核酸载体和使用方法

技术领域

整体而言，本发明的特征在于涉及核酸载体(例如环状DNA载体)的组合物和方法，例如用于治疗癌症。

背景技术

当对刺激的正常生理反应(例如，对损害或损伤的反应、自我修复的启动或建立先天和后天防御)异常或过度时，就会发生癌症，导致其他疾病或病理(例如，肿瘤生长和/或转移导致组织损伤和系统衰竭)。癌症的发病机制已有广泛研究，产生的许多假设表明有多种成功率各异的治疗方法。尽管如此，癌症仍然是对人类健康最致命的威胁之一。根据世界卫生组织的数据，癌症是全球第二大死亡原因，约占死亡人数的六分之一，美国癌症协会估计，仅在美国，癌症每天就导致超过1,500人死亡。

基因治疗有望成为一种有效的癌症治疗方法，但其全部潜力尚未实现。因此，本领域需要能够提供稳健且持续的抗肿瘤作用的改进的基因治疗。

发明内容

本发明提供了通过施用携带异源基因的核酸载体(例如非病毒核酸载体，例如环状DNA载体)来调节肿瘤微环境以治疗癌症(例如，以存在实体瘤为特征的癌症)的组合物和方法。在一些实施方案中，调节基因是协力作用以加强抗肿瘤免疫应答的免疫调节基因的组合。此类调节基因包括树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1、XCL2、CCL4或CCL5)、树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如，FLT3L、GM-CSF、CD40或CD40L)和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(lymphocyte signaling protein-encoding genes)(例如IL-12、IL-15、CXCL9或CXCL10)的各种组合。在本文所述的某些实施方案中，核酸载体编码自复制的RNA分子，其中RNA复制酶有效连接至一种或多种调节基因以减轻随肿瘤细胞增殖时的稀释。核酸载体(例如环状DNA载体，例如编码自复制RNA分子的环状DNA载体)的施用可以伴随有向肿瘤微环境中传送电场(例如脉冲电场)以增强向靶细胞的电转移。

一方面，本发明提供了一种核酸载体(例如DNA载体，例如环状DNA载体)，其包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如FLT3L编码基因(例如sFLT3L编码基因)、GM-CSF编码基因或CD40或CD40L编码基因)和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如IL-12编码基因、IL-15编码基因、CXCL9编码基因或CXCL10编码基因)。在一些实施方案中，核酸载体(例如DNA载体，例如环状DNA载体)包含分别驱动树突细胞化学引诱剂编码基因(例如XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如FLT3L编码基因、GM-CSF编码基因或CD40或CD40L编码基因)和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如IL-12编码基因、IL-15编码基因、CXCL9编码基因或CXCL10编码基因)的第一启动子、第二启动子和第三启动子。在一些实施方案中，第一启动子、第二启动子和第三启动子中的一个或多个是人巨细胞病毒(CMV)启动子。在一些实施方案中，第一启动子是CMV启动子，第二启动子是CMV启动子，并且第三启动子是CMV启动子。在一些实施方案中，第一启动子、第二启动子和第三启动子中的一个或多个是CAG启动子。在一些实施方案中，第一启动子是CAG启动子，第二启动子是CAG启动子，并且第三启动子是CAG启动子。在一些实施方案中，核酸载体(例如DNA载体，例如环状DNA载体)包含驱动树突细胞化学引诱剂编码基因(例如XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如FLT3L编码基因、GM-CSF编码基因或CD40或CD40L编码基因)和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，IL-12编码基因、IL-15编码基因、CXCL9编码基因或CXCL10编码基因)的单个启动子。在具体实施方案中，核酸载体是非病毒核酸载体。在一些实施方案中，启动子是CMV启动子。在其他实施方案中，启动子是CAG启动子。

在任何前述实施方案中的一些中，核酸载体是缺乏细菌复制起点和/或耐药基因的环状DNA载体(例如，缺乏细菌复制起点和/或耐药基因两者)。在一些实施方案中，核酸载体(例如DNA载体，例如环状DNA载体)的长度为2.5kb至20kb。在一些实施方案中，核酸(例如DNA载体，例如环状DNA载体)载体的长度为3.5kb至10kb。

在一些实施方案中，核酸载体(例如，环状DNA载体)在5'至3'方向上包含树突细胞生长因子或激活剂编码基因、淋巴细胞信号传导蛋白编码基因和树突细胞化学引诱剂编码基因。在一些实施方案中，环状DNA载体是缺乏重组位点的合成环状DNA载体(例如，缺乏重组位点和细菌骨架的合成环状DNA载体)。

另一方面，本发明的特征在于缺少细菌复制起点和/或耐药基因(例如，缺少细菌复制起点和/或耐药基因两者)的环状DNA载体。环状DNA载体具有以5'至3'方向排列(例如，有效连接)的以下元件：(a)启动子(例如，CMV或CAG启动子)；(b)自复制RNA分子编码序列，其包含(i)从自复制RNA分子转录RNA的复制酶编码序列和(ii)一个或多个异源蛋白编码序列(例如，基因)；和(c)聚腺苷酸化序列。在一些实施方案中，所述一个或多个异源蛋白编码序列(例如，基因)包括一种或多种免疫调节蛋白编码基因。在一些实施方案中，所述一种或多种(例如，一种、两种、三种或更多种)免疫调节蛋白编码基因选自树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如FLT3L编码基因(例如sFLT3L编码基因)、GM-CSF编码基因、或CD40或CD40L编码基因)和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如IL-12编码基因、IL-15编码基因、CXCL9编码基因或CXCL10编码基因)。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫调节蛋白编码基因包括以下所有三种：树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如FLT3L编码基因(例如sFLT3L编码基因)、GM-CSF编码基因或CD40或CD40L编码基因)和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如IL-12编码基因、IL-15编码基因、CXCL9编码基因或CXCL10编码基因)。在任何前述方面的一些实施方案中，复制酶是甲病毒复制酶(例如，VEE复制酶或其变体(例如，具有SEQ ID NO:2、4、6和/或8中的一个或多个(一个、两个、三个或全部四个)氨基酸序列的复制酶)，或与SEQ ID NO:2、4、6和/或8具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的其变体))。

另一方面，本发明的特征在于一种药物组合物，其包含前述方面的任何核酸载体或环状DNA载体和药学上可接受的载体(例如，作为液体或干燥(例如，冻干)组合物)。

另一方面，本文提供了治疗有此需要的个体(例如，人类癌症患者)中的癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括以治疗癌症的有效量向个体施用前述方面中任一项的核酸载体(例如非病毒核酸载体)、环状DNA载体或药物组合物。在一些实施方案中，核酸载体、环状DNA载体或药物组合物是瘤内施用的。在其他实施方案中，核酸载体、环状DNA载体或药物组合物是全身施用的。在一些实施方案中，核酸载体、环状DNA载体或药物组合物与向肿瘤微环境的电场传输(例如，脉冲电场治疗，例如使用肿瘤内定位(intratumorallypositioned)的电极施用的脉冲电场治疗)组合施用。在一些实施方案中，所述方法包括将电场传输到肿瘤微环境中，其中电场促进核酸载体(例如，环状DNA载体)转移到细胞(例如，肿瘤细胞)中，从而递送异源调节基因至细胞(例如，肿瘤细胞)以治疗癌症。另外或可选地，核酸载体、环状DNA载体或药物组合物可以与另外的抗癌治疗(例如，放射治疗(例如，细胞毒性放射治疗)、光动治疗、热疗、溶瘤治疗(例如施用溶瘤病毒)或抗癌剂(例如化疗剂、检查点抑制剂、细胞毒性剂、生长抑制剂、抗血管生成剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体-药物缀合物、癌症疫苗或其组合))组合施用。

另一方面，本发明提供了通过将电场传输至肿瘤微环境(例如，通过将脉冲电场传输至肿瘤微环境，例如使用肿瘤内定位的电极)，治疗已经被施用或将要被施用本发明任意实施方案的核酸载体(例如非病毒核酸载体)、环状DNA或药物组合物的个体(例如人类癌症患者)中的癌症的方法。

另一方面，本发明的特征在于一种调节有此需要的个体(例如人类癌症患者，例如患有实体瘤的人类癌症患者)中的肿瘤微环境的方法。在一些实施方案中，所述方法包括以调节肿瘤微环境的有效量向个体施用前述方面中任一项的核酸载体(例如非病毒核酸载体)、环状DNA载体或药物组合物。在一些实施方案中，核酸载体、环状DNA载体或药物组合物是瘤内施用的。在其他实施方案中，核酸载体、环状DNA载体或药物组合物是全身施用的。在一些实施方案中，核酸载体、环状DNA载体或药物组合物与向肿瘤微环境中的电场传输(例如，脉冲电场治疗，例如使用肿瘤内定位的电极施用的脉冲电场治疗)组合施用。在一些实施方案中，所述方法包括通过将电场传输到肿瘤微环境中来调节肿瘤微环境，其中电场促进了核酸载体(例如，环状DNA载体)转移至细胞(例如，肿瘤细胞)中，从而将异源调节基因递送至细胞(例如，肿瘤细胞)以调节个体中的肿瘤微环境。另外或可选地，核酸载体、环状DNA载体或药物组合物可以与另外的抗癌治疗(例如，放射治疗(例如，细胞毒性放射治疗)、光动治疗、热疗、溶瘤治疗(例如施用溶瘤病毒)或抗癌剂(例如化疗剂、检查点抑制剂、细胞毒性剂、生长抑制剂、抗血管生成剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体-药物缀合物、癌症疫苗或其组合))组合施用。

另一方面，本发明提供了一种调节已经被施用或将要被施用本发明任何实施方案的核酸载体(例如非病毒核酸载体)、环状DNA载体或药物组合物的个体(例如人类癌症患者)中的肿瘤微环境的方法，其通过将电场传输至肿瘤微环境(例如，通过将脉冲电场传输至肿瘤微环境，例如使用肿瘤内定位的电极)，从而将异源调节基因递送至细胞(例如，肿瘤细胞)以调节个体中的肿瘤微环境。

另一方面，本发明的特征在于诱导在有此需要的个体(例如人类癌症患者，例如患有实体瘤的人类癌症患者)的肿瘤微环境中调节蛋白的表达。在一些实施方案中，所述方法包括以诱导所编码的调节蛋白表达的有效量向个体施用前述方面中任一项的核酸载体(例如非病毒核酸载体)、环状DNA载体或药物组合物。在一些实施方案中，核酸载体、环状DNA载体或药物组合物是瘤内施用的。在其他实施方案中，核酸载体、环状DNA载体或药物组合物是全身施用的。在一些实施方案中，核酸载体、环状DNA载体或药物组合物与向肿瘤微环境的电场传输(例如，脉冲电场治疗，例如使用肿瘤内定位的电极施用的脉冲电场治疗)组合施用。在一些实施方案中，所述方法包括通过将电场传输至肿瘤微环境来调节肿瘤微环境，其中电场促进核酸载体(例如，环状DNA载体)转移至细胞(例如，肿瘤细胞)中，从而将异源调节基因递送至所述细胞(例如，肿瘤细胞)以诱导其表达。另外或可选地，核酸载体、环状DNA载体或药物组合物可以与另外的抗癌治疗(例如，放射治疗(例如，细胞毒性放射治疗)、光动治疗、热疗、溶瘤治疗(例如施用溶瘤病毒)或抗癌剂(例如化疗剂、检查点抑制剂、细胞毒性剂、生长抑制剂、抗血管生成剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体-药物缀合物、癌症疫苗或其组合))组合施用。

另一方面，本发明提供了一种诱导已经被施用或将要被施用本发明任何实施方案的核酸载体(例如非病毒载体)、环状DNA载体、或药物组合物的个体(例如人类癌症患者)的肿瘤微环境中调节蛋白表达的方法，其通过将电场传输至肿瘤微环境(例如，通过将脉冲电场传输至肿瘤微环境，例如使用肿瘤内定位的电极)，从而将异源调节基因递送至细胞(例如，肿瘤细胞)，以诱导由载体编码的调节蛋白在肿瘤微环境中的表达。

另一方面，本文提供了一种通过施用治疗癌症有效量的包含树突细胞化学引诱剂编码基因的非病毒核酸载体，治疗有此需要的个体(例如，人类癌症患者)中的癌症的方法。在一些实施方案中，非病毒核酸载体是瘤内施用的。在其他实施方案中，非病毒核酸载体是全身施用的。在一些实施方案中，非病毒核酸载体与向肿瘤微环境的电场传输(例如脉冲电场治疗，例如使用肿瘤内定位的电极施用的脉冲电场治疗)组合施用。在一些实施方案中，所述方法包括将电场传输至肿瘤微环境中，其中电场促进了非病毒核酸载体的转移，从而将树突细胞化学引诱剂编码基因递送至细胞(例如，肿瘤细胞)以治疗癌症。另外或可选地，非病毒核酸载体可以与另外的抗癌治疗(例如放射治疗(例如细胞毒性放射治疗)、光动治疗、热疗、溶瘤治疗(例如，施用溶瘤病毒)或抗癌剂(例如，化疗剂、检查点抑制剂、细胞毒性剂、生长抑制剂、抗血管生成剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体-药物缀合物、癌症疫苗或其组合))组合施用。

