬酶3/7活性。使用Spark酶标仪(#30086376，Tecan，美国)测量发光。发光量(RLU)与半胱天冬酶3/7活性直接相关。

结果

HepG2与TNFα一起温育诱导凋亡，如半胱天冬酶3/7活性在10ng/ml TNFα下增加1.5倍并在30ng/ml下增加1.7倍所示，效应大小与凋亡诱导剂星形孢菌素相当(图2A)。在10ng/ml的TNFα存在下，用TZ处理以剂量响应方式显著降低半胱天冬酶活性(图2B)，在3μM的TZ剂量下，达到40％抑制。值得注意的是，用更高的TNFα剂量确认了该效应(图2C)。这些结果表明，TZ通过抑制半胱天冬酶活性来直接保护肝细胞免于细胞死亡。

实施例3：NTZ对肝细胞凋亡的直接且快速的效应

该研究旨在调查NTZ及其活性代谢物TZ在有或无预处理的情况下保护肝细胞免受强凋亡诱导剂、即星形孢菌素(一种激活半胱天冬酶的蛋白激酶抑制剂)诱导的细胞损伤的效力。

方案

将人肝母细胞瘤衍生的HepG

在铺在384孔板(#781080，Greiner，法国)中的1.5×10

结果

HepG2细胞与星形孢菌素一起温育强烈诱导凋亡，如半胱天冬酶3/7活性增加11倍所示(图3A)。当用作预处理时，TZ以剂量依赖性方式显著降低星形孢菌素诱导的半胱天冬酶活性，在6μM TZ的剂量下达到82％抑制(图3B)。有趣的是，在没有TZ预处理的情况下同时添加星形孢菌素与6μM TZ也使半胱天冬酶活性降低了64％(图4A)。在此条件下，NTZ显示出类似的效应，对半胱天冬酶活性的抑制为78％(图4B)。这些结果表明，NTZ及其活性代谢物TZ都是有效的凋亡抑制剂，保护肝细胞免受在脓毒症期间明显发生的细胞损伤。

实施例4：在没有NTZ预处理的情况下NTZ改善CLP小鼠的存活率

鉴于在体外观察到的NTZ的快速效应，我们在两种治愈性设置下调查了NTZ在CLP模型中防护脓毒症的效力。

如实施例1所述，在C57BL6J小鼠中通过CLP手术诱导多微生物脓毒症。如前所述准备NTZ，并如图5A所示，在CLP之前3天开始(3天预处理)或在CLP手术的同一天开始(没有预处理)以100mg/kg/天BID经口施用。将C57BL/6J雄性小鼠(8周龄，Janvier，法国)分为3组，每组24只小鼠，在7天环境适应后：

-第1组在CLP手术前接受3天介质并在手术后接受6天介质。

-第2组在CLP手术前接受3天硝唑尼特(NTZ)并在手术后接受6天硝唑尼特(预处理)。

-第3组在CLP手术前接受3天介质并在手术后接受6天NTZ(没有预处理)。

NTZ处理每天在上午9点和下午5点进行两次。在CLP手术当天(第0天)，小鼠在麻醉前1小时接受NTZ或介质(第2和3组)。

鼠脓毒症模型的严重程度的健康评分已经发表，以协调人类终点并对整个实验中动物之间观察到的等级进行归一化(Shrum B,Anantha RV,Xu SX等，在动物模型中评价脓毒症严重程度的稳妥评分系统(Arobust scoring system to evaluate sepsis severityin an animal model).BMC Res Notes 2014；7:233)。动物被个别观察，记录变化并根据变化的强度进行评分。观察包括外观、活动、对刺激的反应、睁眼、呼吸质量和体重演变方面的变化。对于这些临床体征中的每一个，严重程度都以0到3的尺度进行测量。追踪严重程度的演变，计算各时间点的平均评分，并绘制成图形。任意地，当老鼠死亡或被安乐死时，它们的评分为4。

结果

NTZ处理(有或没有3天预处理)大大改善了CLP诱导的脓毒症后的存活率(图5B)。虽然对照组中的死亡率在手术后55小时已经达到60％，但有或没有预处理的NTZ处理小鼠的死亡率分别只达到25％和17％。在研究结束时，有NTZ预处理的小鼠的45.8％、用NTZ处理的小鼠的58.3％存活，相比之下，未处理的小鼠仅有12.5％存活(图6)。

通过健康评分评估脓毒症严重程度的演变。在所有观察标准中，NTZ处理的小鼠(有或没有预处理)的评分低于对照小鼠，提示用NTZ的总体脓毒症严重程度较低并且改善动物健康(图7)。

实施例5：NTZ是在治愈性设置中高效率的有效脓毒症治疗

如之前所述，在C57BL6J小鼠中通过CLP手术诱导多微生物脓毒症，准备NTZ并经口施用。为了调查NTZ抵抗脓毒症的快速效应，在手术后，即当腹膜中的肠道微生物群发生细菌渗漏时，施用NTZ。如图8A所示，将C57BL/6J雄性小鼠(8周龄，Janvier，法国)分为3组，每组20只小鼠：

-第1组在手术前1小时第二次施用介质，然后在手术后第二次施用并在CLP手术后的6天中每天2次施用。

-第2组在手术前1小时接受第一次施用硝唑尼特(NTZ)，然后在手术后3.5小时第二次施用NTZ(2次，50mg/kg)并在CLP手术后的6天中每天两次施用。

-第3组仅在手术后3.5小时接受第一次施用NTZ(100mg/kg)，然后在CLP手术后的6天中每天两次施用50mg/kg。

在所述手术后的6天期间，每天上午9点和下午5点以每只小鼠100mg/kg/天的剂量(经口，BID)进行2次NTZ处理。对照小鼠以同样的方式接受介质，以避免对照和处理小鼠之间的任何偏差。

结果

从CLP手术当天开始的NTZ处理，无论是在手术前和手术后(BID T-1h/T+3.5h)、还是仅在手术后的NTZ处理(QD T+3.5h)，都对存活率有显著的有益效应(图8B)。虽然对照组在手术后55小时的死亡率已达55％，但以NTZ BID T-1h/T+3.5h和QD T+3.5h处理的小鼠的死亡率分别仅达到5％和15％。在研究结束时(第7天)，以NTZ BID T-1h/T+3.5h和QD T+3.5h处理的小鼠分别有80％和70％从脓毒症中存活，相比之下，未处理的小鼠只有20％存活(图8C)。如前面所述，也通过健康评分评估脓毒症严重程度的演变。接受QD T+3.5h NTZ处理的小鼠在所有观察标准上的评分均改善，提示在脓毒症诱导后脓毒症的总体严重程度较低并且健康有很大改善(图9)。

结论

总之，这些结果表明，NTZ是一种非常快速而有效的化合物，在脓毒症中保护免于细胞死亡并改善健康和存活率。