一种硫酸安普霉素中硫酸安普霉素有关物质的检测方法

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及一种硫酸安普霉素中硫酸安普霉素有关物质的检测方法。

背景技术

硫酸安普霉素(Apramycin Sulfate)，又称“暗霉素硫酸盐”，为氨基环醇类抗生素，它对畜禽易感染的革兰氏阴性菌与部分革兰氏阳性菌有较强的抗菌活性，特别是对其它抗生素耐药的大肠杆菌和沙门氏菌等致病菌有相当强的抗菌作用，而且不易产生耐药性。主要用于防治猪、鸡、牛等畜禽因大肠杆菌、沙门氏菌感染导致的痢疾、腹泻、发育不良等疾病，疗效非常显著，被美国FDA推荐为治疗大肠杆菌的首选药物。它作为药物型饲料添加剂，能增加畜禽体重和提高饲料转化率，在畜禽养殖领域得到广泛应用。硫酸安普霉素原料药在《中国兽药典》(CVP 2020)、英国药典(BP 2022)均有收录。硫酸安普霉素在药物制备和贮存过程会产生杂质，这些杂质的结构与硫酸安普霉素相关，一般称为硫酸安普霉素有关物质。硫酸安普霉素有关物质的测定均采用柱后衍生法，柱后衍生法中流动相和衍生试剂缓冲盐浓度过高，易出现盐析、仪器故障的情况，重现性差；并且茚三酮试液需要在氮气保护下使用，操作人员的操作过程存在安全风险。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种硫酸安普霉素中硫酸安普霉素有关物质的检测方法。本发明提供的检测方法重现性好。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种硫酸安普霉素中硫酸安普霉素有关物质的检测方法，包括以下步骤：

将待测硫酸安普霉素溶解，得到供试品溶液；

将所述供试品溶液进行高效液相色谱检测，得到色谱信息；

以所述色谱信息中硫酸安普霉素的峰面积为基准，得到硫酸安普霉素有关物质相对所述硫酸安普霉素的含量；

所述高效液相色谱检测的参数包括：

色谱柱为Thermo Acclaim

流动相为三氟乙酸体积含量为2％、七氟丁酸体积含量为0.1％的水溶液；

检测器为蒸发光散射检测器。

优选地，所述色谱柱的尺寸为4.6mm×150mm，3μm。

优选地，所述色谱柱的柱温为25～40℃。

优选地，所述流动相的流速为0.5～0.8mL/min。

优选地，洗脱的方式为等度洗脱。

优选地，所述高效液相色谱检测的参数还包括：进样量为20μL。

优选地，所述蒸发光散射检测器的漂移管的温度为110℃，气体流速为3.0mL/min。

本发明提供了一种硫酸安普霉素中硫酸安普霉素有关物质的检测方法，包括以下步骤：将待测硫酸安普霉素溶解，得到供试品溶液；将所述供试品溶液进行高效液相色谱检测，得到色谱信息；以所述色谱信息中硫酸安普霉素的峰面积为基准，得到硫酸安普霉素有关物质相对所述硫酸安普霉素的含量；所述高效液相色谱检测的参数包括：色谱柱为Thermo Acclaim

本发明提供的检测方法以Thermo Acclaim

附图说明

图1为对照品溶液的色谱图；

图2为供试品溶液的色谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种硫酸安普霉素中硫酸安普霉素有关物质的检测方法，包括以下步骤：

将待测硫酸安普霉素溶解，得到供试品溶液；

将所述供试品溶液进行高效液相色谱检测，得到色谱信息；

以所述色谱信息中硫酸安普霉素的峰面积为基准，得到硫酸安普霉素有关物质相对所述硫酸安普霉素的含量；

所述高效液相色谱检测的参数包括：

色谱柱为Thermo Acclaim

流动相为三氟乙酸体积含量为2％、七氟丁酸体积含量为0.1％的水溶液；

检测器为蒸发光散射检测器。

在本发明中，如无特殊说明，本发明所用原料均优选为市售产品。

本发明将待测硫酸安普霉素溶解，得到供试品溶液。

在本发明中，所述溶解的试剂优选为水，所述水优选为去离子水。在本发明中，所述供试品溶液的浓度优选为4mg/L。

得到供试品溶液后，本发明将所述供试品溶液进行高效液相色谱检测，得到色谱信息。

在本发明中，所述高效液相色谱检测的参数包括：色谱柱为Thermo Acclaim

在本发明中，流动相为三氟乙酸体积含量为2％、七氟丁酸体积含量为0.1％的水溶液；所述流动相的流速优选为0.5～0.8mL/min，进一步优选为0.6～0.7mL/min。在本发明中，洗脱的方式优选为等度洗脱。