另一方面，本发明提供了通过将电场传输至肿瘤微环境(例如，通过将脉冲电场传输至肿瘤微环境，例如使用肿瘤内定位的电极)，治疗已经被施用或将要被施用具有树突细胞化学引诱剂编码基因的非病毒核酸载体的个体(例如，人类癌症患者)的癌症的方法。

另一方面，本发明的特征在于一种通过向个体施用调节肿瘤微环境有效量的包含树突细胞化学引诱剂编码基因的非病毒核酸载体，调节有此需要的个体(例如，人类癌症患者，例如患有实体瘤的人类癌症患者)中的肿瘤微环境的方法。在一些实施方案中，非病毒核酸载体是瘤内施用的。在其他实施方案中，非病毒核酸载体是全身施用的。在一些实施方案中，非病毒核酸载体与向肿瘤微环境的电场传输(例如脉冲电场治疗，例如使用肿瘤内定位的电极施用的脉冲电场治疗)组合施用。在一些实施方案中，所述方法包括通过将电场传输至肿瘤微环境中来调节肿瘤微环境，其中电场促进了非病毒核酸载体转移至细胞(例如，肿瘤细胞)中，从而将树突细胞化学引诱剂编码基因递送至上述细胞(例如肿瘤细胞)，以调节个体中的肿瘤微环境。另外或可选地，非病毒核酸载体可以与另外的抗癌治疗(例如放射治疗(例如细胞毒性放射治疗)、光动治疗、热疗、溶瘤治疗(例如，施用溶瘤病毒)或抗癌剂(例如，化疗剂、检查点抑制剂、细胞毒性剂、生长抑制剂、抗血管生成剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体-药物缀合物、癌症疫苗或其组合))组合施用。

另一方面，本发明提供了一种调节已经被施用或将要被施用具有树突细胞化学引诱剂编码基因的非病毒核酸载体的个体(例如，人类癌症患者)的肿瘤微环境的方法，其通过将电场传输至肿瘤微环境(例如，通过将脉冲电场传输至肿瘤微环境，例如使用肿瘤内定位的电极)，从而将树突细胞化学引诱剂编码基因递送至细胞(例如，肿瘤细胞)，以调节个体中的肿瘤微环境。

另一方面，本发明的特征在于通过以诱导树突细胞化学引诱剂编码基因表达的有效量向个体施用具有树突细胞化学引诱剂编码基因的非病毒核酸载体，在有此需要的个体(例如人类癌症患者，例如患有实体瘤的人类癌症患者)的肿瘤微环境中诱导调节蛋白的表达。在一些实施方案中，非病毒核酸载体是瘤内施用的。在其他实施方案中，非病毒核酸载体是全身施用的。在一些实施方案中，非病毒核酸载体与向肿瘤微环境的电场传输(例如脉冲电场治疗，例如使用肿瘤内定位的电极施用的脉冲电场治疗)组合施用。在一些实施方案中，所述方法包括通过将电场传输到肿瘤微环境中来调节肿瘤微环境，其中电场促进了非病毒核酸载体转移至细胞(例如，肿瘤细胞)中，从而将树突细胞化学引诱剂编码基因递送至上述细胞(例如肿瘤细胞)以诱导其表达。另外或可选地，非病毒核酸载体可以与另外的抗癌治疗(例如放射治疗(例如细胞毒性放射治疗)、光动治疗、热疗(hyperthermictherapy)、溶瘤治疗(例如，施用溶瘤病毒)或抗癌剂(例如，化疗剂、检查点抑制剂、细胞毒性剂、生长抑制剂、抗血管生成剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体-药物缀合物、癌症疫苗或其组合))组合施用。

另一方面，本发明提供了诱导个体(例如，人类癌症患者)的肿瘤微环境中树突细胞化学引诱剂表达的方法，所述个体已经或将要施用树突细胞化学引诱剂编码基因的非病毒核酸载体，所述方法通过将电场传输至肿瘤微环境(例如，通过将脉冲电场传输至肿瘤微环境，例如使用肿瘤内定位的电极)，从而将树突细胞化学引诱剂编码基因递送至细胞(例如，肿瘤细胞)，用以诱导肿瘤微环境中树突细胞化学引诱剂的表达。

另一方面，本发明提供了一种在有此需要的个体的肿瘤微环境中表达蛋白的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)施用编码所述蛋白的合成环状DNA载体；(b)将电场传输至肿瘤微环境中，其中电场促进了合成环状DNA载体转移至肿瘤细胞中，从而将所述蛋白的编码序列递送至肿瘤细胞以在个体的肿瘤微环境中表达。在一些实施方案中，步骤(b)包括传输脉冲电场。在一些实施方案中，脉冲电场通过肿瘤内定位的电极传输。在一些实施方案中，合成环状DNA载体是瘤内施用的。在一些实施方案中，合成环状DNA载体是全身施用的。

在一些实施方案中，合成环状DNA载体与另外的抗癌治疗组合施用。在一些实施方案中，蛋白选自树突细胞化学引诱剂编码基因、树突细胞生长因子或激活剂编码基因和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因。

在一些实施方案中，合成环状DNA载体编码树突细胞化学引诱剂编码基因、树突细胞生长因子或激活剂编码基因和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因。在一些实施方案中，合成环状DNA载体不包含复制起点、耐药基因或重组位点。在一些实施方案中，合成环状DNA载体不包含细菌骨架。

附图简要说明

图1A是显示本发明的具有单个转录单元的示例性DNA载体的示意图。DNA载体含有5'CAG启动子(P

图1B是凝胶图像，显示了代表图1A的合成环状DNA载体的条带，大小为4537bp。星号表示超螺旋单体形式的位置，占此处所示样品的78％。泳道1显示加载量为200ng的样品，而泳道2显示加载量为800ng的相同样品。蛋白梯是超螺旋蛋白梯(New EnglandBiosciences)。

图2A是显示本发明的示例性多转录单元DNA载体的示意图。DNA载体含有具有第一P

图2B是凝胶图像，显示了代表图2A的合成环状DNA载体的条带(SEQ ID NO：37)，大小为8035bp。星号表示超螺旋单体形式的位置，其占此处所示样品的85％。泳道1显示加载量为200ng的样品，而泳道2显示加载量为800ng的相同样品。蛋白梯是超螺旋蛋白梯(NewEngland Biosciences)。

图3A-3C的图显示了来自图2A所示的8035-bp多转录单元合成环状DNA载体的免疫调节蛋白的蛋白表达(c3-Tx)，其针对介质进行标准化并通过ELISA测量。图3A显示sFlt3L的表达；图3B显示IL-12p70的表达；图3C显示XCL1的表达。

图4是显示通过SEAP-QuantiBlue测定法通过c3-Tx表达功能性IL-12p70的图。

图5A-5C是显示骨髓源性树突细胞(BMDC)在各种条件下分化成常规DC(cDC)和浆细胞样DC(pDC)的流式细胞术图。图5A显示用c3-Tx转染的细胞(在条件培养基中)表达的20ng/mL sFLT3L中的分化；图5B显示20ng/mL重组sFLT3L中的分化；图5C显示重组可溶性GMCSF(rsGMCSF)中的分化。

图6A-6C是显示BMDC在各种条件下分化成cDC和pDC的条形图。图6A显示用c3-Tx转染的细胞(在条件培养基中)表达的20ng/mL sFLT3L中的分化；图6B显示20ng/mL重组sFLT3L中的分化；图6C显示重组可溶性GMCSF(rsGMCSF)中的分化。

图7A-7E是显示荷瘤小鼠在各种治疗条件下随时间推移的fLuc发光的活体图像。图7A和7B分别显示了治疗后3天和治疗后17天的PBS对照小鼠。图7C和7D分别显示了用编码fLuc的质粒DNA载体(p-fLuc)治疗时在治疗后3天和治疗后17天的小鼠。图7E和7F分别显示了用编码fLuc的合成环状DNA载体(c3-fLuc)治疗时在治疗后3天和治疗后17天的小鼠。

图8是显示图7A-7F的实验中相对于PBS对照的fLuc辐射度的图，包括第7、10和14天的额外时间点。

图9是显示与PBS对照小鼠相比，通过电转移用c3-Tx治疗的小鼠随时间的肿瘤生长图。

图10是显示施用单剂量的c3-Tx或PBS并施用电能的肿瘤中的免疫细胞浸润图。每个数据点代表c3-Tx治疗小鼠或PBS对照小鼠中表达CD45的肿瘤细胞的百分比。

图11是显示与注射PBS或c3-fLuc的小鼠相比，用两个剂量的c3-Tx治疗的小鼠随时间的存活率图。

图12是显示与注射PBS或c3-fLuc的小鼠相比，用两个剂量的c3-Tx治疗的小鼠随时间的平均肿瘤体积图。

图13是显示与注射合成环状DNA载体(c3-GFP)然后电转移的肿瘤以及注射PBS然后电转移的肿瘤相比，注射mRNA GFP然后电转移的肿瘤中的GFP表达的图。

图14A是显示编码sFLT3L、IL-12和XCL1的三顺反子自复制RNA分子的示意图，其长度为10,429bp。

图14B是显示编码sFLT3L、IL-12和XCL1的三顺反子自复制RNA分子的编码质粒的示意图，其长度为13,978。

图15A-15C的图显示了来自三顺反子自复制RNA分子和编码三顺反子自复制RNA分子的质粒的免疫调节蛋白的蛋白表达，其针对介质进行标准化并通过ELISA测量。图15A显示sFlt3L的表达；图15B显示IL-12p70的表达；图15C显示XCL1的表达。

图16是显示通过SEAP-QuantiBlue测定法测定的三顺反子自复制RNA分子和编码三顺反子自复制RNA分子的质粒的功能性IL-12p70表达的图。

图17是显示与用rFLT3L和rGMCSF处理相比，BMDC在各种条件下分化成cDC和pDC的条形图，所述条件包括用来自三顺反子自复制RNA分子和编码三顺反子自复制RNA分子的质粒的条件培养基处理。

图18A和18B是显示合成本发明的编码自复制RNA分子的环状DNA载体的示例性方法的示意图。示出了每个元件的相对排列。图18A是显示可用作起始材料的单独DNA片段的示意图。具有CAG启动子(P

图19A-19E是显示合成本发明的自复制RNA分子的示例性方法的示意图。描述了每个元件的相对排列。图19A是显示可用作起始材料的单独DNA片段的示意图。具有T7启动子(P

发明详述

本发明涉及通过施用携带调节基因的核酸载体(例如环状DNA载体)来调节肿瘤微环境以治疗癌症的组合物和方法。本发明至少部分基于以下发现：本发明的核酸载体(例如，环状DNA载体)可通过递送多种免疫调节基因而有效产生抗肿瘤免疫应答。本发明的组合物和方法可以通过募集和/或激活树突细胞来有效地调节肿瘤微环境，所述树突细胞可以通过将肿瘤抗原呈递给淋巴细胞(例如，T细胞)来指导抗肿瘤免疫。在一些情况下，在将电场传输至肿瘤微环境(例如，通过肿瘤内定位的电极传输脉冲电场)后，将核酸载体(例如，环状DNA载体)施用于患有癌症的个体。在本发明的具体实施方案中，本发明的组合物和方法可以通过向肿瘤微环境提供自复制RNA分子来减轻由于肿瘤细胞快速增殖而引起的调节基因表达的稀释。

I.定义

除非另外定义，否则本文中使用的技术和科学术语含义相同于本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义并且参考为本领域的技术人员提供对许多本申请中使用的术语的一般指导。如果本文所述的定义与参考出版物的定义之间存在任何冲突，则以本文提供的定义为准。

如本文所用，术语“环状DNA载体”是指环状形式的DNA分子。这种环状形式通常能够通过滚环扩增而被扩增成多联体。末端具有连接链(例如，共价缀合的骨架，例如通过发夹环或其他结构)的线性双链核酸不是本文所用的环状载体。术语“环状DNA载体”在本文中可与术语“共价闭合的环状DNA载体”互换使用。技术人员将理解，此类环状载体包括以超螺旋和复杂的DNA拓扑共价闭合的载体，如本文所述。在一些具体实施方案中，环状DNA载体是超螺旋的。在某些情况下，环状DNA载体缺乏细菌复制起点(例如，在环状DNA载体编码自复制RNA分子的情况下，环状DNA载体缺乏细菌复制起点并编码RNA复制起点)。

