一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体，以及利用该突变体生产D-阿洛酮糖的应用。

背景技术

D-阿洛酮糖(D-allulose)是稀有糖家族的重要成员，是一种新型的低能量的甜味剂，其甜味是蔗糖的70％，但热量只有0.2cal/g，同时具有改善脂质代谢、降低餐后血糖等特殊生理功能，且其口感和特性接近蔗糖，因此是蔗糖的理想替代品。此外，D-阿洛酮糖还具有独特的生理功能，在临床医学领域具有潜在较大的应用价值，例如，D-阿洛酮糖可抑制肠道α-葡糖苷酶活性，防止血糖升高，作为Ⅱ型糖尿病人的辅助治疗剂；D-阿洛酮糖可减小脂肪合酶活性，抑制腹腔内脂肪堆积，降低血脂，并可预防肥胖。2011年美国食品与药物管理局(FDA)批准D-阿洛酮糖为GRAS(Generally recognized as safe)物质后，2019年又宣布食品制造商在营养数据标签上从总糖和添加糖计数中排除阿洛酮糖，这无疑使得阿洛酮糖受到市场的更大关注。

D-阿洛酮糖在自然界中含量极少，因此也被称为“功能性稀少糖”。目前，D-阿洛酮糖的生物法制备主要根据Izumoring稀有糖转化策略，即利用酮糖3-差向异构酶专一性的催化D-果糖合成D-阿洛酮糖。因此随着D-阿洛酮糖的市场需求量的日益增加，高效的生物催化剂的开发对其工业应用至关重要。然而，目前的DAE酶存在对果糖催化活性低，且温度稳定性差等问题，不适合工业化生产D-阿洛酮糖。随着D-阿洛酮糖的市场需求量的日益增加，高催化活性并且耐高温的生物催化剂的开发和应用对于工业化生产D-阿洛酮糖至关重要。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用，该突变体具有酶活高、温度稳定性好、耐高温等优点。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明提供一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体，包括突变的氨基酸序列，所述突变的氨基酸序列在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列基础上第36位、第249位、第255位、第258位任一项或任几项突变。

本发明根据源于Christensenellaceae bacterium的野生型D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(CbDAE)进行同源建模，根据底物分子对接模型分析关键位点的氨基酸残基，使用定点突变的方法对CbDAE进行催化效率和热稳定性改造。发明人前期在设计突变位点时，设计了若干个包含本发明涉及的位点在内的多个位点，采用液相检测的方法进行筛选，发现只有本发明提供的位点有有益效果。本发明提供了一种催化效率高且热稳定性好的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体、编码基因、重组载体、重组菌及其应用。

进一步，第36位的氨基酸残基由甘氨酸变为天冬酰胺；第249位的氨基酸残基由甲硫氨酸变为苏氨酸；第255位的氨基酸残基由谷氨酰胺变为亮氨酸；第258位的氨基酸残基由赖氨酸变为半胱氨酸。

本发明通过定点突变改造野生型D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因，获得了CbDAE的突变体酶，提供了G36N、M249T、Q255L、K258C和G36N/M249T/Q255L/K258C五种突变体，相比于野生型，其活性和稳定性显著提高。

进一步，突变的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列第36位的氨基酸残基由甘氨酸变为天冬酰胺、第249位的氨基酸残基由甲硫氨酸变为苏氨酸、第255位的氨基酸残基由谷氨酰胺变为亮氨酸、第258位的氨基酸残基由赖氨酸变为半胱氨酸。

本发明提供高活性高热稳定性D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体(G36N/M249T/Q255L/K258C)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO:2的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的第36位的氨基酸残基由甘氨酸变为天冬酰胺、第249位的氨基酸残基由甲硫氨酸变为苏氨酸、第255位的氨基酸残基由谷氨酰胺变为亮氨酸、第258位的氨基酸残基由赖氨酸变为半胱氨酸，将上述突变整合到同一氨基酸序列中，得到多位点突变体(G36N/M249T/Q255L/K258C)，其基因序列为SEQ ID NO:3。本发明提供的突变体G36N/M249T/Q255L/K258C相较于野生型活性提高至19.99倍，60℃下的t

本发明提供一种编码突变体的核酸，编码上述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体。

进一步，核酸的核苷酸序列包括SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

本发明提供一种载体，包括上述核酸的核苷酸序列。所述载体可以为克隆载体，也可以为表达载体，或者其他类型的载体。在本发明的其中一种实施方式中，所述表达载体可以为pET22b，本发明还提供了携带所述基因的表达载体，其表达载体可以是pPIC9k、pMA5或其他pET系列载体。

