一种包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒及其应用。

背景技术

克霉唑为广谱、低毒的咪唑类抗真菌药，通过抑制真菌14α-去甲基化酶以抑制羊毛甾醇14位脱甲基，从而抑制麦角甾醇的生物合成，损伤真菌细胞膜并改变其通透性，导致胞内重要物质外漏而杀灭真菌，是局部治疗念珠菌性阴道炎的首选用药。但是阴道存在自我清除机制以清除病原体、外来颗粒、脱落细胞及黏液等，这也构成了阴道给药的一大挑战，传统剂型如乳膏、栓剂、阴道片容易随着阴道液被排出，导致药物滞留时间短，药效降低，从而需要频繁给药，患者顺应性差。同时阴道黏膜表面覆盖着黏液，在保护机体的同时也是药物递送的屏障，其三维网状结构通过空间位阻及各种相互作用力阻碍药物进一步渗透到达上皮细胞表面，对于侵袭性念珠菌的杀伤力降低。

纳米药物载体因具备增强黏膜黏附或黏液渗透性、改善药物分布、可调控药物释放、提高药物稳定性等特点，已被广泛应用于阴道递送药物。有学者利用脂质体阴道递送克霉唑，并采用壳聚糖进行包衣修饰，最终增加了制剂的黏膜粘附性，延长了载体的滞留时间[International Journal of Pharmaceutics,2014,472(1-2):94-101.]。也有学者将聚丙烯酸树脂

聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PEG-PLGA)是广泛应用的可生物降解的高分子聚合物，当PEG含量低于25％时该聚合物可形成纳米粒。PLGA嵌段向内包载疏水性药物，PEG嵌段则在纳米粒表面形成致密的中性亲水性涂层，减少纳米粒与黏液黏蛋白间的粘附性相互作用，从而快速穿透黏液层。

发明内容

本发明的目的是提供一种包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒，采用以下步骤制备：

步骤1，将克霉唑与PEG-PLGA溶解于丙酮中，得到含药有机相；

步骤2，将稳定剂溶解于纯化水中，得到水相；

步骤3，在搅拌条件下将含药有机相逐滴加入水相中，混合后旋蒸除去丙酮，得到纳米粒胶体溶液；

步骤4，将纳米粒胶体溶液离心重悬并干燥，得到包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒。

进一步地，步骤1中，所述克霉唑与PEG-PLGA的质量比为1:5～1:20，优选为1:12～1:20，最佳为1:12；所述含药有机相中克霉唑浓度为0.5～2.0mg/mL，优选为1.0～1.5mg/mL，最佳为1.0mg/mL。

进一步地，所述PEG-PLGA，聚乙二醇的重均相对分子质量为5000，聚乳酸-羟基乙酸链段的重均相对分子质量为20000。所述聚乳酸-羟基乙酸链段中的乳酸与羟基乙酸两种单体摩尔比为50:50。

进一步地，步骤2中，所述稳定剂为泊洛沙姆P188(P188)或聚乙烯醇(PVA)，优选为泊洛沙姆P188；所述水相中稳定剂含量为0.5～2.0％，优选为1.5％。

进一步地，步骤3中，所述含药有机相与水相体积比为1:2～1:10，优选为1:6；所述搅拌的速度为400～700rpm，优选为700rpm。

本发明采用纳米沉淀法制备包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒，致密的PEG包衣能有效提高纳米粒的黏液渗透性。据研究，黏液的平均孔径为(340±70)nm，且黏蛋白带负电，因此小粒径有利于纳米粒通过黏液层，负电荷也能避免纳米粒与黏液产生静电相互作用。最终纳米粒的粒径为(95.79±1.87)nm，PDI为(0.102±0.046)，粒径分布均匀，Zeta电位为(-9.39±0.94)mV，纳米粒的最终包封率为(70.22±2.01)％。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明的包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒采用了生物相容性好、可降解的载体材料聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物进行制备。

2、本发明首次采用PEG-PLGA包载克霉唑用于阴道递送，得到的纳米粒外观圆整，粒径均一，包封率良好。

3、本发明的纳米粒因PEG修饰有效减少了与黏液间的粘附性相互作用，纳米粒能够快速通过黏液层到达阴道黏膜表面释放药物，延长药物滞留时间，提高药效。

附图说明

图1为不同稳定剂及含量下纳米粒的包封率结果。

图2为不同药脂比下纳米粒的包封率结果。

图3为不同药物浓度下纳米粒的包封率结果。

图4为不同油水比下纳米粒的包封率结果。

图5为不同搅拌速度下纳米粒的包封率结果。

图6为包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒的透射电镜图。

图7为克霉唑的游离溶液及PEG-PLGA纳米粒的体外释放曲线。

图8为PEG-PLGA纳米粒及PLGA纳米粒的体外黏液渗透性。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一种包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒，制备方法如下：