如本文所用，产生环状DNA载体的“无细胞方法”是指方法不依赖于宿主细胞例如细菌(例如大肠杆菌)宿主细胞内任何DNA的存在，以促进该方法的任何步骤，从提供模板DNA载体(例如，质粒DNA载体)到产生治疗性环状DNA载体。例如，无细胞方法发生在一个或多个合成容器(例如，玻璃或塑料管、生物反应器、器皿、罐或其他合适的容器)内的适当溶液(例如，缓冲溶液)中，其中可以添加酶和其他试剂以促进DNA扩增、修饰和分离。

如本文所用，术语“重组位点”和“位点特异性重组识别位点”均指作为位点特异性重组产物的核酸序列，其包括对应于第一重组酶附着位点部分的第一序列和对应于第二重组酶附着位点部分的第二序列。杂合重组位点的一个实例是attR，其是位点特异性重组的产物并且包括对应于attP部分的第一序列和对应于attB部分的第二序列。或者，重组位点可以由Cre/Lox重组产生。因此，由Cre/Lox重组产生的载体(例如，包含LoxP位点的载体)包括重组位点，如本文所用。产生重组位点的其他位点特异性重组事件涉及例如λ整合酶、FLP重组酶和Kw重组酶。由非位点特异性重组事件(例如ITR介导的分子间重组)产生的核酸序列不是重组位点，如本文所定义。

如本文所用，术语“自复制RNA分子”是指包含从一个复制起点复制的RNA的自复制基因元件。术语“自复制RNA”、“复制子RNA”和“自扩增复制子RNA”在本文中可互换使用。

如本文所用，术语“蛋白”是指通过肽键(即，作为一级结构)彼此连接的多个氨基酸，包括非共价结合的多聚体(例如，二聚体、三聚体等)蛋白(例如，具有四级结构的蛋白)。因此，术语“蛋白”涵盖肽、天然蛋白、重组蛋白及其片段。在一些实施方案中，蛋白在生理条件下具有一级结构并且不具有二级、三级或四级结构。在一些实施方案中，蛋白在生理条件下具有一级和二级结构并且不具有三级或四级结构。在具体实施方案中，蛋白在生理条件下具有一级结构、二级结构和三级结构，但不具有四级结构(例如，具有一个或多个折叠的α-螺旋和/或β折叠的单体蛋白)。在一些实施方案中，本文所述的任何蛋白具有至少25个氨基酸(例如，50至1,000个氨基酸)的长度。

如本文所用，术语“调节序列”是指编码一种或多种蛋白的核酸序列，所述蛋白通过与细胞表达的受体(例如，表面受体)结合和信号传导来参与(engage)和调节该细胞。调节序列可以是单顺反子或多顺反子的(例如，双顺反子或三顺反子)。

如本文所用，术语“免疫调节序列”是指编码一种或多种蛋白的核酸序列，所述蛋白例如通过与免疫细胞上的受体(例如表面受体)结合和信号传导来参与和调节免疫细胞(例如，先天性免疫细胞或适应性免疫细胞)。免疫调节序列可以是单顺反子或多顺反子的(例如，双顺反子或三顺反子)。

如本文所用，术语“多顺反子”是指在单个启动子下游包括多于一个蛋白编码基因的核酸序列(例如，DNA载体或RNA序列)(即，一个启动子驱动多于一种蛋白的表达)。多顺反子序列包括双顺反子序列和三顺反子序列。在一些情况下，多顺反子序列包括两个、三个、四个或更多个免疫调节蛋白编码基因。合成多顺反子核酸序列的方法是本领域已知的。在一些情况下，多个蛋白编码基因被终止信号和/或切割位点(例如，弗林蛋白酶-P2A位点)分隔开。

本文所用的术语“第一”、“第二”和“第三”用于鉴别核酸载体中的启动子，而不是描述启动子在载体上的位置，即，第一、第二和第三启动子可以按5'至3'方向排列，但不是必须如此。例如，包含分别驱动XCL1、FLT3L和IL-12表达的第一、第二和第三启动子的核酸载体以5'至3'方向涵盖以下中的每一个：启动子(P)-XCL1-P-FLT3L-P-IL-12；P-FLT3L-P-IL-12-P-XCL1；P-IL-12-P-XCL1-P-FLT3L；P-XCL1-P-IL-12-P-FLT3L；P-FLT3L-P-XCL1-P-IL-12；和P-IL-12-P-FLT3L-P-XCL1。第一、第二和第三启动子可以是相同的启动子(例如，CAG)。

如本文所用，术语“树突细胞化学引诱剂”是指在结合树突细胞上表达的受体(例如，通过结合至树突细胞表面受体)时吸引(例如，促进其浸润)树突细胞(例如，常规树突细胞(例如，cDC1或cDC2)或浆细胞样DC(例如，pDC))的蛋白。树突细胞化学引诱剂可以通过形成浓度梯度来促进树突细胞浸润至组织的一个区域，树突细胞在该浓度梯度上向高浓度化学引诱剂行进。在一些实施方案中，树突细胞化学引诱剂是炎性树突细胞化学引诱剂。示例性树突细胞化学引诱剂包括XCL1、XCL2、CCL5和CCL4。

如本文所用，除非另有说明，否则“XCL1”是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物例如灵长类动物(例如人类和食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠))的任何天然XCL1(C-趋化因子亚家族的成员，也称为淋巴趋化素(lymphotactin)、Ltn、ATAC、SCYC-α或SCYC-1)，以及功能等同或改进的变体(例如天然或合成变体)，例如突变(mutant)、突变蛋白(mutein)、类似物、亚基、受体复合物、同工型、剪接变体及其片段。功能等同和改进的变体可以基于XCR1信号传导(例如，通过XCL1结合DC表达的XCR1)来确定。在一些实施方案中，功能等同或改进的变体表现出改善的稳定性(例如，赋予XCL1结构(例如，折叠)稳定性的突变蛋白)。XCL1涵盖全长、未加工的XCL1以及由细胞中天然加工产生的任何形式的XCL1。所提供的示例性人XCL1序列是国家生物技术信息中心(NCBI)基因ID:6375。在一些情况下，XCL1由与SEQ ID NO:9或9A具有至少95％序列同一性的异源基因编码(例如与SEQ ID NO:9或9A具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性)。在一些情况下，由异源基因编码的XCL1与SEQ ID NO:10具有至少95％的序列同一性(例如，与SEQ ID NO:10具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性)。

如本文所用，除非另有说明，否则“XCL2”是指来自任何脊椎动物(包括哺乳动物例如灵长类动物(例如，人和食蟹猴)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠))来源的任何天然XCL2(C-趋化因子亚家族的成员，也称为SCM1-β或SCYC-2)，以及功能等同或改进的变体(例如，天然或合成变体)，例如突变、突变蛋白、类似物、亚基、受体复合物、同工型、剪接变体及其片段。功能等同和改进的变体可以基于XCR2信号传导(例如，通过XCL2结合DC表达的XCR2)来确定。在一些实施方案中，功能等同或改进的变体表现出改善的稳定性(例如，赋予XCL2结构(例如，折叠)稳定性的突变蛋白)。XCL2涵盖全长、未加工的XCL2以及由细胞中天然加工产生的任何形式的XCL2。所提供的示例性人XCL2序列是国家生物技术信息中心(NCBI)基因ID:6846。在一些情况下，XCL2由与SEQ ID NO:11或11A具有至少95％序列同一性的异源基因编码(例如与SEQ ID NO:11或11A具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性)。在一些情况下，由异源基因编码的XCL1与SEQ ID NO:12具有至少95％的序列同一性(例如，与SEQ ID NO:12具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性)。

如本文所用，除非另有说明，否则“CCL5”是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物例如灵长类动物(例如人类和食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠))的任何天然CCL5(也称为正常T细胞表达和分泌的活性调节蛋白(RANTES))，以及功能等同或改进的变体(例如天然或合成变体)，例如突变、突变蛋白、类似物、亚基、受体复合物、同工型、剪接变体及其片段。功能等同和改进的变体可以基于CCR5信号传导和/或其已知的下游效应(例如，树突细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、效应记忆T细胞、B细胞或NK细胞的CCR5相关迁移和/或肿瘤浸润)来确定。在一些实施方案中，功能等同或改进的变体表现出改善的稳定性。CCL5涵盖全长、未加工的CCL5以及由细胞中天然加工产生的任何形式的CCL5。所提供的示例性人CCL5蛋白序列是UniProt登录号P13501。在一些情况下，CCL5由与SEQ ID NO:13或13A具有至少95％序列同一性的异源基因编码(例如与SEQ ID NO:13或13A具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性)。在一些情况下，由异源基因编码的CCL5与SEQ ID NO:14具有至少95％的序列同一性(例如，与SEQ ID NO:14具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性)。

如本文所用，除非另有说明，否则“CCL4”是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物例如灵长类动物(例如人类和食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠))的任何天然CCL4(也称为巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β))，以及功能等同或改进的变体(例如天然或合成变体)，例如突变、突变蛋白、类似物、亚基、受体复合物、同工型、剪接变体及其片段。功能等同和改进的变体可以基于CCR5受体信号传导和/或其已知的下游效应(例如，树突细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、效应记忆T细胞、B细胞或NK细胞的CCR5相关迁移和/或肿瘤浸润)来确定。在一些实施方案中，功能等同或改进的变体表现出改善的稳定性。CCL4涵盖全长、未加工的CCL4以及由细胞中天然加工产生的任何形式的CCL4。所提供的示例性人CCL4蛋白序列是UniProt登录号P13236。在一些情况下，CCL4由与SEQ ID NO:15或15A具有至少95％序列同一性的异源基因编码(例如与SEQ ID NO:15或15A具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性)。在一些情况下，由异源基因编码的CCL4与SEQ ID NO:16具有至少95％的序列同一性(例如，与SEQ ID NO:16具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性)。

如本文所用，术语“树突细胞生长因子或激活剂”是指在结合至树突细胞上表达的受体(例如，通过结合至树突细胞表面受体)时促进树突细胞(例如，常规树突细胞(例如，cDC1或cDC2)或浆细胞样DC(例如，pDC))的分化、激活和/或动员的蛋白。树突细胞生长因子和激活剂包括FLT3L、GM-CSF、CD40和CD40L。如本文所用，FLT3L编码基因(例如sFLT3L编码基因)、GM-CSF编码基因和CD40或CD40L编码基因是树突细胞生长因子或激活剂编码基因。

如本文所用，除非另有说明，否则“Fms相关受体酪氨酸激酶3配体(FLT3L)”是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物例如灵长类动物(例如人类和食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠))的任何天然FLT3L，以及功能等同或改进的变体(例如天然或合成变体)，例如突变、突变蛋白、类似物、亚基、受体复合物、同工型、剪接变体及其片段。FLT3L涵盖可溶性FLT3L(sFLT3L)。功能等同和改进的变体可以基于酪氨酸激酶III受体信号传导和/或其已知的下游效应(例如，FLT3L相关造血调控)来确定。在一些实施方案中，功能等同或改进的变体表现出改善的稳定性。FLT3L涵盖全长、未加工的FLT3L以及由细胞中天然加工产生的任何形式的FLT3L。所提供的示例性人FLT3L蛋白序列是UniProt登录号P49771。在一些情况下，sFLT3L由与SEQ ID NO:17或17A具有至少95％序列同一性的异源基因编码(例如与SEQ ID NO:17或17A具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性)。在一些情况下，由异源基因编码的FLT3L与SEQ ID NO:18具有至少95％的序列同一性(例如，与SEQ ID NO:18具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性)。

如本文所用，除非另有说明，否则“粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)”是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物例如灵长类动物(例如人类和食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠))的任何天然GM-CSF(也称为CSF2)，以及功能等同或改进的变体(例如天然或合成变体)，例如突变、突变蛋白、类似物、亚基、受体复合物、同工型、剪接变体及其片段。功能等同和改进的变体可以基于CSF2R受体信号传导和/或其已知的下游效应(例如，JAK-2募集和激活、STAT5磷酸化、pim-1和/或CIS转录、PI