本发明提供一种转化体，包括上述核酸的核苷酸序列。所述转化体可以为表达所述突变体或编码突变体的基因的重组细胞，所述宿主细胞含有上述重组载体。所述宿主细胞优选大肠杆菌。所述宿主细胞也可以是枯草芽孢杆菌、酵母菌(毕赤酵母、酿酒酵母等)、乳酸菌、地衣芽孢杆菌中的一种或几种。

本发明还提供所述的突变体或所述的基因工程菌在医药生产、食品领域的应用。

本发明提供上述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体、核酸、载体、转化体中的一种或几种在制备D-阿洛酮糖中的应用。

本发明提供一种制备D-阿洛酮糖的方法，采用上述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体制备D-阿洛酮糖。

可以以D-果糖为原料，利用本发明提供的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体可以催化D-果糖合成D-阿洛酮糖。

附图说明

图1为突变体PCR产物条带的琼脂糖凝胶电泳验证图。

图2为D-阿洛酮糖和D-果糖的HPLC鉴定图。

图3为D-阿洛酮糖-3差向异构酶野生型及突变体(G36N/M249T/Q255L/K258C)的热稳定性图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明提供了一种高酶活高热稳定性的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体及其应用，属于酶的基因工程技术领域。本发明以来源于Christensenellaceae bacterium的野生型D-阿洛酮糖-3-差向异构酶作为母本，利用基因工程突变技术，改造获得了高活性高热稳定性D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体。发明人前期在设计突变位点时，设计了若干个包含本发明涉及的位点在内的多个位点，采用液相检测的方法进行筛选，发现只有本发明提供的位点有有益效果。其中，本发明提供的突变体G36N/M249T/Q255L/K258C相较于野生型催化活性提高至19.99倍，60℃下的半衰期(t

本发明筛选获得的突变体酶可以在高温下更高效地催化D-果糖异构化为D-阿洛酮糖，推动了我国工业化生产D-阿洛酮糖的进程，具有广阔的前景和重要的工业应用价值。

下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法，本发明采用的试剂、实验材料可以市购获得或者本领域所公知的方法制备。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

LB液体培养基配方：以水配制，胰蛋白胨(Tryptone)10g/L；酵母提取物(Yeastextract)5g/L；氯化钠(NaCl)10g/L。

实施例中涉及的引物序列如表1所示，由金斯瑞公司合成。

表1引物序列

实施例1D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体的构建

以来源于Christensenellaceae bacterium的野生型D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因(GenBank:MBQ9941839.1)，经过密码子优化后得到如SEQ ID NO:4所示的核酸序列(编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列)。将该核酸序列连接到pET22b(+)表达载体上，得到野生型重组载体CbDAE-pET22b。

以该野生型重组载体为模板，采用KOD-Plus突变体试剂盒(TOYOBO，KOD-201)通过PCR定点突变分别获得突变体G36N、M249T、Q255L、K258C、G36N/M249T/Q255L/K258C的核苷酸序列。

用于获得突变体G36N的引物为G36N-F(SEQ ID NO:5)和G36N-R(SEQ ID NO:6)；用于获得突变体M249T的引物为M249T-F(SEQ ID NO:7)、M249T-R(SEQ ID NO:8)；用于获得突变体Q255L的引物为Q255L-F(SEQ ID NO:9)、Q255L-R(SEQ ID NO:10)；用于获得突变体K258C的引物为K258C-F(SEQ ID NO:11)、K258C-R(SEQ ID NO:12)；用于获得突变体G36N/M249T/Q255L/K258C的引物为上述单突变体的全部引物。

突变体G36N/M249T/Q255L/K258C的制备方法包括以下步骤：以突变体G36N为模板，采用引物M249T F、M249T-R扩增，获得二重突变体；以二重突变体为模板，采用引物Q255L F、Q255L-R扩增，获得三重突变体；以三重突变体为模板，采用引物K258C F、K258C-R扩增，获得突变体G36N/M249T/Q255L/K258C。

(1)PCR反应步骤及条件如下：

表2 PCR体系

PCR反应程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s；68℃延伸7min；经过7个循环后4℃保存。通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物条带验证，实验结果如图1所示。图1中，1-5依次分别代表G36N、M249T、Q255L、K258C、G36N/M249T/Q255L/K258C，M代表DNA Marker(Biosharp),PCR产物条带大小与预期一致，说明成功制备了各突变体。

