一种有机蜡菊/永久花精油在制备抗衰老活性产品中的应用

技术领域

本发明属于精油抗衰老技术领域，具体地，涉及一种具有抗衰老活性的有机蜡菊/永久花精油。

背景技术

衰老指的是随着年龄的不断增长，生物有机体出现的一种渐进性和器质性的退行性变化，会导致生物体的生理功能发生衰退、恶化。在这个过程中，机体对环境的生理和心理适应能力进行性降低，机体各器官开始枯竭，呈现出代谢紊乱、功能衰退和有害物质积累等表象。同时机体自我更新能力减弱、抵抗力急剧下降，修复能力逐渐降低，逐渐趋向死亡。衰老会引发与年龄相关的重大疾病，如糖尿病、高血压、心血管疾病、癌症和神经退行性疾病，最终逐渐丧失生理完整性。

虽然衰老是一个不可逆的过程，但研究表明能量限制(Caloric Restriction，CR)和饮食，以及许多化合物可以延缓衰老的进程和年龄相关的疾病的发作。近几年来，立足于中医芳香疗法与现代芳香疗法理论基础上，植物精油在抗衰老领域也开始得到初步应用。植物精油是一种具有挥发性芳香物质，具有持续的、独特的、浓烈的芳香气味。目前已知的植物精油接近3000种，其中具有商业价值的精油约300种，这些精油的混合物或者其中的一些香气成分被广泛地应用于药学、农业、食品业、卫浴产业、化妆品和香水产业。植物精油抗衰老的药理作用主要有抗氧化与清除自由基、促进毛发生成、防治骨质疏松、调节机体免疫等抗生理衰老作用；调控神经退行性疾病、心脑血管疾病、骨关节炎、癌症等抗病理衰老作用。

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，C.elegans)，是一种独立生存的土壤线虫，其体型小，成虫长1mm，可在含有大肠杆菌的固体培养基或液体培养基中大量培养，通体透明，可在显微镜下观察其移动、进食、产卵等过程。秀丽线虫的生命周期短，生命周期包括胚胎期、四个幼虫期(L1-L4)和成年期，在20℃条件下，秀丽线虫从卵发育到成虫仅需要3天。当食物不足且线虫密度较大时，L1期的线虫将会停止发育，进入Dauer期，Dauer幼虫可以存活数月，当转移到带有细菌的平板上时，它们会继续发展成L4幼虫，因此线虫便于长期保存且稳定遗传，便于进行衰老相关的研究。

通过使用线虫进行寿命实验可以找到对延缓线虫衰老有影响的精油。同时，衰老具有高度保守性的信号通路，如胰岛素/类胰岛素生长因子信号通路(IIS)、蛋白激酶信号通路(AMPK)、雷帕霉素靶蛋白信号通路(mTOR)等，通过对精油所含化合物的靶基因的通路富集可以证明精油与衰老的关系。

发明内容

植物精油已经在抗衰老领域得到初步应用，为了使植物精油能更广阔地应用于抗衰老领域，本发明的目的在于提供一种有机蜡菊/永久花精油在制备抗衰老活性产品中的应用。

本发明提供的一种有机蜡菊/永久花精油，所述有机蜡菊/永久花精油是通过蒸汽蒸馏从产自法国的意大利蜡菊/永久花的花进行萃取得到的，包含51种化合物成分。所述有机蜡菊/永久花精油所含成分中质量百分数占比前10的成分分别为：乙酸橙花酯(000141-12-8)22.1％、蒎烯(007785-70-8)18.09％、γ-姜黄烯(000451-55-8)12.72％、α-蒎烯(007785-70-8)6.9％、β-石竹烯(000087-44-5)4.33％、7-环氧基-α-蒿烯(1000192-43-5)3.85％、姜黄烯(000644-30-4)3.63％、右旋萜二烯(005989-27-5)3.31％、意大利烯(094535-52-1)3.11％、4,6,9-三甲基-8-癸烯-3,5-二酮(013851-06-4)2.86％。

进一步地，所述抗衰老活性产品为食品、护肤品、化妆品或香水。

本发明的有益效果是，本发明提供了一种具有抗衰老活性的有机蜡菊/永久花精油，可以用于抗衰老的芳香治疗，相应的应用于食品、护肤品、化妆品、香水等产业。通过线虫寿命实验分析观察，所述有机蜡菊/永久花精油与对照组相比抗衰老活性提高了22.1％，显著延缓了线虫衰老。