如本文所用，除非另有说明，否则“分化簇40配体(CD40L)”是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物例如灵长类动物(例如人类和食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠))的任何天然CD40L，以及功能等同或改进的变体(例如天然或合成变体)，例如突变、突变蛋白、类似物、亚基、受体复合物、同工型、剪接变体及其片段。功能等同和改进的变体可以基于CD40/TNFRSF5信号传导和/或其已知的下游效应(例如，T细胞共刺激以及T细胞受体(TCR)结合、IL-4和/或IL-10产生、NFκB激活、T细胞中的MAPK8激活和/或T细胞中的PAK2激活)来确定。在一些实施方案中，功能等同或改进的变体表现出改善的稳定性。CD40L涵盖全长、未加工的CD40L以及由细胞中天然加工产生的任何形式的CD40L。所提供的示例性人CD40L蛋白序列是UniProt登录号P29965。在一些情况下，CD40L由与SEQ ID NO:21或21A具有至少95％序列同一性的异源基因编码(例如与SEQ ID NO:21或21A具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性)。在一些情况下，由异源基因编码的CD40L与SEQ ID NO:22具有至少95％的序列同一性(例如，与SEQ ID NO:22具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性)。

如本文所用，术语“淋巴细胞信号传导蛋白”是指在与淋巴细胞上表达的受体结合时(例如，通过与淋巴细胞表面受体结合)向淋巴细胞发出信号的蛋白。在一些情况下，淋巴细胞信号传导蛋白引发淋巴细胞例如T细胞和/或NK细胞的激活和/或浸润(例如，肿瘤浸润)。在一些情况下，淋巴细胞信号传导蛋白是可溶性淋巴细胞信号传导蛋白。淋巴细胞信号传导蛋白包括细胞因子和趋化因子。

术语“细胞因子”是指作为细胞间介体(例如作为旁分泌信号)作用于免疫细胞(例如先天性或适应性免疫细胞)的可溶性蛋白。示例性的细胞因子包括白细胞介素(IL)，例如IL-1、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21和IL-36-γ；肿瘤坏死因子，例如TNF-α或TNF-β；干扰素(IFN)，例如IFN-γ和IFN-α；以及其他蛋白因子，包括白血病抑制因子(LIF)和kit配体(KL)。在一些情况下，细胞因子引发淋巴细胞例如T细胞和/或NK细胞的激活。

如本文所用，术语“趋化因子”是指由细胞释放的可溶性蛋白，其作用于免疫细胞以选择性诱导趋化性和激活(例如，肿瘤浸润和激活)。趋化因子还可引发血管生成、炎症、伤口愈合和肿瘤发生。在某些情况下，趋化因子是炎性的。示例性趋化因子包括CXCL9和CXCL10。可用作本发明一部分的趋化因子的其他非限制性实例包括CCL14、CCL19、CCL20、CCL21、CCL25、CCL27、CXCL12、CXCL13、CXCL-8、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL11和CXCL10。

如本文所用，除非另有说明，否则“白细胞介素-12(IL-12)”是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物例如灵长类动物(例如人类和食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠))的任何天然IL-12(例如，IL-12p35/p40异二聚体；IL-12p70)，以及功能等同或改进的变体(例如天然或合成变体)，例如突变、突变蛋白、类似物、亚基、受体复合物、同工型、剪接变体及其片段。功能等同和改进的变体可以基于本领域已知的特定促炎效应和/或Th1-偏向效应(例如，诱导IFN-γ，例如来自T细胞和/或NK细胞的IFN-γ)来确定。在一些实施方案中，功能等同或改进的变体表现出改善的稳定性。IL-12涵盖全长、未加工的IL-12以及由细胞中天然加工产生的任何形式的IL-12。IL-12涵盖IL-12亚基p35和p40的合成融合物(例如，通过接头)。在一些情况下，IL-12由与SEQ ID NO:23或23A具有至少95％序列同一性的异源基因编码(例如与SEQ ID NO:23或23A具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性)。在一些情况下，由异源基因编码的IL-12与SEQ ID NO:24具有至少95％的序列同一性(例如，与SEQ ID NO:24具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性)。

如本文所用，除非另有说明，否则“白细胞介素-15(IL-15)”是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物例如灵长类动物(例如人类和食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠))的任何天然IL-15，以及功能等同或改进的变体(例如天然或合成变体)，例如突变、突变蛋白、类似物、亚基、受体复合物、同工型、剪接变体及其片段。功能等同和改进的变体可以基于IL-15R信号传导途径激活(例如，JAK激酶激活、STAT3激活、STAT5激活和/或STAT6激活；和/或T细胞和NK细胞激活)来确定。在一些实施方案中，功能等同或改进的变体表现出改善的稳定性。IL-15涵盖全长、未加工的IL-15以及由细胞中天然加工产生的任何形式的IL-15。IL-15涵盖IL-15的合成融合物及其受体。在一些情况下，IL-15由与SEQ ID NO:25或25A具有至少95％序列同一性的异源基因编码(例如与SEQ ID NO:25或25A具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性)。在一些情况下，由异源基因编码的IL-15与SEQ ID NO:26具有至少95％的序列同一性(例如，与SEQ ID NO:26具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性)。

如本文所用，除非另有说明，否则“趋化因子(C-X-C基序)配体9(CXCL9)”是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物例如灵长类动物(例如人类和食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠))的任何天然CXCL9(也称为由γ干扰素诱导的单核因子(MIG))，以及功能等同或改进的变体(例如天然或合成变体)，例如突变、突变蛋白、类似物、亚基、受体复合物、同工型、剪接变体及其片段。功能等同和改进的变体可以基于CXCR3受体相互作用来确定。在一些实施方案中，功能等同或改进的变体表现出改善的稳定性。CXCL9涵盖全长、未加工的CXCL9以及由细胞中天然加工产生的任何形式的CXCL9。所提供的示例性人CXCL9蛋白序列是UniProt登录号Q07325。在一些情况下，CXCL9由与SEQ ID NO:27或27A具有至少95％序列同一性的异源基因编码(例如与SEQ ID NO:27或27A具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性)。在一些情况下，由异源基因编码的CXCL9与SEQ ID NO:28具有至少95％的序列同一性(例如，与SEQ ID NO:28具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性)。

如本文所用，除非另有说明，否则“趋化因子(C-X-C基序)配体10(CXCL10)”是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物例如灵长类动物(例如人类和食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠))的任何天然CXCL10(也称为由γ干扰素诱导的单核因子(MIG))，以及功能等同或改进的变体(例如天然或合成变体)，例如突变、突变蛋白、类似物、亚基、受体复合物、同工型、剪接变体及其片段。功能等同和改进的变体可以基于CXCR3受体相互作用来确定。在一些实施方案中，功能等同或改进的变体表现出改善的稳定性。CXCL10涵盖全长、未加工的CXCL10以及由细胞中天然加工产生的任何形式的CXCL10。所提供的示例性人CXCL10蛋白序列是UniProt登录号P02778。在一些情况下，CXCL10由与SEQ ID NO:29或29A具有至少95％序列同一性的异源基因编码(例如与SEQ ID NO:29或29A具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性)。在一些情况下，由异源基因编码的CXCL10与SEQID NO:30具有至少95％的序列同一性(例如，与SEQ ID NO:30具有至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性)。

如本文所用，术语“治疗序列”是指DNA分子部分(例如，质粒DNA载体或其多联体)，其含有一个或多个治疗部分在靶细胞中转录所需的任何遗传物质，这可包括一种或多种编码序列、启动子、终止子、内含子和/或其他调控元件。治疗部分可以是治疗蛋白(例如，替代蛋白(例如，替代靶细胞中缺陷蛋白的蛋白)或内源蛋白(例如，免疫调节蛋白，如细胞因子))和/或治疗性核酸(例如，一种或多种microRNA)。在具有多于一个转录单元的DNA载体中，治疗序列含有多个转录单元。治疗序列可以包括为了治疗目的而施用的一个或多个基因(例如异源基因或转基因)。

术语“异源基因”是指待施用的转基因(例如，作为DNA载体或自复制RNA分子的一部分)。异源基因可以是由接受异源基因的个体内源表达的哺乳动物基因(例如，异源调节(例如，免疫调节)蛋白编码基因)。如本文所用，异源基因、复制酶或其片段的“变体”与参考氨基酸序列(例如天然存在的氨基酸序列或氨基酸序列)具有至少一个氨基酸残基的不同。在本文中，所述至少一个氨基酸残基的不同可以包括例如一个氨基酸残基突变为另一个氨基酸、缺失或插入。变体可以是本文定义的治疗蛋白或其片段的同源物、同工型或转录物变体，其中所述同源物、同工型或转录物变体的特征分别在于一定程度的同一性或同源性，如本文所定义。

在一些情况下，异源基因、复制酶或其片段的变体包括至少一个氨基酸取代(例如，1-100个氨基酸取代、1-50个氨基酸取代、1-20个氨基酸取代、1-10个氨基酸取代，例如1个氨基酸取代、2个氨基酸取代、3个氨基酸取代、4个氨基酸取代、5个氨基酸取代、6个氨基酸取代、7个氨基酸取代、8个氨基酸取代、9个氨基酸取代或10个氨基酸取代)。同一类氨基酸彼此交换的取代称为保守取代。特别地，这些是具有脂族侧链的氨基酸、带正电荷或带负电荷的侧链的氨基酸、侧链中有芳族基团的氨基酸或其侧链可形成氢桥的氨基酸，例如具有羟基官能团的侧链的氨基酸。通过保守取代，例如，具有极性侧链的氨基酸可以被具有对应极性侧链的另一个氨基酸取代，或者，例如，以疏水性侧链为特征的氨基酸可以被具有对应疏水侧链的另一个氨基酸取代(例如，丝氨酸(苏氨酸)被苏氨酸(丝氨酸)取代，或亮氨酸(异亮氨酸)被异亮氨酸(亮氨酸)取代)。在某些实施方案中，蛋白或其片段的变体可以由本发明的RNA编码，其中氨基酸序列的至少一个氨基酸残基与参考序列(例如相应的自然存在的序列)相比包括至少一个保守取代。

在一些情况下，术语变体还涵盖插入、缺失和/或非保守取代，例如在不引起蛋白三维结构的实质性改变的那些位置处的插入、缺失和/或非保守取代。本领域技术人员可以容易地确定通过插入或缺失对三维结构的改变，例如使用CD光谱(圆二色光谱)。

为了确定两个序列(例如，核酸序列，例如DNA、RNA，或氨基酸序列)的同一百分比，可以比对序列以便随后相互比较。出于该目的，可以将空位插入到第一序列的序列中，并且可以比较第二序列的相应位置处的组分。如果第一序列中的位置被与第二序列中相应位置处的情况相同的组分占据，则两个序列在该位置处是相同的。两个序列的同一百分比是同一位置数除以位置总数的函数。两个序列的同一百分比可以使用数学算法来确定。可以使用的数学算法的优选但非限制性示例是Karlin等人(1993),PNAS USA,90:5873-5877或Altschul等人(1997),Nucleic Acids Res.,25:3389-3402的算法。这样的算法可以整合到例如BLAST程序中。通过该程序可以鉴定与本发明的序列在一定程度上同一的序列。在本文所述的任何实施方案中，序列可与其所引用的特定SEQ ID NO:(例如，SEQ ID NO：1-36中的任一个)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。本领域技术人员理解，凭借遗传密码，本文所述的DNA序列可推导相应的RNA序列，同样地，RNA序列可推导相应的DNA序列。本文所述的所有序列均列于表1中。

如本文所用，术语“有效连接”(operably linked或operatively linked)是指元件的排列，其中如此描述的组件被配置为执行其通常的功能。当核酸被置于与另一核酸序列的功能关系中时，该核酸是“有效连接”的。例如，如果启动子影响一个或多个异源基因的转录，则该启动子与该一个或多个异源基因有效连接。此外，有效连接至编码序列的控制元件能够影响编码序列的表达。控制元件不需要与编码序列相连续，只要它们起到引导其表达的作用即可。因此，例如，插入的非翻译但转录的序列可以存在于启动子序列和编码序列之间，并且启动子序列仍然可以被认为是与编码序列“有效连接”。

如本文所用，术语“分离的”是指人工产生的且未整合到天然宿主基因组中。例如，分离的核酸载体包括包封在脂质包膜(例如，脂质体)或聚合物基质中的核酸载体。在一些实施方案中，术语“分离的”是指这样的DNA载体：(i)体外扩增(例如，在无细胞环境中)，例如通过滚环扩增或聚合酶链式反应(PCR)；和(ii)通过分子克隆重组产生；(iii)纯化的，如通过限制性核酸内切酶切割和凝胶电泳分级分离，或柱层析；或者(iv)合成的，例如通过化学合成来合成。分离的核酸载体是易于通过本领域熟知的重组DNA技术操作的载体。因此，包含在载体中的核苷酸序列(其中5'和3'限制性位点已知或针对其的聚合酶链式反应(PCR)引物序列已被公开)被认为是分离的，但以其天然状态存在于其天然宿主中的核酸序列不是分离的。分离的核酸载体可以是基本上纯化的，但不一定如此。分离的自复制分子是可以通过本领域公知的重组技术容易操作的分子。分离的自复制RNA分子可以是基本上纯化的，但不一定如此。例如，分离的自复制RNA分子包括包封在脂质包膜(例如，脂质体)或聚合物基质中的自复制RNA分子。