(2)消化PCR产物中的模板

在PCR产物中加入0.35μL DpnⅠ(New England Biolabs，R0176L)，混匀后于37℃反应1h。

(3)消化后的产物环化连接，总体积为15μL，反应体系如表3所示，按反应体系混匀后置于16℃下环化反应1h。表3中的Ligation high购自Takara。

表3环化体系

(4)环化反应结束后，将上述产物分别采用化转的方式转入感受态E.coli JM109(来自于上述的KOD-PLUS试剂盒)中，挑取阳性转化子，提取质粒后进行测序。得到本发明需要的5种突变体的重组载体(即CbDAE/G36N-pET22b、CbDAE/M249T-pET22b、CbDAE/Q255L-pET22b、CbDAE/K258C-pET22b、CbDAE/G36N/M249T/Q255L/K258C-pET22b)，分别包含单点突变体G36N、M249T、Q255L、K258C以及多点突变体G36N/M249T/Q255L/K258C。将测序成功的突变体质粒导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞(Thermo Scientific，EC0114)，构建突变体基因重组菌，用于突变体的诱导表达。

实施例2D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体的表达纯化

将上述5种重组载体CbDAE/G36N-pET22b,CbDAE/M249T-pET22b,CbDAE/Q255L-pET22b,CbDAE/K258C-pET22b,CbDAE/G36N/M249T/Q255L/K258C-pET22b以及野生型CbDAE-pET22b分别转入大肠杆菌BL21(DE3)，挑取5种重组菌的转化子分别接于5mL LB种子培养基(在LB液体培养基基础上添加氨苄霉素，含有100μg/mL氨苄霉素)，37℃下220r/min培养12h。以1％的接种量接于100mL LB发酵培养基(在LB液体培养基基础上添加氨苄霉素，含有100μg/mL氨苄霉素)，待菌浓度OD

溶液A配方包括：以水配制，20mM Tris-HCl,pH 8.0,500mM NaCl,20mM咪唑,2mMDTT(索莱宝，D8220)。

Ni亲和层析：取4个开放柱(Open-Column)(Biosharp，BS-AC-030)，并各加入1mLNi-NTA树脂(QIAGEN)。用20mL溶液A平衡树脂。将高速离心上清于1mL树脂置于4℃下结合40-60min。将混合液过开放柱，结合有蛋白的树脂将被截留。用20mL溶液A漂洗树脂。最后用15mL溶液B(20mM Tris-HCl,pH 8.0,300mM NaCl,400mM咪唑,2mM DTT)洗脱下蛋白。用1×PBS于置换管中置换洗脱的目的蛋白，最后得到5种蛋白，分别为：野生型CbDAE、突变体G36N、突变体M249T、突变体Q255L、突变体K258C以及突变体G36N/M249T/Q255L/K258C。将其作为酶液用于后续试验。

实施例3D-阿洛酮糖产物的鉴定及定量分析

在200μL反应体系中加上20mM Tirs-HCl(pH＝7.4)，150mM NaCl，1％(w/v)的D-果糖以及添加5μL酶液(实施例2制备)，于60℃下反应10min。将反应液煮沸5min后离心去除沉淀，将反应液稀释合适浓度到液相小瓶中，采用HPLC对产物进行D-阿洛酮糖产物进行鉴定及定量分析。

定量分析采用的标品为D-阿洛酮糖(纯度≥99％)。在0.1mg/ml-10mg/ml范围内配置5个不同浓度的标准液系列，分别为0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、4.0mg/ml，通过高效液相色谱法以标准样浓度对峰面积做标准曲线，y＝3.68256x+0.01835，相关系数R

色谱仪：Agilent1260；

检测器：蒸发光散射检测器(Alltech Chrom，ELSD6000)

进样：Agilent自动进样器；进样量：10μL；

色谱柱：Prevail Carbohydrate ES column-W(5μm,4.6×250mm,AgelaTechnologies,China)；柱温：40℃；

流动相：80％乙腈；流速1mL/min。

结果如图2所示，底物D-果糖和产物D-阿洛酮糖在柱子中得到很好的保留和分离。

实施例4测定突变体酶催化活性和温度稳定性

(1)酶活性测定

在200μL反应体系中加入20mM Tirs-HCl(pH＝7.4)，1mM Mg

表4野生型及突变体的比酶活

(2)热稳定性测定

在500μL反应体系中加入20mM Tirs-HCl(pH＝7.4)，1mM Co

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。