进一步的，本发明分析了所述精油中的化合物及其靶基因富集结果，还提供了与衰老相关的化合物成分。

附图说明

图1为本发明提供的具有抗衰老活性的有机蜡菊/永久花精油的线虫寿命实验的生存率折线图；

图2为本发明提供的具有抗衰老活性的有机蜡菊/永久花精油的线虫寿命实验的生存时间箱线图；

图3为本发明提供的具有抗衰老活性的有机蜡菊/永久花精油的不同化合物成分占比饼图；

图4为本发明提供的具有抗衰老活性的有机蜡菊/永久花精油的化合物靶基因富集得到的精油-化合物-靶基因-通路网络图；

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1.有机蜡菊/永久花精油的成分

蜡菊/永久花精油(Immortelle Organic oil)，俗名别称永久花精油，不凋花精油，拉丁学名Helichrysum italicum G，是取自蜡菊的一种精油。蜡菊(Helichrysumitalicum)属于菊科(Asteraceae)之中的蜡菊属(Helichrysum Miller)，又被称为意大利永生草或不凋花。蜡菊主要产地在地中海沿岸，生长在干燥的岩地或沙地之上，并在山腰上繁殖，茎有分枝，叶片银绿色、有芳香，在夏天五至七月时期开花并采收，花色暗黄、类似于雏菊，当植物成熟时，花朵变干，然而仍保持原有颜色。蜡菊在世界各地近乎有500～600种品种广泛分布，最著名的便是意大利永久花，因此此品种被称为(Immortelle)，主要成分为γ-姜黄烯(γ-curcumene)。另外意大利永久花更含有独特的italidione，在任何其他精油，甚至其他品种的蜡菊精油都没有此成分，被认为是意大利永久花疗效独特性的主要原因。意大利永久花最著名的产地位于法国的科西嘉岛，当地所生产的蜡菊精油含有微量橙花醇(nerol)，以及高含量的橙花醇乙酸酯(neryl acetate)，最高可达45％。蜡菊的精油含量非常低，大约只有0.2-0.3％，一吨的花朵仅能生产2-3公斤的精油，也使精油价格昂贵，但品质尤为卓越，为IMO有机认证精油。

自古希腊以来，蜡菊属植物就一直用于草药保健实践，该油因其许多健康益处而受到高度重视和追捧。蜡菊精油是"化瘀"第一名，可活血化瘀、帮助伤口愈合的创伤用药。蜡菊精油有非常好的抗炎、抗氧化、抗菌、抗痉挛、抗病毒、收敛、杀菌、利胆、利尿、柔软皮肤、化痰、促进细胞再生、杀霉菌、利肝、镇静、利脾等功效。蜡菊精油在于心灵层面的疗效是有目共睹的，可以淡化惊吓、畏惧、恐慌的情绪，还能舒解抑郁的情绪，可利用熏香方式改善睡眠质量。有机蜡菊精油藉由消除入侵体内造成疾病或过敏的病原体(或过敏原)，再提振人体的免疫系统或肌肤的防御机制可以激励免疫系统的功能。

本发明可通过蒸汽蒸馏从产自法国的意大利蜡菊/永久花的花进行萃取得到的有机蜡菊/永久花精油。在夏天五至七月时期意大利蜡菊/永久花开花，通过人工采摘收集意大利蜡菊/永久花的花朵，采用的低温低压缓慢的蒸馏技术提取。通过蒸馏装置蒸馏，在低温低压(60-70℃、30～40MPa)的环境下，水蒸汽会通过花朵，带走其中的挥发油，产生含有精油的蒸馏水。蒸馏水经过冷却器冷凝成液体，在冷却器的底部收集精油和水的混合物。混合物中精油会浮在水的表面，使用分离漏斗等工具将精油和水分离。将分离后的精油通过滤纸等工具过滤，去除其中的杂质，获得有机蜡菊/永久花精油，精油产量较少。