如本文所用，术语“裸的”是指核酸分子(例如，环状DNA载体)在施用于个体时未包封在脂质包膜(例如，脂质体)或聚合物基质中以及不与固体结构(例如颗粒结构)物理性结合(例如，共价或非共价结合)。在本发明的一些情况下，药物组合物包含裸的环状DNA载体(例如，裸的合成的环状DNA载体)。

术语“药物组合物”是指其形式使得其中所含的一种或多种活性成分的生物活性有效且不含有对制剂施用的患者具有不可接受的毒性的其他成分的药剂。药物组合物可以包括药学上可接受的载体(例如液体或干燥(例如冻干)形式)。

短语“药学上可接受的”表示物质或组合物必须在化学上和/或毒理学上与构成制剂的其他成分和/或用其治疗的哺乳动物相容。

术语“载体”是指本发明的载体或组合物施用所使用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。合适的药物载体的实例描述于“Remington's Pharmaceutical Sciences,”AcademicPress.,第23版,2020。

如本文所用，“载体”是指能够携带目标序列(例如，异源基因或治疗序列)的核酸分子，其连接进入靶细胞中，在此异源基因可以复制、加工和/或表达。在靶细胞或宿主细胞处理载体的目标序列(例如，基因组)之后，目标序列(例如，基因组)不被认为是载体。一种类型的载体是“质粒”，其是指含有其中可连接额外DNA片段的细菌骨架的环状双链DNA环。另一种类型的载体是噬菌体载体。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA片段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们所有效连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“重组载体”或“表达载体”)。一般而言，重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。

如本文所用，“靶细胞”是指表达由异源基因编码的调节蛋白的细胞。靶细胞包括肿瘤细胞(即，癌细胞)和肿瘤驻留细胞(例如，存在于肿瘤微环境中的健康细胞(例如，肿瘤驻留抗原呈递细胞，例如树突细胞，和肿瘤浸润淋巴细胞，例如T细胞))。

如本文所用，术语“个体”包括需要本文所述的治疗或预防方法的任何哺乳动物(例如，患有癌症的哺乳动物)。在一些实施方案中，个体是人类。在其他实施方案中，个体是非人类哺乳动物(例如，非人类灵长类动物(例如，猴)、小鼠、猪、兔、猫或狗)。受试者可以是雄性或雌性。在一个实施方案中，受试者患有癌症，例如特征在于存在一种或多种实体瘤的癌症。

“癌症”是指恶性癌细胞的异常增殖，并且包括以存在实体瘤为特征的癌症，例如肉瘤、皮肤癌、黑色素瘤、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、结直肠癌、宫颈癌、肝癌、头颈癌、食道癌、胰腺癌、肾癌、肾上腺癌、胃癌、睾丸癌、胆囊癌和胆道癌、甲状腺癌、胸腺癌、骨癌和脑癌。癌症患者中的癌细胞(例如，肿瘤细胞)可能在免疫学上不同于受试者中的正常体细胞(例如，癌症肿瘤可是免疫原性的)。例如，癌细胞可以在癌症患者中引发针对由癌细胞表达的一种或多种抗原的全身免疫应答。引发免疫应答的抗原可以是肿瘤抗原或者可以是正常细胞共有的。患有癌症的患者可以表现出足够以根据本领域已知的至少一种可识别的指征、症状或临床标准诊断癌症的的测试结果。此类临床标准的实例在医学教科书中描述，例如Harrison's Principles of Internal Medicine(Longo DL,Fauci AS,Kasper DL,Hauser SL,Jameson J,Loscalzo J.eds.18e.New York,NY McGraw-Hill；2012)。在一些情况下，个体的癌症诊断可以包括从个体获得的体液或组织样品中鉴定特定细胞类型(例如，癌细胞)。

如本文所用，“实体瘤”是除血液、骨髓或淋巴系统之外的身体组织的任何癌症。实体瘤可进一步分为上皮细胞来源的实体瘤和非上皮细胞来源的实体瘤。上皮细胞的实体瘤的实例包括头颈、胃肠道、结肠、乳腺、前列腺、肺、肾、肝、胰腺、卵巢、口腔、胃、十二指肠、小肠、大肠、肛门、胆囊、阴唇、鼻咽、皮肤、子宫、雄性生殖器官、泌尿器官、膀胱和皮肤的肿瘤。非上皮来源的实体瘤包括肉瘤、脑肿瘤和骨肿瘤。

如本文所用，“肿瘤微环境”是指实体瘤内细胞和细胞外物质(例如基质蛋白、囊泡和可溶性因子(例如细胞因子))的集合。

如本文所用，核酸载体或其组合物的“有效量”或“有效剂量”是指所述量足以实现期望的生物学和/或药理学效果，例如当根据选择的施用形式、途径和/或时间表施用于个体时。如本领域普通技术人员将理解的，有效的特定组合物的绝对量可以根据诸如期望的生物学或药理学终点、待递送的药剂、靶组织等因素而变化。本领域普通技术人员将进一步理解，“有效量”可以以单剂量或通过使用多剂量而与细胞接触或施用于受试者。治疗癌症的有效量的组合物可以减缓或停止疾病进展(例如，肿瘤生长和/或转移)、提高部分或完全应答、提高总体存活(例如，相对于参考群体，例如未经治疗的群体或安慰剂群体)。

如本文所用，“治疗”(及其语法变体)是指试图改变被治疗个体的自然病程的临床干预，其可以为了预防而进行，也可以在临床病理学病程期间进行。期望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、防止转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态以及缓解或预后改善。在一些实施方案中，本发明的核酸载体(例如，环状DNA载体)用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。

具体地，治疗可包括减少或抑制癌症生长，包括完全的癌症缓解和/或癌症转移抑制。癌症生长通常是指表明癌症的更进一步形式的变化的许多指标中的任何一个。因此，用于测量癌症生长抑制的指数可以在癌细胞活力、肿瘤体积或形式(例如，如使用计算机断层扫描(CT)、超声检查或其他成像方法测定)方面的降低。延迟肿瘤生长、破坏肿瘤脉管系统、改善迟发型超敏反应皮肤试验的表现、增加溶细胞性T淋巴细胞活性和降低肿瘤特异性抗原水平。减少受试者的癌性肿瘤的免疫抑制可以提高受试者抵抗癌症生长、特别是已存在于受试者中的癌症生长的能力和/或降低受试者中癌症生长的倾向性。

“减少或抑制”是指引起优选20％或更大、更优选50％或更大、最优选75％、85％、90％、95％或更大的总体减少的能力。减少或抑制可以指所治疗的病症的症状、转移的存在或大小、原发肿瘤的大小。

如本文所用，“调节”肿瘤微环境是指引起已知与肿瘤进展和肿瘤清除之间的平衡相关的或影响(即直接或间接影响)该平衡的任何肿瘤生物标志物的可测量的变化。例如，如果治疗增加了与肿瘤清除相关的生物标志物，例如肿瘤微环境中的免疫原性蛋白(例如促炎细胞因子或树突细胞激活蛋白，或在细胞表面表达的蛋白，例如激活的肿瘤浸润淋巴细胞)的相对表达和/或肿瘤微环境中的免疫原性细胞特征(例如，存在的肿瘤浸润淋巴细胞增加)，则该治疗调节肿瘤微环境。在一些实施方案中，如果治疗降低了与肿瘤进展相关的生物标志物的相对表达(例如，T细胞耗竭的生物标志物，例如PD-1或PD-L1在肿瘤微环境中的表达)，则称该治疗调节了肿瘤微环境。与肿瘤清除或肿瘤进展相关的生物标志物可以通过任何合适的方法来确定，例如蛋白质印迹、免疫组织化学(IHC)、聚合酶链式反应(PCR)、单细胞测序、流式细胞术、MSD(meso-scalediscovery)或其他常规测定，例如对肿瘤微环境或血液(例如循环细胞、血浆或血清)的活检进行。在一些实施方案中，可测量的变化是任何统计学上显著的变化，例如与肿瘤进展相关的免疫原性蛋白或其他生物标志物的表达水平的变化。例如，表达水平的可测量变化可以是免疫原性蛋白或与肿瘤进展相关的其他生物标志物的表达水平相对于参考表达水平(例如，在未治疗或在治疗之前在参考细胞、组织或受试者中的表达)变化至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少75％或至少90％。在一些情况下，如果治疗延长无进展生存期、导致客观反应(包括部分反应或完全反应)、增加总生存时间和/或改善一种或多种癌症症状，则确定肿瘤微环境已被该治疗调节。

如本文所用，术语“生物标志物”是指基于蛋白、DNA、RNA、碳水化合物或糖脂的分子标志物，其在个体、受试者或患者的样品中的表达或存在可以通过标准方法(或本文公开的方法)检测并且可用于监测肿瘤环境对环状DNA载体或其组合物的响应性或敏感性。这样的生物标志物可以确定为在本发明的方法治疗的个体获得的样品中的表达相对于参考水平更高或更低，所述参考水平包括例如来自患者组/群体(例如患有一种实体瘤的患者)的样品中生物标志物的中值表达水平；来自患者组/群体(例如患有多种实体瘤的患者)的样品中生物标志物的中值表达水平；或在之前从患者先前获得的样品中的水平。表达水平大于或小于生物标志物参考表达水平的个体可被表征为具有已通过治疗得到调节的肿瘤微环境的个体。例如，表现出相对于参考水平(例如中值水平，如上所述)的至多50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％的基因表达水平的此类个体可以被鉴定为具有已通过治疗得到调节的肿瘤微环境的个体。

术语“表达的水平”或“表达水平”可互换使用并且通常指生物样品(例如，肿瘤样品)中多核苷酸或氨基酸产物或蛋白的量。“表达”通常是指将基因编码信息转化为细胞中存在和运行的结构的过程。因此，根据本发明，基因的“表达”可以指转录成多核苷酸、翻译成蛋白或蛋白的翻译后修饰。转录的多核苷酸、翻译的蛋白或翻译后修饰的蛋白的片段也应被视为表达的，无论它们源自通过不同剪接产生的转录物或降解的转录物，还是源自蛋白的翻译后加工，例如，通过蛋白水解。“表达的基因”包括那些被转录成多核苷酸即mRNA然后被翻译成蛋白的基因，以及那些被转录成RNA但不被翻译成蛋白的基因(例如，转运RNA和核糖体RNA)。

如本文所用，术语“表达持续性”是指目标序列(例如，异源基因或治疗序列)或其功能部分(例如，治疗DNA载体的一个或多个编码序列)在其转染的细胞中(“细胞内持续性”)或其转染的细胞的任何后代中(“跨代持续性”)可表达一段时间。目标序列(例如，异源基因或治疗序列)或其功能部分如果不被沉默，例如通过DNA甲基化和/或组蛋白甲基化和压缩，则可以是可表达的。评价表达持续性可以通过检测或定量(i)检测或定量从靶细胞或其后代中的目标序列(例如，异源基因或治疗序列)转录的mRNA(例如，通过qPCR、RNA-seq或任何其他合适方法来检测或定量)和(ii)检测或定量从靶细胞或其后代中的目标序列(例如异源基因或治疗序列)翻译的蛋白(例如，通过Western印迹、ELISA或任何其他合适方法)。在一些情况下，评价表达持续性是通过检测或定量靶细胞或其后代中的治疗DNA(例如，靶细胞中治疗性环状DNA载体的存在，例如通过游离型DNA拷贝数分析)并结合以下之一或两者：(i)从靶细胞或其后代中的目标序列(例如，异源基因或治疗序列)转录的mRNA和(ii)从靶细胞或其后代中的目标序列(例如，异源基因或治疗序列)翻译的蛋白。使用本领域已知的任何基因表达表征方法，可以相对于参考载体定量目标序列(例如，异源基因或治疗序列)或其功能部分的表达持续性，所述参考载体例如是在细菌中产生的对照载体(例如，在细菌中产生的或具有不存在于本发明的载体(例如，质粒)中的一种或多种细菌特征环状载体)。可以在施用载体后的任何给定时间点对表达持续性进行定量。例如，在一些实施方案中，如果在施用治疗性环状DNA载体后两周在靶细胞或其后代中可检测到本发明的治疗性环状DNA载体的表达，则本发明的治疗性环状DNA载体的表达在施用后持续至少两周。在一些实施方案中，如果在施用后一周、两周、三周、四周、六周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、一年或更长时间在靶细胞中可检测到基因的表达，则所述基因的表达在靶细胞中“持续”。在一些实施方案中，如果在给定时间段(例如，施用后一周、两周、三周、四周、六周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、一年或更长时间)后仍然存在任何可检测分数的原始表达水平(例如，原始表达水平的至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少70％或至少100％)，则将目标序列(例如，异源基因或治疗序列)的表达称为在施用后持续所述给定时间段。

