一种与小黑麦抗条锈病基因YrXY紧密连锁的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学及遗传育种领域，特别是涉及一种与小黑麦抗条锈病基因YrXY紧密连锁的分子标记及其应用。

背景技术

六倍体小黑麦(×Triticosecale Wittmack,AABBRR,2n＝6x＝42)，是由小麦(Triticum spp.)和小麦近缘种黑麦(Secale cereal L.)通过人为杂交形成的新物种，是一种重要的粮食、饲草兼用作物。小黑麦不仅保持了小麦的高产、优质等特点，而且还结合了黑麦的抗病、抗逆、适应性广等优势。由于六倍体小黑麦具有相对优越的种子活力和稳定的繁殖率，已成为世界范围内的主要种植类型。条锈病是由条型柄锈菌(Pucciniastriiformis f.sp.tritici)引起的气传性病害，是一种全球性的流行性真菌病害，是造成小黑麦减产的最严重的病害之一。培育抗病小黑麦品种并进行大规模种植是控制该病害最经济和有效的途径，通过分子辅助选择可快速培育小黑麦抗条锈病品种。

目前，在小麦和大麦中都有针对抗条锈病基因位点的相关报道，而在小黑麦中的报道相对较少。如Zhao等利用构建F

发明内容

本发明的目的是提供一种与小黑麦抗条锈病基因YrXY紧密连锁的分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，该分子标记与抗条锈病基因位点YrXY显著相关，呈现紧密连锁标记特征，用于分子标记辅助选择的准确性高，可以提高适应不同环境的小黑麦特定抗条锈病品种的选择鉴定效率，且成功率高，可大大加快小黑麦抗条锈病品种的选育进程。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种与小黑麦抗条锈病基因YrXY紧密连锁的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述分子标记的18bp处碱基存在一个SNP位点，为C/G突变。

进一步地，所述SNP位点的基因型为CC、CG和GG。

本发明还提供一种鉴别小黑麦抗条锈病性状的引物组合，包括核苷酸序列如SEQID NO.1-2所示的两条正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的通用反向引物。

本发明还提供上述的引物组合在制备鉴别小黑麦抗条锈病性状的试剂盒中的应用。

本发明还提供一种鉴别小黑麦抗条锈病性状的试剂盒，包括上述的引物组合。

本发明还提供上述的分子标记、引物组合或试剂盒在以下(1)或(2)中的应用：

(1)鉴别小黑麦抗条锈病性状；

(2)检测小黑麦抗条锈病基因YrXY。

本发明还提供一种鉴别小黑麦抗条锈病性状的方法，包括以下步骤：

获取待检小黑麦的基因组DNA；

以所述基因组DNA为模板，PCR扩增得到包含上述分子标记的扩增片段，并鉴定得到基因型，根据所述基因型鉴别所述待检小黑麦的抗条锈病性状，鉴别标准为：CC和CG基因型的抗条锈病能力高于GG基因型。

进一步地，所述PCR扩增采用荧光定量PCR扩增，所述荧光定量PCR扩增使用权利要求3所述的引物组合进行。

进一步地，所述荧光定量PCR扩增的反应体系为：2×KASP Mastermix 5μL、KASPAssay Mix 1.4μL、模板DNA 1μL和Dnase/RNase-free去离子水2.6μL。

进一步地，所述荧光定量PCR扩增的反应程序为：95℃预变性15min；95℃变性20s，61℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低0.6℃；95℃变性20s，55℃退火延伸40s，循环35次；25℃60s。

本发明公开了以下技术效果：

本发明首次公开了来源新小黑麦1号中的抗条锈病基因位点YrXY，位于小黑麦6R染色体，显著提高了小黑麦抗条锈病能力。该基因位点在小黑麦抗病育种中具有较高的利用价值。本发明首次公开了与小黑麦抗条锈病YrXY基因紧密连锁的分子标记XY25，且为共显性标记。本发明公开的分子标记XY25与抗条锈病基因位点YrXY显著相关，呈现紧密连锁标记特征，可用于鉴别小黑麦抗条锈病性状，用于分子标记辅助选择的准确性高，可以提高适应不同环境的小黑麦特定抗条锈病品种的选择鉴定效率，且成功率高，可大大加快小黑麦抗条锈病品种的选育进程。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中小黑麦抗条锈病基因YrXY在6R染色体上的物理区间；

图2为实施例2中与YrXY紧密连锁标记XY25在F

图3为实施例2中小黑麦抗条锈病基因YrXY在6R染色体上的遗传位置与分子标记XY25之间的遗传图谱；

图4为实施例3中利用荧光定量PCR引物对小黑麦品种抗条锈病与感条锈病株系进行基因型分型的结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1小黑麦抗条锈病基因YrXY的鉴定

在本发明中，小黑麦抗条锈病基因YrXY是通过以下方法获得的：

1.1作图群体的构建

利用感病材料中饲1048作为母本，以抗病材料新小黑麦1号为父本，构建杂交组合获得杂种F

1.2田间鉴定所述亲本及群体植株的抗条锈病表型

在田间种植小黑麦亲本中饲1048、新小黑麦1号及F

表1条锈病反应型分级及鉴定标准

1.3构建亲本池和极端表型池进行转录组测序

根据抗条锈病表型鉴定结果，选取20个极端抗条锈病的单株和20个极端感条锈病的单株，取等量叶片构建极端抗病混池和极端感病混池，并选择10个抗病亲本和10个感病亲本单株的等量叶片构建亲本混池。极端抗/感病混池和亲本混池由北京诺禾致源科技有限公司提取RNA并用Illumina HiSeq4000测序平台进行测序(测序深度为10G)，获得测序数据。经过比对和SNP calling后，获得遍布小黑麦21条染色体的57343个高质量差异SNP。