基于质谱分析，将所述精油包含的化合物按其质谱面积统计不同类型的化合物所占百分比，绘制饼图(图3)。本发明的有机蜡菊/永久花精油包含的化合物可分为烯烃(25.3％)、萜类化合物(62.2％)、烃类化合物(2.5％)、醇类(3.4％)、其他(6.6％)几大类，如图3A所示。具体地，图3B可以看出所述精油中乙酸橙花酯(000141-12-8)占比为22.1％、蒎烯(007785-70-8)占比18.09％、γ-姜黄烯(000451-55-8)占比12.72％、α-蒎烯(007785-70-8)占比6.9％、β-石竹烯(000087-44-5)占比4.33％、7-环氧基-α-蒿烯(1000192-43-5)占比3.85％、姜黄烯(000644-30-4)占比3.63％、右旋萜二烯(005989-27-5)占比3.31％、意大利烯(094535-52-1)占比3.11％、4,6,9-三甲基-8-癸烯-3,5-二酮(013851-06-4)占比2.86％，其余化合物占比分别是029837-12-5(2.35％)、103827-22-1(1.76％)、016729-01-4(1.03％)、013474-59-4(1.02％)、028976-67-2(0.83％)、013877-91-3(0.82％)、000123-35-3(0.81％)、1000383-48-3(0.8％)、000105-87-3(0.75％)、061692-77-1(0.54％)、013851-08-6(0.52％)、000078-70-6(0.51％)、000483-76-1(0.49％)、000099-85-4(0.47％)、000586-62-9(0.4％)、018172-67-3(0.38％)、043219-80-3(0.38％)、000080-26-2(0.36％)、039029-41-9(0.35％)、000471-84-1(0.34％)、000099-86-5(0.31％)、010208-80-7(0.31％)、065652-33-7(0.29％)、037484-67-6(0.28％)、000106-25-2(0.26％)、005945-72-2(0.25％)、1000411-59-6(0.24％)、020126-76-5(0.23％)、021966-93-8(0.23％)、063891-61-2(0.22％)、025532-79-0(0.21％)、068832-35-9(0.21％)、016728-99-7(0.18％)、018794-84-8(0.18％)、000099-87-6(0.14％)、000115-95-7(0.13％)、024406-05-1(0.12％)、1000164-25-8(0.1％)、000489-86-1(0.1％)、104188-25-2(0.1％)、007212-44-4(0.09％)。

实施例2.有机蜡菊/永久花精油抗衰老活性产品中的应用

以下通过实验例具体说明本发明的有益效果。

一、实验试剂配制：

(1)1mol/LMgSO

(2)1mol/L CaCl

(3)1mol/L磷酸钾缓冲液：5.42g KH

(4)5mg/mL胆固醇无水乙醇溶液：胆固醇0.05g加无水乙醇10mL，抽滤除菌。

(5)NGM(Nematode Growth Medium)培养基配制方法(1L):3g NaCl，2.5g胰蛋白胨，17g琼脂粉，超纯水972mL，121℃高压灭菌20min，待温度降至65℃左右时，加入1mL1mol/L MgSO

(6)LB液体培养基配制方法：取1.25g LB干粉，溶解于50mL去离子水中，灭菌锅121℃灭菌20min。

(7)5mM FUDR母液：取6.15mg FUDR定容至5mL去离子水中，4℃低温保存。

(8)M9缓冲液：将7.75g Na

(9)线虫裂解液：分别取2.5mL NaOH(2M)，2mL NaOCl，再加入5.5mL去离子水，4℃避光保存备用。

(10)线虫冻存液：由5.85g NaCl，6.8g KH

(11)柠檬酸钾溶液(1L)：268.8g柠檬酸三钾(C

(13)S-basal medium(1L):5.9g NaCl，50mL KH

(14)S-complete medium(1L)：950mL的S-basal medium中加入10mL 1M柠檬酸钾溶液PH 6.0(无菌)，10mL微量金属溶液(无菌)，3mL CaCl

((15)雷帕霉素溶液：取2.74mg的雷帕霉素，先加入100μl DMSO混匀，再加入900μlDMSO形成1mL 3mM的雷帕霉素母液，将其分装保存于-20℃。