术语“样品”和“生物样品”可互换使用，指从个体获得的任何生物样品，包括身体组织(例如，肿瘤组织)、体液、细胞或其他来源。体液是例如淋巴液、血清、新鲜全血、外周血单核细胞、冷冻全血、血浆(包括新鲜或冷冻的)、尿液、唾液、精液、滑膜液和脊髓液。样品还包括乳腺组织、肾组织、结肠组织、脑组织、肌肉组织、滑膜组织、皮肤、毛囊、骨髓和肿瘤组织。从哺乳动物获得组织活检和体液的方法是本领域公知的。

如本文所用，“施用”意指向个体给予一定剂量的本发明核酸载体或其组合物(例如药物组合物，例如包含核酸载体的药物组合物)的方法。本文所述方法中使用的组合物可以例如瘤内、瘤周、静脉内、皮下、皮内、经皮、肌内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鞘内、鼻内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、腹膜内、结膜下、小泡内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、眼眶内、口服、局部、经皮、眼周、经结膜、腱下(subtenonly)、前房内(intracamerally)、视网膜下、眼球后、小管内(intracanalicularly)、通过吸入、通过注射、通过植入、通过输注、通过连续输注、通过局部灌注直接浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、在乳膏中或在脂质组合物中施用。本文所述的方法中使用的组合物可以全身或局部(例如，瘤内或瘤周)施用。施用方法可以根据各种因素(例如，所施用的化合物或组合物以及所治疗的病况、疾病或病症的严重程度)而变化。

“组合施用”是指作为同一治疗方案的一部分施用多种治疗组分。本发明的核酸载体(例如环状DNA载体)可以与脉冲电场治疗组合施用，例如作为同一门诊手术的一部分或在多天的过程中施用。另外或可选地，本发明的核酸载体(例如，环状DNA载体)可以与另一治疗剂组合施用(例如，作为同一药物组合物的一部分或作为单独的药物组合物，同时或不同时施用)。

如本文所用，“电转移”是指分子(例如，核酸载体，例如环状DNA载体)穿过靶细胞膜(例如，从靶细胞外部到内部)的移动，其由将电场(例如，脉冲电场)传输至细胞所在的微环境而引起。电转移可以作为电泳的结果而发生，即，分子(例如核酸载体，例如环状DNA载体)基于分子的电荷沿着电场(例如，在电流的方向上)移动。电泳可以诱导电转移，例如通过使分子(例如核酸载体，例如环状DNA载体)移动至细胞膜附近以允许生物转运过程(例如，胞吞作用，包括胞饮作用或吞噬作用)或被动转运(例如，扩散或脂质分配)以将分子携带到细胞中。另外或可选地，电转移可以由于电穿孔而发生，即，由电场(例如，脉冲电场)的传输引起的靶细胞中孔的产生，其中孔的尺寸、形状和持续时间适于促进分子(例如核酸载体，例如环状DNA载体)从靶细胞外部移动到靶细胞内部。因此，在一些情况下，电转移是电泳和电穿孔组合的结果。

“化疗剂”是可用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括烷化剂，例如噻替哌(thiotepa)和环磷酰胺

本文定义的化疗剂包括“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”，其作用是调节、减少、阻断或抑制可促进癌症生长的激素的作用。它们本身可是激素，包括但不限于：具有混合激动剂/拮抗剂特性的抗雌激素，包括他莫昔芬(tamoxifen)

本文所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如，At

本文使用的“生长抑制剂”是指在体外或体内抑制细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是一种显著降低S期细胞百分比的抑制剂。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期进展(在S期以外的阶段)的药剂，例如诱导G1期停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻滞剂包括长春花(长春新碱和长春花碱)、紫杉烷类和拓扑异构酶II抑制剂，例如多柔比星、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博莱霉素。那些阻滞G1的药物也会导致S期阻滞，例如DNA烷化剂，如他莫昔芬、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。更多信息可参见Mendelsohn等人编,The Molecular Basis of Cancer，第1章，Murakami等人的标题"Cell cycleregulation,oncogenes,and antineoplastic drugs"(W.B.Saunders,Philadelphia,1995)，例如第13页。紫杉烷类(Taxanes)(紫杉醇和多西紫杉醇(docetaxel))都是衍生自紫杉树中的抗癌药物。多西他赛(

术语“a”和“an”意指“一个或多个”。例如，“基因”理解为代表一个或多个此类基因。因此，术语“a”和“an”、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。

如本文所用，术语“约”是指与参考值在±10％变化内的值，除非另有说明。

II.治疗组合物

本发明涉及核酸载体(例如环状DNA载体，例如裸的环状DNA载体；或自复制RNA分子)及其药物组合物，其可用于治疗癌症的方法，例如通过调节肿瘤微环境(例如免疫调节肿瘤微环境)。此类核酸载体包括环状DNA载体(例如，具有多个转录单元的环状DNA载体，每个转录单元编码免疫调节基因；具有编码多个免疫调节基因的单个转录单元的环状DNA载体；以及编码自复制RNA分子的环状DNA载体，该自复制RNA分子编码复制酶和一个或多个免疫调节基因)。在一些情况下，环状DNA载体(例如，裸的环状DNA载体)是合成环状DNA载体，其是指使用无细胞方法产生的环状DNA载体，在该方法中由模板产生环状DNA载体而不涉及细菌细胞。

核酸载体

本文提供具有调节序列的核酸载体(例如DNA载体，例如环状DNA载体；或自复制RNA分子)，其中每个调节序列编码多个调节基因。在涉及自复制RNA分子的实施方案中，调节序列可以有效连接至复制酶。调节序列可以是免疫调节的，即能够调节免疫细胞，例如通过编码结合至免疫细胞表面以动员和/或激活免疫细胞的免疫调节蛋白。调节序列(例如，免疫调节序列)可以是单顺反子或多顺反子(即，双顺反子、三顺反子等)的。免疫调节序列包括一个或多个免疫调节蛋白编码基因，其编码可结合多种免疫细胞的肽和蛋白，例如树突细胞化学引诱剂编码基因、树突细胞生长因子编码基因和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因。

在一些情况下，免疫调节蛋白结合至抗原呈递细胞(例如，交叉呈递的抗原呈递细胞，例如专职抗原呈递细胞，例如树突细胞(例如，常规树突细胞(例如，cDC1或cDC2)或浆细胞样DC(例如，pDC))))并通过其发出信号。此类抗原呈递细胞结合性免疫调节蛋白包括树突细胞化学引诱剂，例如XCL1、XCL2、CCL5或CCL4。因此，在本发明的一些情况下，免疫调节序列包括XCL1编码基因(例如，编码与SEQ ID NO:10具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、或100％同一性的氨基酸序列的基因；和/或与SEQ ID NO:9或9A具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的基因)、XCL2编码基因(例如，编码与SEQID NO:12具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、或100％同一性的氨基酸序列的基因；和/或与SEQ ID NO:11或11A具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的基因)、CCL5编码基因(例如，编码与SEQ ID NO:14具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、或100％同一性的氨基酸序列的基因；和/或与SEQ ID NO:13或13A具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的基因)或CCL4编码基因(例如，编码与SEQ ID NO:16具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、或100％同一性的氨基酸序列的基因；和/或与SEQ ID NO:15或15A具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的基因)。抗原呈递细胞结合性免疫调节蛋白还包括树突细胞生长因子和激活剂，例如FLT3L(例如，可溶性FLT3L(sFLT3L))、GM-CSF、CD40或CD40L)。因此，在本发明的一些情况下，免疫调节序列包括FLT3L编码基因(例如，sFLT3L编码基因(例如，编码与SEQID NO:18具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、或100％同一性的氨基酸序列的基因；和/或与SEQ ID NO:17或17A具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的基因))。在其他情况下，免疫调节序列包括GM-CSF编码基因(例如，编码与SEQ IDNO:20具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、或100％同一性的氨基酸序列的基因；和/或与SEQ ID NO:19或19A具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的基因)。在其他情况下，免疫调节序列包括CD40L编码基因(例如，编码与SEQ ID NO:22具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、或100％同一性的氨基酸序列的基因；和/或与SEQ ID NO:21或21A具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的基因)。在一些情况下，核酸载体的特征在于驱动免疫调节序列中多个基因表达的单个启动子(例如，单个启动子驱动树突细胞化学引诱剂编码基因、树突细胞生长因子或激活剂编码基因和/或淋巴细胞信号传导蛋白编码基因的表达)。在其他实施方案中，核酸载体包括驱动免疫调节序列中每个基因的启动子(例如，第一、第二和第三启动子分别驱动树突细胞化学引诱剂编码基因、树突细胞生长因子或激活剂编码基因和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因的表达)。

在一些情况下，免疫调节序列包括树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)和树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如FLT3L编码基因(例如sFLT3L编码基因)、GMCSF编码基因或CD40L编码基因)。在某些实施方案中，此类免疫调节序列包括不多于两个基因。在一些实施方案中，免疫调节序列具有多个转录单元并且包括树突细胞化学引诱剂编码基因5'的第一启动子和树突细胞生长因子或激活剂编码基因5'的第二启动子。在其他实施方案中，免疫调节序列是双顺反子的并且包括树突细胞化学引诱剂编码基因和树突细胞生长因子或激活剂编码基因5'的单个启动子。

免疫调节蛋白还可以与淋巴细胞(例如T细胞、NK细胞或B细胞)结合并通过其发出信号。在一些情况下，本发明的自复制RNA分子包括具有淋巴细胞信号传导蛋白编码基因的免疫调节序列。淋巴细胞信号传导蛋白包括细胞因子和趋化因子，并且可以在结合淋巴细胞受体后激活或刺激淋巴细胞。因此，在一些实施方案中，免疫调节序列包括淋巴细胞信号传导蛋白编码基因，例如细胞因子或趋化因子。细胞因子包括白细胞介素(IL)，例如IL-1、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21和IL-36-γ；肿瘤坏死因子，例如TNF-α或TNF-β；干扰素(IFN)，例如IFN-β、IFN-γ和IFN-α；以及其他蛋白因子，包括白血病抑制因子(LIF)和kit配体(KL)。在具体实施方案中，免疫调节序列编码的细胞因子是IL-12(例如，具有与SEQ ID NO:24具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的氨基酸序列的细胞因子；和/或与SEQ ID NO:23或23A具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的免疫调节序列)、IL-15(例如，具有与SEQ ID NO:26具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的氨基酸序列的细胞因子；和/或与SEQ ID NO:25或25A具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的免疫调节序列)、IFN-β(例如，具有与SEQ ID NO:32具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的氨基酸序列的细胞因子；和/或与SEQ ID NO:31或31A具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的免疫调节序列)或IL-36-γ(例如，具有与SEQ ID NO:36具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的氨基酸序列的细胞因子；和/或与SEQ ID NO:35或35A具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的免疫调节序列)。趋化因子包括CXCL9、CXCL10、CCL14、CCL19、CCL20、CCL21、CCL25、CCL27、CXCL12、CXCL13、CXCL-8、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5和CCL11。在一些实施方案中，由免疫调节序列编码的趋化因子是CXCL9(例如，具有与SEQ ID NO:28具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的氨基酸序列的细胞因子；和/或与SEQ ID NO:27或27A具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的免疫调节序列)或CXCL10(例如，具有与SEQ ID NO:30具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的氨基酸序列的细胞因子；和/或与SEQ ID NO:29或29A具有至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性的免疫调节序列)。

在一些情况下，免疫调节序列包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，淋巴细胞激活细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。在其他情况下，免疫调节序列包含树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如FLT3L编码基因(例如sFLT3L编码基因)、GM-CSF编码基因或CD40L编码基因)和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，淋巴细胞激活细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因)。在某些实施方案中，此类免疫调节序列包含不多于两个基因。在一些实施方案中，免疫调节序列具有多个转录单元并且包含树突细胞化学引诱剂编码基因5'的第一启动子和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因5'的第二启动子。在其他实施方案中，免疫调节序列是双顺反子的并且包含树突细胞化学引诱剂编码基因和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因5'的单个启动子。