1.4基于转录组测序集群分离分析法鉴定抗条锈病基因YrXY

针对上诉获得的高质量差异SNP，利用ΔSNP-index法在小黑麦21条染色体上对YrXY进行定位。ΔSNP-index法的计算公式如下，

SNP-index(极端抗病混池)＝NR/(NR+Nref)，

SNP-index(极端感病混池)＝NS/(NS+Nref)，

ΔSNP-index＝SNP-index(极端抗病混池)-SNP-index(极端感病混池)。

为了进一步降低背景噪音，设定ΔSNP-index

实施例2小黑麦抗条锈病基因YrXY分子作图及紧密连锁标记XY25鉴定

2.1DNA提取

试验材料选取实施例1中的新小黑麦1号、中饲1048和F

2.2小黑麦抗条锈病基因YrXY的分子标记的鉴定

结合实施例1中抗条锈病基因YrXY物理区间内的差异SNP；同时通过设计引物，扩增抗条锈病基因位点YrXY基因组区段内的基因序列，利用克隆测序鉴定抗病材料新小黑麦1号与感病材料中饲1048之间的SNP差异位点，筛选出与YrXY基因紧密连锁的分子标记XY25。利用PowerMarker 2.0软件设计荧光定量PCR引物。荧光定量PCR引物设计标准：扩增引物长度18～30bp，扩增产物长度45-70bp，退火温度57-62℃，GC含量在40％～60％之间。合成引物序列为：

正向引物1(XY25-F1)：5’-

正向引物2(XY25-F2)：5’-

反向通用引物(XY25-R)：5’-GGGCTCAGCACCGGGAAG-3’(SEQ ID NO.3)；

其中，波浪线部分为HEX标签序列，下划线部分为FAM标签序列。

2.3荧光定量PCR平台测试引物及其亲本间的差异性

(1)提取新小黑麦1号、小黑麦中饲1048和小黑麦F

(2)以待测小黑麦的基因组DNA为模板，基于KASP检测平台技术设计引物，进行荧光定量PCR扩增；

其中，步骤(2)的引物序列如SEQ ID NO:1-3所示，并且，引物XY25-F1和XY25-F2的5’端分别连有不同的荧光基团。

(3)荧光定量PCR扩增反应体系：2×KASP Mastermix 5μL、KASPAssay Mix 1.4μL、浓度为100ng/μL的模板DNA 1μL和Dnase/RNase-free去离子水2.6μL；其中，KASPAssay Mix中含有引物XY25-F1、XY25-F2和XY25-3，体积比为2:2:5。即，在KASPAssay Mix中，将浓度为100μM的引物XY25-F1、XY25-F2和XY25-R按2:2:5体积比混合。

(4)荧光定量PCR程序：95℃预变性15min；95℃变性20s，61℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低0.6℃；95℃变性20s，55℃退火延伸40s，循环35次；25℃60s，采集荧光信号。

将PCR扩增产物进行测序，测序结果如下：

GACCGCATGAGCCCATC

(5)分析PCR产物的具体方法如下：新小黑麦1号和含有纯合抗病基因的F

2.4遗传图谱构建

利用QTL IciMapping 4.2作图软件将获得的所述群体基因型资料构建小黑麦分子遗传连锁图谱，寻找最优的标记数和标记顺序，确定后续使用的连锁群，并结合作图群体抗条锈病表型数据将抗条锈病基因位点YrXY定位于6R染色体上一个1.40cM(侧翼标记X17和K6)的区段内(图3)。

实施例3小黑麦抗条锈病基因YrXY的分子标记的应用

3.1田间鉴定所述亲本及群体植株的抗条锈病表型

在田间种植33份小黑麦品种，以SY95-71播种于行间作为诱发材料，利用涂抹法接种流行条锈菌小种(条中32、条中33和条中34的混和菌种)。在成株期，利用0-4级法(表1)鉴定小黑麦抗条锈病反应型。反应型0-2级为抗病类型，3-4级为感病类型。

3.2群体检测过程中引物序列XY25-F1/F2/R的适用性

(1)提取上述群体中鉴定到的极端抗病材料与感病材料各4株系两叶期的叶片DNA。

(2)以步骤(1)所得的DNA作为模板，基于KASP检测平台技术设计引物，进行荧光定量PCR扩增。

(3)荧光定量PCR扩增反应体系：2×KASP Mastermix 5μL、KASPAssay Mix 1.4μL、浓度为100ng/μL的模板DNA 1μL和Dnase/RNase-free去离子水2.6μL；其中，KASPAssay Mix中含有引物XY25-F1、XY25-F2和XY25-3，体积比为2:2:5，即在KASPAssay Mix中，将浓度为100μM的引物XY25-F1、XY25-F2和XY25-R按2:2:5体积比混合。

(4)荧光定量PCR程序：95℃预变性15min；95℃变性20s，61℃退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低0.6℃；95℃变性20s，55℃退火延伸40s，循环34次；25℃60s，采集荧光信号。

(5)分析PCR产物的具体方法如下：含有纯合小黑麦抗条锈病基因YrXY的小黑麦品种均出现与新小黑麦1号相同的荧光信号，记为A型；而不含有小黑麦抗条锈病基因YrXY的小黑麦品种均出现与小黑麦中饲1048相同的荧光信号，记为B型；含有杂合抗病基因的小黑麦品种均出现与新小黑麦1号和中饲1048均不相同的基因型，记为H型；结果如图4所示。结果表明，实际结果与预期结果一致，说明本发明的小黑麦抗条锈病基因YrXY确实具有显著增强小黑麦抗条锈病能力的作用，且分子标记XY25可以用于跟踪鉴定小黑麦抗条锈病基因YrXY。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。