在本发明中，所述高效液相色谱检测的参数优选还包括：进样量优选为20μL。

在本发明中，检测器为蒸发光散射检测器(ELSD)；所述蒸发光散射检测器的漂移管的温度优选为110℃，气体流速优选为3.0mL/min。

得到色谱信息后，本发明以所述色谱信息中硫酸安普霉素的峰面积为基准，得到硫酸安普霉素有关物质相对所述硫酸安普霉素的含量。

本发明对以所述色谱信息中硫酸安普霉素的峰面积为基准，得到硫酸安普霉素有关物质相对所述硫酸安普霉素的含量的方式不做具体限定，采用本领域技术人员熟知的操作即可。

下面结合实施例对本发明提供的硫酸安普霉素中硫酸安普霉素有关物质的检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

以下实施例所用的材料、仪器及方法如下：

1.材料与仪器

1.1材料

硫酸安普霉素(山东齐发药业有限公司)；三氟乙酸(sgima)、七氟丁酸(sgima)。

1.2仪器

高效液相色谱仪(Agilent 1260，Thermo UltiMate 3000)；蒸发光散射检测器(奥泰6000)。

2.方法

2.1色谱条件

检测器：蒸发光散射检测器(ELSD)；

色谱柱：Thermo Acclaim

流动相：三氟乙酸体积含量为2％、七氟丁酸体积含量为0.1％的水溶液；

洗脱方式：等度洗脱；

流动相的流速：0.6mL/min；进样量：20μL；柱温：30℃。

ELSD漂移管温度：110℃，气体流速：3.0mL/min。

2.2溶液配制

空白溶液：水。

对照品溶液：精密称取硫酸安普霉素对照品200mg于50mL容量瓶中，加水溶解、稀释、定容。

对照溶液(1)：精密吸取对照品溶液0.2mL至100mL容量瓶中，加水稀释定容。

对照溶液(2)：精密吸取对照品溶液1.0mL至100mL容量瓶中，加水稀释定容。

对照溶液(3)：精密吸取对照品溶液10.0mL至100mL容量瓶中，加水稀释定容。

供试品溶液：精密称取硫酸安普霉素200mg于50mL容量瓶中，加水溶解、稀释、定容。

实施例1

专属性

按照2.2项下条件配制空白溶液、对照溶液(1)、对照溶液(2)、对照溶液(3)、未破坏空白样品溶液。

破坏试验：

酸破坏：精密称取硫酸安普霉素200mg于50mL容量瓶中，加2mol/L的盐酸溶液1mL放置6h后用2mol/L的氢氧化钠中和，并用水稀释至刻度，摇匀。

碱破坏：精密称取硫酸安普霉素200mg于50mL容量瓶中，加2mol/L的氢氧化钠1mL放置6h后用2mol/L的盐酸溶液中和，并用水稀释至刻度，摇匀。

氧化破坏：精密称取硫酸安普霉素200mg于50mL容量瓶中，加30％的双氧水1mL放置6h后，用水稀释至刻度，摇匀。

高温破坏：精密称取60℃下放置10天的硫酸安普霉素样品200mg于50mL容量瓶中，加溶剂水稀释至刻度，摇匀。

高湿破坏：精密称取饱和氯化钠下放置5天的硫酸安普霉素样品200mg于50mL容量瓶中，加溶剂水稀释至刻度，摇匀。

光照破坏：精密称取在5000Lx和83.5μw/cm

分别进空白溶液、对照溶液(1)、对照溶液(2)、对照溶液(3)、未破坏的空白样品溶液和各条件下的破坏溶液，按照2.1的色谱条件进行检测，结果为：空白溶液中无干扰峰；以对照溶液(1)、对照溶液(2)和对照溶液(3)三个溶液浓度的对数值和主峰面积的对数值作标准曲线，其相关系数为0.9993。各破坏溶液中安普霉素与相邻峰的分离度结果如表1所示。

表1各破坏溶液中安普霉素与相邻峰的分离度结果

从表1可以看出：各破坏溶液中安普霉素与相邻峰的分离度均大于1.0，符合要求。说明该方法的专属性良好。

对照品溶液和供试品溶液的色谱图分别如图1和图2所示。从图中可以看出：各色谱峰之间均有良好的分离度，说明该方法具有良好的指示稳定性。

实施例2

重复性

重复测试6份2.2中的供试品溶液，计算6份供试品溶液中单个杂质、其他单个杂质、总杂质，结果如表2所示。

表2重复性检测结果

从表2可以看出：RSD均不超过10.0％，说明6份供试品溶液中相关物质检测结果的RSD均符合要求。

实施例3

中间精密度

在不同实验室，不同人员使用不同的仪器(Agilent 1260(ELSD 6000)，ThermoUltiMate 3000(ELSD 6000))对相同的三批供试品溶液采用2.1的色谱条件连续检测3次，结果如表3所示。