在一些情况下，免疫调节序列包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如FLT3L编码基因(例如sFLT3L编码基因)、GMCSF编码基因或CD40L编码基因)和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如淋巴细胞激活细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因)。在一些实施方案中，免疫调节序列具有多个转录单元，并且包含树突细胞化学引诱剂编码基因5'的第一启动子、树突细胞生长因子或激活剂编码基因5'的第二启动子和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因5'的第三启动子。在其他实施方案中，免疫调节序列是三顺反子的并且包含树突细胞化学引诱剂编码基因、树突细胞生长因子或激活剂编码基因和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因5'的单个启动子。

例如，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，如图2中所示例，或三顺反子免疫调节序列，如图1所示例)可以包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如，FLT3L编码基因(例如，sFLT3L编码基因)、GM-CSF编码基因或CD40L编码基因)和IL-12编码基因。或者，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)可包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如FLT3L编码基因(例如sFLT3L编码基因)、GM-CSF编码基因或CD40L编码基因)和IL-15编码基因。或者，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)可包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如FLT3L编码基因(例如sFLT3L编码基因)、GM-CSF编码基因或CD40L编码基因)和CCL4编码基因。在其他具体实施方案中，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)可以包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如FLT3L编码基因(例如sFLT3L编码基因)、GM-CSF编码基因或CD40L编码基因)和CCL5编码基因。

在一些情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、FLT3L编码基因(例如，sFLT3L编码基因)和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，淋巴细胞激活细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因、IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。

在具体情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、FLT3L编码基因(例如sFLT3L编码基因)和淋巴细胞激活细胞因子编码基因(例如IL-12编码基因、IL-15编码基因)。或者，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、FLT3L编码基因(例如sFLT3L编码基因)和趋化因子编码基因(例如CXCL9编码基因或CXCL10编码基因)。在一些情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、FLT3L编码基因(例如，sFLT3L编码基因)和IL-12编码基因。在其他情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、FLT3L编码基因(例如sFLT3L编码基因)和IL-15编码基因。在其他情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、FLT3L编码基因(例如sFLT3L编码基因)和CXCL9编码基因。在可选的情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、FLT3L编码基因(例如sFLT3L编码基因)和CXCL10编码基因。

在具体情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含XCL1编码基因、FLT3L编码基因(例如，sFLT3L编码基因)和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，淋巴细胞激活细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因、IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。在一些情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含XCL1编码基因、FLT3L编码基因(例如，sFLT3L编码基因)和IL-12编码基因。在其他情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含XCL1编码基因、FLT3L编码基因(例如，sFLT3L编码基因)和IL-15编码基因。在其他情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含XCL1编码基因、FLT3L编码基因(例如，sFLT3L编码基因)和CXCL9编码基因。在可选的情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含XCL1编码基因、FLT3L编码基因(例如，sFLT3L编码基因)和CXCL10编码基因。

在具体情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含XCL2编码基因、FLT3L编码基因(例如，sFLT3L编码基因)和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，淋巴细胞激活细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因、IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。在一些情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含XCL2编码基因、FLT3L编码基因(例如，sFLT3L编码基因)和IL-12编码基因。在其他情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含XCL2编码基因、FLT3L编码基因(例如，sFLT3L编码基因)和IL-15编码基因。在其他情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含XCL2编码基因、FLT3L编码基因(例如，sFLT3L编码基因)和CXCL9编码基因。在可选的情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含XCL2编码基因、FLT3L编码基因(例如，sFLT3L编码基因)和CXCL10编码基因。

在具体情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含CCL4编码基因、FLT3L编码基因(例如，sFLT3L编码基因)和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，淋巴细胞激活细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因、IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。在一些情况下，免疫调节序列包含CCL4编码基因、FLT3L编码基因(例如sFLT3L编码基因)和IL-12编码基因。在其他情况下，免疫调节序列包含CCL4编码基因、FLT3L编码基因(例如sFLT3L编码基因)和IL-15编码基因。在其他情况下，免疫调节序列包含CCL4编码基因、FLT3L编码基因(例如sFLT3L编码基因)和CXCL9编码基因。在可选的情况下，免疫调节序列包含CCL4编码基因、FLT3L编码基因(例如sFLT3L编码基因)和CXCL10编码基因。

在具体情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含CCL5编码基因、FLT3L编码基因(例如，sFLT3L编码基因)和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，淋巴细胞激活细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因、IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。在一些情况下，免疫调节序列包含CCL5编码基因、FLT3L编码基因(例如sFLT3L编码基因)和IL-12编码基因。在其他情况下，免疫调节序列包含CCL5编码基因、FLT3L编码基因(例如sFLT3L编码基因)和IL-15编码基因。在其他情况下，免疫调节序列包含CCL5编码基因、FLT3L编码基因(例如sFLT3L编码基因)和CXCL9编码基因。在可选的情况下，免疫调节序列包含CCL5编码基因、FLT3L编码基因(例如sFLT3L编码基因)和CXCL10编码基因。

在一些情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、GM-CSF编码基因和淋巴细胞激活细胞因子编码基因(例如IL-12编码基因、IL-15编码基因)。或者，免疫调节序列包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、GM-CSF编码基因和趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因)。在一些情况下，免疫调节序列包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、GM-CSF编码基因和IL-12编码基因。在其他情况下，免疫调节序列包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、GM-CSF编码基因和IL-15编码基因。在其他情况下，免疫调节序列包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、GM-CSF编码基因和CXCL9编码基因。在可选的情况下，免疫调节序列包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、GM-CSF编码基因和CXCL10编码基因。

在具体情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含XCL1编码基因、GM-CSF编码基因和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，淋巴细胞激活细胞因子编码基因(例如IL-12编码基因、IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。在一些情况下，免疫调节序列包含XCL1编码基因、GM-CSF编码基因和IL-12编码基因。在其他情况下，免疫调节序列包含XCL1编码基因、GM-CSF编码基因和IL-15编码基因。在其他情况下，免疫调节序列包含XCL1编码基因、GM-CSF编码基因和CXCL9编码基因。在可选的情况下，免疫调节序列包含XCL1编码基因、GM-CSF编码基因和CXCL10编码基因。

在具体情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含XCL2编码基因、GM-CSF编码基因和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，淋巴细胞激活细胞因子编码基因(例如IL-12编码基因、IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。在一些情况下，免疫调节序列包含XCL2编码基因、GM-CSF编码基因和IL-12编码基因。在其他情况下，免疫调节序列包含XCL2编码基因、GM-CSF编码基因和IL-15编码基因。在其他情况下，免疫调节序列包含XCL2编码基因、GM-CSF编码基因和CXCL9编码基因。在可选的情况下，免疫调节序列包含XCL2编码基因、GM-CSF编码基因和CXCL10编码基因。

在具体情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含CCL4编码基因、GM-CSF编码基因和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，淋巴细胞激活细胞因子编码基因(例如IL-12编码基因、IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。在一些情况下，免疫调节序列包含CCL4编码基因、GM-CSF编码基因和IL-12编码基因。在其他情况下，免疫调节序列包含CCL4编码基因、GM-CSF编码基因和IL-15编码基因。在其他情况下，免疫调节序列包含CCL4编码基因、GM-CSF编码基因和CXCL9编码基因。在可选的情况下，免疫调节序列包含CCL4编码基因、GM-CSF编码基因和CXCL10编码基因。

在具体情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含CCL5编码基因、GM-CSF编码基因和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，淋巴细胞激活细胞因子编码基因(例如IL-12编码基因、IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。在一些情况下，免疫调节序列包含CCL5编码基因、GM-CSF编码基因和IL-12编码基因。在其他情况下，免疫调节序列包含CCL5编码基因、GM-CSF编码基因和IL-15编码基因。在其他情况下，免疫调节序列包含CCL5编码基因、GM-CSF编码基因和CXCL9编码基因。在可选的情况下，免疫调节序列包含CCL5编码基因、GM-CSF编码基因和CXCL10编码基因。

在一些情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、CD40L编码基因和淋巴细胞激活细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因、IL-15编码基因)。或者，免疫调节序列包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、CD40L编码基因和趋化因子编码基因(例如CXCL9编码基因或CXCL10编码基因)。在一些情况下，免疫调节序列包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、CD40L编码基因和IL-12编码基因。在其他情况下，免疫调节序列包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、CD40L编码基因和IL-15编码基因。在其他情况下，免疫调节序列包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、CD40L编码基因和CXCL9编码基因。在可选的情况下，免疫调节序列包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、CD40L编码基因和CXCL10编码基因。

在具体情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含XCL1编码基因、CD40L编码基因和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，淋巴细胞激活细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因、IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。在一些情况下，免疫调节序列包含XCL1编码基因、CD40L编码基因和IL-12编码基因。在其他情况下，免疫调节序列包含XCL1编码基因、CD40L编码基因和IL-15编码基因。在其他情况下，免疫调节序列包含XCL1编码基因、CD40L编码基因和CXCL9编码基因。在可选的情况下，免疫调节序列包含XCL1编码基因、CD40L编码基因和CXCL10编码基因。

在具体情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含XCL2编码基因、CD40L编码基因和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，淋巴细胞激活细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因、IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。在一些情况下，免疫调节序列包含XCL2编码基因、CD40L编码基因和IL-12编码基因。在其他情况下，免疫调节序列包含XCL2编码基因、CD40L编码基因和IL-15编码基因。在其他情况下，免疫调节序列包含XCL2编码基因、CD40L编码基因和CXCL9编码基因。在可选的情况下，免疫调节序列包含XCL2编码基因、CD40L编码基因和CXCL10编码基因。

在具体情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含CCL4编码基因、CD40L编码基因和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，淋巴细胞激活细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因、IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。在一些情况下，免疫调节序列包含CCL4编码基因、CD40L编码基因和IL-12编码基因。在其他情况下，免疫调节序列包含CCL4编码基因、CD40L编码基因和IL-15编码基因。在其他情况下，免疫调节序列包含CCL4编码基因、CD40L编码基因和CXCL9编码基因。在可选的情况下，免疫调节序列包含CCL4编码基因、CD40L编码基因和CXCL10编码基因。

在具体情况下，免疫调节序列(例如，具有三个转录单元的免疫调节序列，或三顺反子免疫调节序列)包含CCL5编码基因、CD40L编码基因和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，淋巴细胞激活细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因、IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。在一些情况下，免疫调节序列包含CCL5编码基因、CD40L编码基因和IL-12编码基因。在其他情况下，免疫调节序列包含CCL5编码基因、CD40L编码基因和IL-15编码基因。在其他情况下，免疫调节序列包含CCL5编码基因、CD40L编码基因和CXCL9编码基因。在可选的情况下，免疫调节序列包含CCL5编码基因、CD40L编码基因和CXCL10编码基因。

在具体实施方案中，免疫调节序列具有三个转录单元，其中第一启动子位于XCL1编码基因的5'，第二启动子位于sFLT3L编码基因的5'，并且第三启动子位于IL-12编码基因的5'。在可选的实施方案中，免疫调节序列是三顺反子的，其中单个启动子位于XCL1编码基因、sFLT3L编码基因和IL-12编码基因的5'。

在具体实施方案中，免疫调节序列具有三个转录单元，其中第一启动子位于XCL1编码基因的5'，第二启动子位于sFLT3L编码基因的5'，并且第三启动子位于IL-15编码基因的5'。在可选的实施方案中，免疫调节序列是三顺反子的，其中单个启动子位于XCL1编码基因、sFLT3L编码基因和IL-15编码基因的5'。

或者，在一些情况下，免疫调节序列具有三个转录单元，其中第一启动子位于XCL1编码基因的5'，第二启动子位于GM-CSF编码基因的5'，并且第三启动子位于IL-12编码基因的5'。在可选的实施方案中，免疫调节序列是三顺反子的，其中单个启动子位于XCL1编码基因、GM-CSF编码基因和IL-12编码基因的5'。

在具体实施方案中，免疫调节序列具有三个转录单元，其中第一启动子位于XCL1编码基因的5'，第二启动子位于GM-CSF编码基因的5'，并且第三启动子位于IL-15编码基因的5'。在可选的实施方案中，免疫调节序列是三顺反子的，其中单个启动子位于XCL1编码基因、GM-CSF编码基因和IL-15编码基因的5'。