1、将克霉唑与PEG-PLGA溶解于适量丙酮中，得到含药有机相；

2、将稳定剂溶解于适量纯化水中，得到水相；

3、在磁力搅拌下将含药有机相逐滴加入水相中，随后进行减压旋蒸除去丙酮，得到纳米粒胶体溶液；

4、将纳米粒胶体溶液离心重悬并干燥，即得包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒。

(一)稳定剂种类及含量对制备包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒的影响

1、精密称取克霉唑4mg及PEG-PLGA 40mg充分溶解于4mL丙酮中，得到含药有机相；

2、按表1所示处方称取各稳定剂溶解于纯化水中，得到规定含量稳定剂的水相；

3、在磁力搅拌下采用注射器(5号针头)将含药有机相逐滴加入24mL水相中，搅拌速度为700rpm，继续搅拌10min后进行减压旋蒸，得到纳米粒胶体溶液；

4、将纳米粒胶体溶液离心重悬并干燥，即得包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒。

采用纳米粒度及Zeta电位分析仪测定样品的粒径、PDI和Zeta电位，平行测定三次。采用超速离心法测定纳米粒的包封率：将纳米粒胶体溶液以16000rpm离心60min，取上清液测定游离药物量W

结果如表1及图1所示。

表1不同稳定剂及含量下纳米粒的粒径与Zeta电位结果(

由以上结果可知，当稳定剂为PVA时，制得的纳米粒粒径较大且有少许大颗粒，导致PDI＞0.3，粒径分布不均匀，且包封率整体小于P188做稳定剂时的包封率。当稳定剂为P188时，粒径小于100nm且分布均匀，0.5～2.0％含量下制得的纳米粒粒径及Zeta电位相近，但是当P188含量为1.5％时包封率最大。因此，本发明所述稳定剂优选为P188，含量优选为1.5％。

(二)药脂比对制备包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒的影响

1、固定PEG-PLGA质量为40mg，按表2所示药脂比精密称取相应质量的克霉唑，将二者充分溶解于4mL丙酮中，得到含药有机相；

2、精密称取处方量P188溶解于纯化水中，得到含1.5％P188的水相；

3、在磁力搅拌下采用注射器(5号针头)将含药有机相逐滴加入24mL水相中，搅拌速度为700rpm，继续搅拌10min后进行减压旋蒸，得到纳米粒胶体溶液；

4、将纳米粒胶体溶液离心重悬并干燥，即得包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒。

采用纳米粒度及Zeta电位分析仪测定样品的粒径、PDI和Zeta电位，平行测定三次。采用超速离心法测定纳米粒的包封率：将纳米粒胶体溶液以16000rpm离心60min，取上清液测定游离药物量W

结果如表2及图2所示。

表2不同药脂比下纳米粒的粒径与Zeta电位结果(

由以上结果可知，当药脂比为1:5时，即投药量为8mg，投药量过大导致药物不能被完全包载，有许多药物颗粒析出，PDI高达0.401±0.069，因此未测定该处方的包封率。发现随着投药量的降低，即PEG-PLGA比例相对增加，包封率逐渐升高，药脂比在1:12～1:20时包封率相差不大。因此，本发明所述药脂比优选为1:12。

(三)药物浓度对制备包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒的影响

1、固定药脂比为1:12，按表3所示药物浓度精密称取相应质量的克霉唑及PEG-PLGA，充分溶解于4mL丙酮中，得到含药有机相；

2、精密称取处方量P188溶解于纯化水中，得到含1.5％P188的水相；

3、在磁力搅拌下采用注射器(5号针头)将含药有机相逐滴加入24mL水相中，搅拌速度为700rpm，继续搅拌10min后进行减压旋蒸，得到纳米粒胶体溶液；

4、将纳米粒胶体溶液离心重悬并干燥，即得包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒。

采用纳米粒度及Zeta电位分析仪测定样品的粒径、PDI和Zeta电位，平行测定三次。采用超速离心法测定纳米粒的包封率：将纳米粒胶体溶液以16000rpm离心60min，取上清液测定游离药物量W

结果如表3及图3所示。

表3不同药物浓度下纳米粒的粒径与Zeta电位结果(

由以上结果可知，当药物浓度为1.0mg/mL时，纳米粒的包封率最大，且粒径大小合适。因此，本发明所述有机相中药物浓度优选为1.0mg/mL。

(四)油水比对制备包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒的影响

1、精密称取克霉唑4mg及PEG-PLGA 48mg，充分溶解于4mL丙酮中，得到含药有机相；

2、精密称取处方量P188溶解于纯化水中，得到含1.5％P188的水相；

3、按表4所示油水体积比，在磁力搅拌下采用注射器(5号针头)将含药有机相逐滴加入相应体积的水相中，搅拌速度为700rpm，继续搅拌10min后进行减压旋蒸，得到纳米粒胶体溶液；