(16)二甲双胍溶液：取6.458mg二甲双胍溶于1mL水中，再其分装保存于-20℃。

二、E.coil OP50的培养

(1)活化E.coil OP50：在-80℃冰箱中快速取出E.coil OP50菌种，立即放入37℃水中溶解化冻，向无菌离心管中加入融化后的100μL E.coil OP50菌液，再加入灭菌后的LB无菌液体培养基，于37℃恒温摇床培养过夜。

(2)E.coil OP50的单克隆：提前进行无菌操作准备，打开超净台紫外灯，灭菌接种环、培养基等操作用具。正式实验时，先用火焰烧红接种环，冷却接种环，小心沾取一环菌液；采用划线法将菌种接种于LB固体琼脂板中，将接种好的平板倒置，于37℃恒温培养箱培养12～16h，待长出单个菌落。

(3)E.coil OP50扩大培养：挑取(2)中E.coli OP50单菌落，混匀于LB液体培养，封口膜密封锥形瓶，37℃恒温摇床培养12～14h，取菌液测OD

(4)E.coil OP50冻存：取1mL E.coli OP50菌液和已灭菌的40vol％甘油按1:1比例混合，转移至-80℃冰箱长期保存备用。

三、秀丽隐杆线虫的培养、传代、计数及同期化

(1)线虫复苏、培养、传代：从-80℃冰箱中取出冻存线虫，于超净工作台中自然解冻，静置待线虫沉于底部，吸弃部分冻存液，并将冻存管中剩余液体全部移至NGM板表面，于超净台中略微干燥后，置于20℃培养箱培养，第二天观察线虫复苏情况。将复苏的N2线虫放置于NGM琼脂板，20℃条件下培养，E.coil OP50作为食物来源。当线虫大量产卵时，或种群密度过大食物不足时进行线虫的传代。切取一块需要传代的线虫琼脂板，倒扣放置在新鲜的涂有E.coil OP50的NGM琼脂板表面，20℃培养，待大部分线虫爬向新鲜的琼脂板表面板，丢弃旧琼脂块即可。注意全程无菌操作。

(2)线虫计数：线虫计数应及时剔除异常及死亡的线虫包括：①干死的线虫②形成虫袋的线虫③钻入琼脂板内部或底部的线虫。线虫死亡的标准界定：①虫体僵直②使用挑针反复轻轻触碰线虫10s没有任何反应。每天定时记录线虫死亡数目。

(3)线虫冻存：当平板上存在大量L1期的虫子时，可对虫体进行冻存。用M9缓冲液冲洗线虫于灭菌离心管中，离心弃上清，等体积加入线虫冻存液，吹打混匀，封口膜密封冻存管，置于-80℃冰箱冻存。

(4)线虫的同期化：使用限时法得到L4期线虫。待线虫长至L4期，成虫开始产卵但未大量产卵时对其进行同期化处理。根据需求挑取正处于产卵期的线虫至新的含有E.coilOP50的NGM琼脂板中，置于20℃培养4-6个小时后可明显观察到NGM琼脂板上有大量尚未孵化的虫卵时，即可将NGM琼脂板上的成虫挑出，留下虫卵，继续置于20℃培养，大约3～4天即可得到L4期线虫。

四、秀丽隐杆线虫寿命实验

使用固体筛选法进行线虫寿命实验：设置空白对照组，DMSO溶剂组，阳性药物组(二甲双胍组)和实验组(有机蜡菊/永久花精油组)。有机蜡菊/永久花精油组将40μL浓度为30μg/μL的植物精油加在含有E.coil OP50的NGM琼脂板表面，NGM板中含有FUDR用以抑制线虫繁殖，DMSO溶剂组和阳性药物组将0.1vol％浓度的DMSO溶剂和配置的二甲双胍溶液定容为30μg/μL，也分别加入40μL在NGM板中。挑取同期化生长至L4期的秀丽隐杆线虫至NGM琼脂板中，在20℃恒温培养箱中培养。给药时间记为Day 0，之后每天定时记录线虫死亡数目，统计存活率，直至全部线虫死亡，停止计数，绘制寿命曲线(图1)和统计表(表1)。

