一种以稻草秸秆为主要基质的球孢白僵菌发酵培养方法

技术领域

本发明涉及生物菌体发酵培养技术领域，具体涉及一种以稻草秸秆为主要基质的球孢白僵菌发酵培养方法。

背景技术

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是广泛应用于害虫生物防治的一种昆虫病原真菌，国内外已有多种商品制剂注册生产。近年来由于化学农药的滥用，不仅造成环境污染，还对人畜健康产生危害，昆虫病原真菌具有防治效果好、无残留、昆虫不易产生抗性等一系列优点。白僵菌寄主范围广，具有致病力强、持效长、无毒无污染等优点，有广阔应用前景。球孢白僵菌的发酵技术较为成熟，发酵受影响因素较多，最主要因素有培养基成分组成、含水量、发酵周期等。目前球孢白僵菌发酵工艺原料常采用大米、大豆粉、玉米粉、麦麸、谷壳、米糠等。利用粮食类农产品为原料不仅成本较高，原料利用率问题也会导致粮食大量浪费。

秸秆是成熟农作物茎叶的总称，作为重要的生物质能源，用途很多，如燃料、肥料、家畜饲料等，但目前作物秸秆主要直接还田，但由于降解慢，还是带来了不少耕作方面的问题，需要有新的秸秆综合利用和深度利用技术出现。作物秸秆种类繁多，有纤维素、半纤维素、蛋白、酯类和微量元素等丰富营养成分，可以作为蘑菇等大型真菌培养基质使用，也具有微生物发酵基质的潜力。如果能利用秸秆作为重要昆虫病原真菌球孢白僵菌的固体发酵主基质，则不仅有效降低了白僵菌的工业化生产成本，还为秸秆的综合利用提供了新的科学应用途径。

公布号为CN104311230A的中国专利申请文献，公开了一种稻草发酵的姬松茸培养基及其制备方法，培养基由下列重量份的原料制成：稻草30-35、木屑30-35、甘蔗渣30-35、麦麸5-10、石灰粉1-2、硫酸铵0.5-0.6，过磷酸钙0.7-0.8，葡萄糖2-3、椰汁10-11、青稞粉18-19、次粉10-11、碳土8-10、豆粨11-12、石膏粉1-2、葡萄籽粉5-6、陶瓷粉8-9、玉竹5-6、桑寄生3-4、合欢皮4-5、梗通草2-3、废弃麻袋30-35、乳酸菌0.5-0.7、缓释营养添加剂11-13。该专利的培养基的与青稞粉、次粉等原料混合发酵，丰富了营养，也提高了食用菌的利用率。但该专利并未用稻草培养球孢白僵菌。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于如何解决以稻草为主要基质的球孢白僵菌的发酵产孢量较低的问题。

本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：

一种以稻草秸秆为主要基质的球孢白僵菌发酵培养方法，包括以下步骤：

(1)稻草秸秆预处理：先将稻草秸秆切割，搅碎成长纤维状，然后用化学溶液完全浸没稻草秸秆后，进行高压蒸汽灭菌处理，之后取出稻草秸秆用水冲洗干净，烘干；所述化学溶液为亚硫酸钠溶液、稀硫酸溶液中的一种或两种的混合；

(2)将复合发酵基质与球孢白僵菌种子发酵液，搅拌均匀，铺平，12L﹕12D光照条件下恒温发酵，即得；所述复合发酵基质由经步骤(1)处理获得的稻草秸秆和氮源添加物组成。