4、将纳米粒胶体溶液离心重悬并干燥，即得包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒。

采用纳米粒度及Zeta电位分析仪测定样品的粒径、PDI和Zeta电位，平行测定三次。采用超速离心法测定纳米粒的包封率：将纳米粒胶体溶液以16000rpm离心60min，取上清液测定游离药物量W

结果如表4及图4所示。

表4不同油水比下纳米粒的粒径与Zeta电位结果(

由以上结果可知，不同油水比下纳米粒的粒径与Zeta电位结果相近，包封率随着水相比例的增加而增加，在达1:6～1:10时基本不变。因此，本发明所述油水相体积比优选为1:6。

(五)搅拌速度对制备包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒的影响

1、精密称取克霉唑4mg及PEG-PLGA 48mg，充分溶解于4mL丙酮中，得到含药有机相；

2、精密称取处方量P188溶解于纯化水中，得到含1.5％P188的水相；

3、按表5所示转速边搅拌边用注射器(5号针头)将含药有机相逐滴加入24mL水相中，滴加完毕继续搅拌10min后进行减压旋蒸，得到纳米粒胶体溶液；

4、将纳米粒胶体溶液离心重悬并干燥，即得包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒。

采用纳米粒度及Zeta电位分析仪测定样品的粒径、PDI和Zeta电位，平行测定三次。采用超速离心法测定纳米粒的包封率：将纳米粒胶体溶液以16000rpm离心60min，取上清液测定游离药物量W

结果如表5及图5所示。

表5不同搅拌速度下纳米粒的粒径与Zeta电位结果(

由以上结果可知，转速为700rpm时，纳米粒的粒径最小，包封率最高。因此，本发明所述搅拌速度优选为700rpm。

实施例2

对实施例1按最优处方制备的包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒进行以下质量评价。

(一)粒径、Zeta电位及包封率

最终包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒的粒径为(95.79±1.87)nm，PDI为(0.102±0.046)，粒径分布范围窄，Zeta电位为(-9.39±0.94)mV，包封率达(70.22±2.01)％。

(二)微观形态观察

采用透射电子显微镜观察纳米粒的微观形态，结果如图6所示。

由以上结果可知，包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒外观圆整，呈近球形，尺寸约为100nm，与纳米粒度及Zeta电位分析仪测定的粒径结果相一致。

(三)体外释放度

采用动态透析法进行包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒的体外释放度研究。释放介质为含0.5％十二烷基硫酸钠的模拟阴道液(SVF)，SVF的制备方法如下：分别称取氯化钠3.51g、氢氧化钾1.40g、氢氧化钙0.222g、牛血清白蛋白0.018g、乳酸2.00g、醋酸1.00g、甘油0.16g、尿素0.40g以及葡萄糖5.00g置于烧杯中，加入900mL纯化水充分搅拌至溶解，采用盐酸将pH调节至4.2后，加入剩余量纯化水至溶液总体积为1L。取纳米粒胶体溶液或游离克霉唑溶液约8mL(药物实际含量均为1.2mg)于透析袋中(MWCO≈14kDa)中，将透析袋两端折叠后用夹子封口，浸入120mL的释放介质中，于37℃、100rpm下进行恒温振荡，分别于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、24、48、72、96h取样2mL，并立即补充相同体积相同温度的释放介质。测定样品中药物浓度，并按以下公式计算累积释放度。

其中C

结果如图7所示。由以上结果可知，包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒对药物具有缓释作用。发现游离克霉唑溶液同样释放缓慢，这可能是因为透析袋对疏水性药物克霉唑的释放存在一定阻碍作用。

(四)体外黏液渗透性

采用Transwell小室评价包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒的黏液渗透性。模拟阴道黏液(SVM)的制备方法如下：分别称取氯化钠0.351g、氢氧化钾0.140g、氢氧化钙0.022g、胃粘蛋白1.500g、乳酸0.200g、醋酸0.100g、甘油0.016g、尿素0.040g以及葡萄糖0.500g置于烧杯中，加入适量纯化水充分搅拌至溶解，采用盐酸将pH调节至4.2后补充纯化水至100mL。随后量取100μL SVM均匀平铺在Transwell小室的PC膜上，保证完整覆盖。按上述相同方法制备未修饰PEG的包载克霉唑的PLGA纳米粒，并以其作为对照，分别向上室加入500μL纳米粒胶体溶液(两种制剂药物浓度相等)，向下室加入1.5mL SVF，确保液面与PC膜之间没有气泡。将培养板置于37℃、100rpm下振荡孵育，分别于1、2、3、4、5h取样500μL，并立即补充相同体积相同温度的SVF。测定样品中药物浓度，并按以下公式计算纳米粒的累积渗透率。

其中C

结果如图8所示。由以上结果可知，在5h内包载克霉唑的PEG-PLGA纳米粒的累积渗透率始终高于PLGA纳米粒，最终PEG-PLGA纳米粒的渗透量为PLGA纳米粒的1.7倍，证明其具有优良的黏液渗透性能。