表1

根据每天定时记录的线虫死亡数目，统计加药后不同天数线虫的存活情况，将统计得到的数据使用ggplot2绘制折线图(如图1)和箱线图(如图2)，观察线虫生存天数。

从图1上来看，明显看到所述精油提高了线虫的寿命。从图2箱线图上来看，所述精油组存活天数中位数、平均寿命天数更高，所述精油能提高线虫的存活率。根据表格统计结果来看，二甲双胍组平均寿命延长百分比为12.4％，而所述有机蜡菊/永久花精油组平均寿命延长百分比为22.1％，所述有机蜡菊/永久花精油可以显著延缓线虫衰老。

再将所述精油包含的51种化合物放到SEA数据库中进行靶点预测，将得到的靶基因全部合并在一起，选择其中的人类基因进行GO富集，level＝6，接着使用cytoscape绘制精油、化合物、靶基因、靶点的网络图(如图4)。图4所示富集结果中靶基因富集到的通路包括：视黄酸代谢过程(retinoic acid metabolic process)、腺苷酸环化酶抑制G蛋白偶联受体信号通路(adenylate cyclase-inhibiting G protein-coupled receptorsignaling pathway)、有丝分裂细胞周期正调控(positive regulation of mitotic cellcycle)、外源物代谢过程(xenobiotic metabolic process)、G蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路(G protein-coupled acetylcholine receptor signaling pathway)、细胞趋化性(cell chemotaxis)、脂肪酸应答(response to fatty acid)、脂肪酸代谢过程(fattyacid metabolic process)、胰岛素应答(response to insulin)、视紫红质介导信号通路调控(regulation of rhodopsin mediated signaling pathway)、DNA复制正调控(positive regulation of DNA replication)、细胞周期G1/S相变正调控(positiveregulation of cell cycle G1/S phase transition)、含牙本质牙的成牙过程(odontogenesis of dentin-containing tooth)、多巴胺受体信号通路(dopaminereceptor signaling pathway)、心脏收缩调控(regulation of heart contraction)、类固醇生物合成过程(steroid biosynthetic process)、细胞因子产生(cytokineproduction)、磷脂代谢过程(phospholipid metabolic process)、甲状腺发育(thyroidgland development)、类固醇激素介导的信号通路(steroid hormone mediatedsignaling pathway)。而这些通路调控的生物学过程都与衰老有一定的关联。靶基因包括醇脱氢酶家族(ADH1A，ADH1B，ADH7)，与酒精代谢和酒精相关的健康影响有关；钙感受受体基因(CASR)，与钙离子稳态和骨骼健康相关；细胞周期调控基因(CDC25A，CDC25C)，参与细胞分裂和老化过程；胆碱酯酶基因(CES1，CES2)，可能与脂肪代谢和心血管健康相关；乙酰胆碱受体基因(CHRM4，CHRM5)，参与神经传递过程；细胞趋化受体基因(CXCR3)，可能与免疫和炎症相关；儿茶酚氧化酶基因(EPHX1)，参与一些代谢和解毒过程；脂肪酸结合蛋白基因(FABP3)，可能与脂肪酸代谢相关；泛素化酶基因(FNTA，FNTB)，可能与细胞信号传导和增殖有关；核因子基因(GLI1，GLI2)，参与细胞分化和增殖；G蛋白基因(GNAI1，GNAI3，GNAO1)，可能参与多个细胞信号传导通路；羟基甲烷脱氢酶基因(HSD17B3)，与激素代谢和生殖健康有关；酸性脂肪酶基因(LIPA)，可能与脂质代谢和磷脂降解有关；脂肪酸受体基因(LPAR1)，可能与细胞信号传导和代谢有关；转化酶基因(LSS)，与胆固醇合成有关；酰胺酶基因(NAAA)，可能与内源性大麻素系统有关；磷脂酶A2基因(PLA2G2C，PLA2G2D，PLA2G4B，PLA2G5)，参与磷脂代谢；蛋白激酶C基因(PRKCA)，可能与细胞信号传导有关；神经酰胺受体基因(S1PR1，S1PR3)，可能与细胞信号传导和免疫有关；甲状腺激素受体基因(THRA，THRB)，与甲状腺功能和代谢相关；Toll样受体基因(TLR2)，参与免疫和炎症反应。这些基因在细胞代谢、DNA复制、细胞周期、信号传导、免疫和炎症等方面与衰老过程有一定的关联。说明所述有机蜡菊/永久花精油可能通过影响上述通路及基因从而实现抗衰老、延长寿命功能。