有益效果：本发明通过对稻草秸秆进行预处理，显著提高了球孢白僵菌的产孢量，且通过向基质中添加氮源，形成复合发酵基质，进一步提高了球孢白僵菌的产孢量。

优选的，所述步骤(1)中亚硫酸钠溶液、稀硫酸溶液的质量分数分别为8％和0.5％。

优选的，所述步骤(2)中复合发酵基质的初始含水率为65％。

优选的，所述步骤(2)中复合发酵基质的厚度为2cm。

优选的，所述步骤(2)中球孢白僵菌种子发酵液的接种量为15-25％。

优选的，所述步骤(2)中发酵的温度为24-26℃。

优选的，所述步骤(2)中复合发酵基质按质量百分数计，由60-80％的稻草秸秆和20-40％的氮源添加物组成。

优选的，所述氮源添加物为玉米粉、大豆粉中的一种或两种的混合。

优选的，所述步骤(2)中复合发酵基质按质量百分数计，由60％的经步骤(1)处理获得的稻草秸秆，30％玉米粉和10％大豆粉组成。

优选的，所述步骤(2)中复合发酵基质按质量百分数计，由60％的经步骤(1)处理获得的稻草秸秆，10％玉米粉和30％大豆粉组成。

本发明的优点在于：

1、本发明通过对稻草秸秆进行预处理，显著提高了球孢白僵菌的产孢量，且通过向基质中添加氮源，形成复合发酵基质，进一步提高了球孢白僵菌的产孢量。

2、本发明通过稻草经化学预处理后，白僵菌培养基产孢量都大大提高了，其中以酸性亚硫酸钠溶液和亚硫酸钠溶液预处理后产孢量提高最多，由未进行化学处理的2.87×10

3、本发明的复合发酵基质的产孢量远高于单一稻草秸秆发酵基质；且在复合发酵基质中，随着稻草所占培养基比例的下降，白僵菌在固体培养基上的产孢量逐渐上升。

附图说明

图1为本发明实施例1-3与对比例1-2稻草秸秆预处理后的外观形态图；

图2为本发明实施例1-3与对比例1-2的产孢量结果对比图；

图3为本发明实施例1与对比例1稻草预处理后稻草表层结构的扫描电镜对比图；

图4为本发明实施例1酸性亚硫酸钠预处理前后纤维素结晶度X衍射图；

图5为本发明实施例1发酵10d的基质产孢外观形态图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

实验所用菌株是由安徽学微生物防治省重点实验室提供的球孢白僵菌Bb202菌株，该菌株保藏在微生物防治安徽省重点实室RCEF菌种库中，国际微生物数据中心登记号为WDCM No.1031。

本发明所用的稻草秸秆来源于江苏宿迁，系作物成熟后收割。

实施例1：

一种以稻草秸秆为主要基质的球孢白僵菌发酵培养方法，包括以下步骤：

(1)稻草秸秆预处理：先将稻草秸秆切割成约2cm长度，再用粉碎机将稻草秸秆搅碎成长纤维状，将质量分数0.5％稀硫酸和8％亚硫酸钠的混合溶液500mL(v:v＝1:1)倒入1L锥形瓶，再按固液比1:20(g/mL)加入搅碎后的稻草秸秆，完全浸没稻草秸秆后，将锥形瓶封口并放在高压蒸汽灭菌锅中121℃反应20min，取出冷却后用水将稻草冲洗干净并置于60℃烘箱里12h烘干；

(2)将步骤(1)处理获得的稻草秸秆与大豆粉按质量比4:1的配比(即质量分数80％的稻草秸秆和20％的大豆粉)混合均匀，得到复合发酵基质(控制初始含水率在65％)，接入球孢白僵菌Bb202种子发酵液(接种量20％，mL/g)，搅拌均匀，铺平使基质的厚度为2cm，12L﹕12D光照条件下恒温25℃发酵10d充分产孢后即得，测定各处理产孢量，比较各处理产孢量差异。每个处理3个重复试验，结果取平均值。

本实施例的稻草秸秆预处理后的外观形态如图1中B所示；

产孢量的测定方法具体步骤如下：

用镊子从每个发酵瓶中的发酵基质中自表层到底层均匀取出两个约2cm*2cm的尺寸样块用于测定产孢量。将所取样块于电子天平上称量质量为m，再放入体积为V(50mL)的0.05％Tween-80溶液中，在旋转震荡仪上震荡15min后，双层纱布过滤获得孢子悬浮液,用血球计数板计算孢子悬浮液的浓度C。用水分测定仪测定培养基的含水率W，三个重复实验，最后计算两样块产孢量平均数做为该瓶培养基产孢量，每处理3瓶作为该处理的产孢量。每克干物质基质产孢量计算公式为：