表3中间精密度检测结果

从表3可以看出：在不同实验室，3次检测结果的RSD均不超过10.0％，说明3次检测结果的RSD均符合要求。

实施例4

定量限

用水将2.2中的对照品溶液稀释至信噪比为10的定量限溶液，定量限溶液采用2.1的色谱条件连续6次进样，所测定量限溶液的浓度与样品理论浓度的比值为定量限，结果如表4所示。

表4定量限检测结果

从表4可以看出：定量限溶液连续6次进样峰高的RSD为3.9％，不超过5.0％，符合要求。

实施例5

检测限

用水将2.2中的对照品溶液稀释至信噪比3的检测限溶液，检测限溶液采用2.1的色谱条件连续3次进样，所得检测限溶液浓度与样品理论浓度的比值为检测限，结果如表5所示。

表5检测限检测结果

从表5可以看出：检测限溶液连续3次进样峰高的RSD为2.1％，不超过10.0％，符合要求。

实施例6

标准曲线的绘制

用水将2.2中的对照品溶液稀释至定量限～10％的范围内，取定量限溶液作为标准曲线的第一个起点，然后再分别配制1.0％、2.0％、5.0％、10.0％的溶液，5个浓度的溶液各进样1次，以硫酸安普霉素浓度(mg/mL)的对数值为横坐标，以峰面积的对数值为纵坐标计算回归方程，结果为：回归方程Y＝1.4807X+1.3472，相关系数为0.9991，符合要求。

实施例7

准确度

取200mg对照品于50mL容量瓶中，用水分别稀释成每毫升含硫酸安普霉素约0.008mg、0.04mg、0.4mg的溶液，每个浓度配制3份，每份溶液采用2.1的色谱条件进样1次，测定该色谱方法的测试结果与真实值的差异，结果如表6所示。

表6准确度检测结果

从表6可以看出：回收率的范围为90.0～98.2％，表明测定结果与真实值接近，方法准确度符合要求。

实施例8

耐用性

在其他条件不变的情况下，在一定范围内改变色谱条件，如柱温改变±2℃、流速改变±0.1mL/min、使用不同批号的色谱柱，按方法进样所得到的图谱中安普霉素与相邻峰的分离度符合要求，表明，本发明提供的检测方法耐用性强。

实施例9

流动相的选择

硫酸安普霉素的极性较强，在一般的反相色谱柱上保留很弱，参考其他氨基糖苷类抗生素检测方法，在流动相中增加挥发性离子对试剂，增强安普霉素及相关物质在反相色谱柱上的保留。尝试使用体积浓度为1％的三氟乙酸溶液为流动相，发现安普霉素与相邻杂质峰分离度较差，且峰形差。三氟乙酸在流动相的作用除了作为离子对试剂外还可以改善峰形，因此尝试增加三氟乙酸的体积浓度，峰形得到改善，但是分离度仍不能达到理想效果。三氟乙酸的体积浓度太高会影响流动相的pH，从而影响色谱系统，因此不再增加三氟乙酸的体积浓度，在体积浓度为2％的三氟乙酸溶液中分别增加少量保留更强的离子对试剂-七氟丁酸和九氟戊酸，结果由于九氟戊酸的保留太强，样品无法被洗脱下来。体积浓度为0.1％的七氟丁酸的流动相条件下主成分与相邻杂质峰之间、各杂质峰之间均能得到较好的分离。

实施例10

色谱柱的选择

流动相中不含有机相，pH约为1.0，对色谱柱的耐水性及耐酸性要求较高。考察了5种亲水极性柱：Agilent Zorbax SB-Aq(4.6mm×250mm，5μm)，Perkinelmer Aq C18(4.6mm×250mm，5μm)，中谱科技PR-C18(4.6mm×250mm，5μm)，月旭LP-C18(4.6mm×250mm，5μm)，Thermo AcclaimTM AmG C18(4.6mm×250mm，3μm)对硫酸安普霉素的分离情况。

结果表明，这五款色谱柱中，Perkinelmer Aq C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱分离效果最好，但柱流失严重，基线噪声大，寿命最短。Thermo Acclaim

在选定的条件下，安普霉素与相邻峰的分离效果良好，线性范围宽，方法的重现性及精密度好，准确度高，且检测参数在一定范围内的变化对检测结果无影响。表明本发明提供的硫酸安普霉素有关物质的检测方法的专属性、重复性、精密度、准确度、线性范围、耐用性等均符合《中华人民共和国兽药典》中对于方法学研究的要求，能准确测定硫酸安普霉素中有关物质的含量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。