实施例2：

本实施例与实施例1的区别在于：将“0.5％稀硫酸和8％亚硫酸钠的混合溶液500mL”替换为“2％稀硫酸溶液500mL”，其他步骤同实施例1。

本实施例的稻草秸秆预处理后的外观形态如图1中D所示；

实施例3：

本实施例与实施例1的区别在于：将“0.5％稀硫酸和8％亚硫酸钠的混合溶液500mL”替换为“8％亚硫酸钠溶液500mL”，其他步骤同实施例1。

本实施例的稻草秸秆预处理后的外观形态如图1中C所示；

实施例4：

本实施例与实施例1的区别在于：将复合发酵基质由“80％的稻草秸秆和20％的大豆粉”组成改为由“80％的稻草秸秆和20％玉米粉”组成，其他步骤同实施例1。

实施例5：

本实施例与实施例1的区别在于：将复合发酵基质由“80％的稻草秸秆和20％的大豆粉”组成改为由“70％的稻草秸秆、20％的玉米粉和10％大豆粉”组成，其他步骤同实施例1。

实施例6：

本实施例与实施例1的区别在于：将复合发酵基质由“80％的稻草秸秆和20％的大豆粉”组成改为由“70％的稻草秸秆、10％的玉米粉和20％大豆粉”组成，其他步骤同实施例1。

实施例7：

本实施例与实施例1的区别在于：将复合发酵基质由“80％的稻草秸秆和20％的大豆粉”组成改为由“60％的稻草秸秆、10％的玉米粉和30％大豆粉”组成，其他步骤同实施例1。

实施例8：

本实施例与实施例1的区别在于：将复合发酵基质由“80％的稻草秸秆和20％的大豆粉”组成改为由“60％的稻草秸秆、30％的玉米粉和10％大豆粉”组成，其他步骤同实施例1。

对比例1：

本对比例与实施例1的区别在于：将“0.5％稀硫酸和8％亚硫酸钠的混合溶液500mL”替换为“水500mL”，其他步骤同实施例1。

本对比例的稻草秸秆预处理后的外观形态如图1中A所示；

对比例2：

本对比例与实施例1的区别在于：将“0.5％稀硫酸和8％亚硫酸钠的混合溶液500mL”替换为“2％氢氧化钠溶液500mL”，其他步骤同实施例1。

本对比例的稻草秸秆预处理后的外观形态如图1中E所示；

对比例3：

本对比例与实施例1的区别在于：不使用复合发酵基质，只使用单一稻草秸秆(即100％稻草秸秆)为发酵基质，其他步骤同实施例1。

采用电子天平称量实施例1-3、对比例1-2稻草秸秆预处理前后稻草质量，计算稻草经各种预处理后的质量损失率。研究发现，稻草分别经过酸或碱不同预处理方式后外观形态都发生了明显改变(如图1中B-E所示)。稻草经实施例1酸性亚硫酸钠溶液高温预处理后颜色由黄褐色变为淡黄色，经称量，稻草质量损失率为26.5％；稻草经实施例3亚硫酸钠高温预处理后颜色变为黄色，比实施例1酸性亚硫酸钠溶液高温预处理后的颜色略深，稻草质量损失率为22.7％；稻草经实施例2稀硫酸高温预处理后颜色变为褐色，稻草质量损失率为42.6％；稻草经2％氢氧化钠溶液高温预处理后颜色变淡为黄色，稻草表面变粘稠容易粘到一起，应该是碱处理后木质素含量减少的结果，稻草质量损失率最大，为51.2％。

实施例1-3与对比例1-2的产孢量结果如图2所示，稻草经化学预处理后，白僵菌培养基产孢量都大大提高了，其中以实施例1酸性亚硫酸钠溶液和实施例3亚硫酸钠溶液预处理后产孢量提高最多，由未进行化学处理(即对比例1)的2.87×10

酸性亚硫酸钠预处理对稻草表层结构影响的扫描电镜(SEM)观察：

通过对比例1未经化学预处理和实施例1酸性亚硫酸钠溶液预处理的稻草表层结构的扫描电镜观察，其结果如图3所示，其中A1、A2和A3为对比例1未经化学预处理稻草外表面微观构造，B1、B2和B3为稻草经实施例1酸性亚硫酸钠溶液高温预处理后秸秆外表面微观构造发现，稻草经实施例1酸性亚硫酸钠溶液预处理后，稻草外表面形态仍较为完整，但外表面变粗糙，蜡质层被去除、角质层部分遭到破坏，比表面积变大，出现明显被腐蚀的痕迹。

酸性亚硫酸钠预处理前后稻草木质纤维素成分含量的比较：

将实施例1酸性亚硫酸钠化学处理前后的稻草粉碎至粉末状，用范氏法(VanSoest法)测定预处理前后稻草纤维素、半纤维素、木质素含量，结果如下表1所示：

表1酸性亚硫酸钠预处理前后的稻草纤维素、半纤维素、木质素含量

酸性亚硫酸钠预处理前后纤维素结晶度X衍射分析(XRD)：

纤维素结晶度用来描述纤维素中的有序的晶体结构(结晶区)所占的比例，纤维素非结晶区域更容易被微生物利用，用X衍射分析确定稻草经实施例1酸性亚硫酸钠化学预处理后秸秆纤维素结晶度的变化情况。将预处理前后稻草样品用球磨机球磨至200目后，用型号为D8 Fucos的X衍射仪(Bruker AXS，德国)分别检测，检测参数为：40kV,40mA,扫描角度2θ＝5～40°，速度2°/min,步长0.02°。得到的衍射图谱用软件Peak Fi(Sea Solve)进行解卷积，用高斯函数对曲线进行拟合。

相对结晶度的计算公式如下：

式中Ic为结晶峰的积分强度，Ia为非晶峰的积分强度。

在相对结晶度的计算过程中，将半高宽(FWHM)大于3°的衍射峰标定为非晶峰。将数据导入拟合软件Jade，对测试范围内的衍射峰进行全谱拟合，使用pseudo-Voigt函数描述衍射峰；对于有PDF的物相，直接使用PDF进行拟合。

得出结晶峰以及非晶峰积分面积数值，分析结果如图4所示，其中A为预处理前稻草X衍射图；B为预处理后稻草X衍射图，计算得出预处理前稻草纤维素结晶度为36.31％，预处理后稻草纤维素结晶度为18.69％，数据说明经酸性亚硫酸钠溶液高温预处理后稻草纤维素结晶度大大降低了。

球孢白僵菌在添加不同氮源的发酵基质上的产孢结果比较：

实施例1、实施例4-8和对比例3的产孢结果如下表2所示：

表2球孢白僵菌在添加不同氮源的发酵基质上的产孢结果

从表2可以看出，复合发酵基质的产孢量远高于单一稻草秸秆发酵基质；且在复合发酵基质中，随着稻草所占培养基比例的下降，白僵菌在固体培养基上的产孢量逐渐上升。白僵菌在实施例8的复合发酵基质配方上的产孢量最高，达到1.581×10

图5为本发明实施例1发酵10d的基质产孢外观形态图。

实施例9：

本实施例与实施例1的区别在于：将步骤(2)中“接种量20％”改为“接种量15％”，其他步骤同实施例1。

实施例10：

本实施例与实施例1的区别在于：将步骤(2)中“接种量20％”改为“接种量25％”，其他步骤同实施例1。

实施例11：

本实施例与实施例1的区别在于：将步骤(2)中“发酵温度25℃”改为“发酵温度24℃”，其他步骤同实施例1。

实施例12：

本实施例与实施例1的区别在于：将步骤(2)中“发酵温度25℃”改为“发酵温度26℃”，其他步骤同实施例1。

实施例9-12的产孢量低于实施例1。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。