在任何前述核酸载体(例如环状DNA载体)的一些实施方案中，免疫调节序列包含以5'至3'方向有效连接的树突细胞化学引诱剂编码基因、树突细胞生长因子或激活剂编码基因和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，复制酶编码序列、树突细胞化学引诱剂编码基因、树突细胞生长因子或激活剂编码基因和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因)。在其他实施方案中，免疫调节序列包含以5'至3'方向有效连接的树突细胞生长因子或激活剂编码基因、树突细胞化学引诱剂编码基因和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，复制酶编码序列、树突细胞生长因子或激活剂编码基因、树突细胞化学引诱剂编码基因和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因)。在其他实施方案中，免疫调节序列包含以5'至3'方向有效连接的树突细胞化学引诱剂编码基因、淋巴细胞信号传导蛋白编码基因和树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如，复制酶编码序列、树突细胞化学引诱剂编码基因、淋巴细胞信号传导蛋白编码基因和树突细胞生长因子或激活剂编码基因)。在其他实施方案中，免疫调节序列包含以5'至3'方向有效连接的树突细胞生长因子或激活剂编码基因、淋巴细胞信号传导蛋白编码基因和树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，复制酶编码序列、树突细胞生长因子或激活剂编码基因、淋巴细胞信号传导蛋白编码基因和树突细胞化学引诱剂编码基因)。在其他实施方案中，免疫调节序列包含以5'至3'方向有效连接的淋巴细胞信号传导蛋白编码基因、树突细胞化学引诱剂编码基因和树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如，复制酶编码序列、淋巴细胞信号传导蛋白编码基因、树突细胞化学引诱剂编码基因和树突细胞生长因子或激活剂编码基因)。在其他实施方案中，免疫调节序列包含以5'至3'方向有效连接的淋巴细胞信号传导蛋白编码基因、树突细胞生长因子或激活剂编码基因和树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，复制酶编码序列、淋巴细胞信号传导蛋白编码基因、树突细胞生长因子或激活剂编码基因和树突细胞化学引诱剂编码基因)。

在具体实施方案中，免疫调节序列编码与SEQ ID NO:34具有至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或100％同一性的氨基酸序列。另外或可选地，在一些实施方案中，免疫调节序列包含与SEQ ID NO:33或33A具有至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性或100％同一性的核酸序列。

在任何上述本发明实施方案的某些情况下，三顺反子免疫调节序列包含不多于三个基因。

本文所述的任何自复制RNA分子的异源基因可以编码本文所述的任何蛋白(例如，树突细胞化学引诱剂、树突细胞生长因子或激活剂、和/或淋巴细胞信号传导蛋白)的功能等效片段或其变体。由本发明的自复制RNA分子编码的蛋白或其变体的片段可以包含与参考氨基酸序列(各个天然存在的全长蛋白或其变体的氨基酸序列)具有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性(例如，至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％序列同一性)的氨基酸序列。

在免疫调节序列中有用的其他免疫调节蛋白编码基因包括编码其他细胞因子、趋化因子和生长因子的基因。可用作本发明一部分的其他细胞因子包括TNFα、IFN-γ、IFN-α、TGF-β、IL-1、IL-2、IL-4、IL-10、IL-13、IL-17和IL-18。可用作本发明一部分的趋化因子的非限制性实例包括CCL14、CCL19、CCL20、CCL21、CCL25、CCL27、CXCL12、CXCL13、CXCL-8、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL11和CXCL10。生长因子的非限制性实例包括肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、自分泌运动因子、骨形态发生蛋白(BMP)、睫状神经营养因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、巨噬细胞集落刺激因子(m-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、表皮生长因子(EGF)、肝配蛋白A1(ephrin A1)、肝配蛋白A2、肝配蛋白A3、肝配蛋白A4、肝配蛋白A5、肝配蛋白B1、肝配蛋白B2、肝配蛋白B3、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子1(FGF1)、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、胎牛生长激素(FBS)、神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、神经秩蛋白(neurturin)、persephin、神经鞘胚素(artemin)、生长分化因子-9(GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝癌源性生长因子(HDGF)、胰岛素、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、白细胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、角质细胞生长因子(KGF)、迁移刺激因子(MSF)、巨噬细胞刺激蛋白(MSP)、肌生长抑制素(myostatin)(GDF-8)、神经调节蛋白1(NRG1)、NRG2、NRG3、NRG4、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养蛋白-3(NT-3)、NT-4、胎盘生长因子(PGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、肾酶(RNLS)、T细胞生长因子(TCGF)、促血小板生成素(TPO)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和血管内皮生长因子(VEGF)。

在本文所述的任何多顺反子核酸载体(例如DNA载体，例如环状DNA载体)中，在蛋白编码区之间可以设计切割位点。例如，弗林蛋白酶-P2A位点可以分隔本文所述的任何蛋白编码基因。还可以将核酶整合到自复制RNA分子中，以切割蛋白编码基因下游的位点。在一些实施方案中，T2A、E2A、F2A或任何其他合适的自切割位点(例如，病毒衍生的切割位点)可以隔开本文所述的任何蛋白编码基因。

环状DNA载体

本发明的一些实施方案涉及环状DNA载体(例如，具有多个转录单元的环状DNA载体，每个转录单元编码免疫调节基因；具有编码多个免疫调节基因的单个转录单元的环状DNA载体；以及编码自复制RNA分子的环状DNA载体，该自复制RNA分子编码复制酶和一种或多种免疫调节基因)。在一些情况下，可用于编码本文所述的免疫调节序列的环状DNA载体可以是质粒DNA载体。在本发明的具体情况下，环状DNA载体不同于常规质粒DNA载体，因为它们缺乏质粒骨架元件(例如，细菌元件，例如(i)细菌复制起点和/或(ii)耐药基因)。在一些实施方案中，本文所述的环状DNA载体(例如，编码本文所述的任何自复制RNA分子的DNA载体)缺乏重组位点(例如，通过无细胞过程产生的合成环状DNA载体)。在可选的实施方案中，本文所述的环状DNA载体(例如，编码本文所述的任何自复制RNA分子)包括重组位点(例如，微环DNA载体)。

本发明的环状DNA载体可以包括有效连接至自复制RNA分子编码序列5'的启动子。如果启动子能够影响自复制RNA分子编码序列的转录，则该启动子有效连接至该自复制RNA分子编码序列。可用作环状DNA载体的一部分的启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、天然启动子和组织特异性启动子。组成型启动子的实例包括巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1a启动子。在本发明的具体实施方案中，环状DNA载体包括CMV启动子。在一些实施方案中，环状DNA载体包含CAG启动子。

或者，本发明的环状DNA载体包括诱导型启动子。诱导型启动子允许调节基因表达，并且可以通过外源提供的化合物、环境因素(例如温度)或存在特定生理状态如急性期(细胞的一种特定分化状态)或仅在复制细胞中来调节。诱导型启动子和诱导型系统可从多种商业来源获得。许多其他系统已有描述并且可以由本领域技术人员容易地选择。由外源提供的启动子调节的诱导型启动子的实例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒启动子、T7聚合酶启动子系统、蜕皮激素昆虫启动子、四环素抑制型系统、四环素诱导型系统、RU486诱导型系统和雷帕霉素诱导型系统。可用于本文的其他类型的诱导型启动子是那些受特定生理状态(例如温度、急性期(细胞的一种特定分化状态))或仅在复制细胞中调节的启动子。

本发明的环状DNA载体还可以包括在自复制RNA分子编码序列3'的聚腺苷酸化序列。有用的聚腺苷酸化序列包括大于20nt(例如，大于25nt、大于30nt、大于35nt、大于40nt、大于50nt、大于60nt、大于70nt、或大于80nt，例如20至100nt、30至100nt、40至100nt、50至100nt、60至100nt、70至100nt、80至100nt、100至200nt、200至300nt、或300至400nt或更大)的延长的聚腺苷酸化序列。

缺乏细菌元件(例如DNA复制起点和/或耐药基因)的环状DNA载体可以在个体中比常规DNA载体(例如质粒)持续更长时间并且比裸RNA持续更长时间。在涉及自复制RNA的某些实施方案中，环状DNA载体赋予其中编码的自复制RNA分子增强的稳定性。

环状DNA载体可以有各种大小和形状。编码本发明的自复制RNA分子的环状DNA载体的长度可以是5kb至20kb(例如，长度为6kb至18kb、7kb至16kb、8kb至14kb或9kb至12kb，例如长度为5kb至6kb、6kb至7kb、7kb至8kb、8kb至9kb、9kb至10kb、10kb至11kb、11kb至12kb、12kb至13kb、13kb至14kb、14kb至15kb、15kb至16kb、16kb至18kb或18kb至20kb，例如长度为约5kb、约6kb、约7kb、约8kb、约9kb、约10kb、约10.5kb、约11kb、约11.5kb、约12kb、约12.5kb、约13kb、约14kb、约15kb、约16kb、约17kb、约18kb、约19kb或约20kb)。

可用作本发明一部分的环状DNA载体可以通过本领域已知的和本文所述的各种方法容易地合成。例如，可以使用体外(无细胞)方法制备缺乏质粒骨架元件(例如，细菌元件，例如(i)细菌复制起点和/或(ii)耐药基因)的环状DNA载体，相对于基于细菌的方法，体外(无细胞)方法可以提供更纯的组合物。此类体外合成方法可包括使用噬菌体聚合酶，例如Phi29聚合酶，作为使用例如滚环扩增的复制工具。环状DNA载体体外合成的具体方法进一步描述于国际专利公开WO 2019/178500中，其通过引用并入本文。

自复制RNA分子和编码它们的DNA载体

本文提供了可用作调节治疗例如免疫调节治疗的自复制RNA分子。在递送到脊椎动物细胞后，自复制RNA分子可以通过自身转录(经由从自身生成的反义拷贝)产生多个子RNA。在一些情况下，自复制RNA分子是正链分子，在递送至细胞后可以直接被翻译，并且该翻译产生复制酶，然后复制酶从递送的RNA产生反义和正义转录物。因此，递送的RNA导致多个子RNA的产生。这些子RNA以及亚基因组转录物可以被翻译以提供编码蛋白(例如调节蛋白，例如免疫调节蛋白)的原位表达，或者可以被转录以提供与被递送的RNA具有相同意义的其他转录物，其被翻译以提供调节蛋白的原位表达。该转录序列的总体结果是自复制RNA分子数量的扩增，并且编码的调节蛋白可以成为靶细胞(例如，肿瘤细胞和/或肿瘤驻留细胞)的主要多肽产物。

在一些情况下，任何上述DNA载体(例如，环状DNA载体)编码含有调节序列的自复制RNA分子。此类自复制RNA分子包括源自甲病毒的复制酶序列，这些复制酶序列的特征在于具有正链复制子，其在递送至靶细胞后被翻译成复制酶(或复制酶-转录酶)。复制酶被翻译为多蛋白，该多蛋白自切割而产生复制复合物，该复制复合物产生正链所递送的RNA的基因组负链拷贝。这些负链转录物本身可以被转录以提供正链亲本RNA的进一步拷贝并且还产生亚基因组转录物(例如调节序列)。因此，亚基因组转录物的翻译导致被感染细胞原位表达调节蛋白。

可以衍生本发明的复制酶编码序列的甲病毒的非限制性实例包括委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus，VEE)、塞姆利基森林病毒(SemlikiForest virus，SF)、辛德比斯病毒(Sindbis virus，SIN)、东方马脑炎病毒(EasternEquine Encephalitis virus，EEE)、西方马脑炎病毒(Western equine encephalitisvirus，WEE)、埃弗格莱兹病毒(Everglades virus，EVE)、穆坎博病毒(Mucambo virus，MUC)、皮库纳病毒(Pixuna virus，PIX)、塞姆利基森林病毒(SF)、米德尔堡病毒(Middelburg virus，MID)、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIK)、奥尼永-尼永病毒(O'Nyong-Nyong virus，ONN)、罗斯河病毒(Ross River virus，RR)、巴马森林病毒(BarmahForest virus，BF)、盖塔病毒(Getah virus，GET)、鹭山病毒(Sagiyama virus，SAG)、贝巴鲁病毒(Bebaru virus，BEB)、马亚罗病毒(Mayaro virus，MAY)、乌纳病毒(Una virus，UNA)、奥拉病毒(Aura virus，AURA)、巴班基病毒(Babanki virus，BAB)、高地J病毒(Highlands J virus，HJ)和摩根堡病毒(Fort Morgan virus，FM)。在本发明的具体实例中，自复制RNA分子包含VEE复制酶或其变体。在一些实施方案中，自复制RNA分子包含SEQID NO：1或1A的复制酶编码序列。在一些实施方案中，自复制RNA分子包含复制酶编码序列，所述复制酶编码序列包含与SEQ ID NO:1或1A至少95％同一(例如与SEQ ID NO:1或1A至少96％、至少97％、至少98％或至少99％(例如，至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％同一)的核酸序列。在一些实施方案中，自复制RNA分子包含复制酶编码序列，所述复制酶编码序列包含与SEQ ID NO:3或3A至少95％同一(例如与SEQ ID NO:3或3A至少96％、至少97％、至少98％或至少99％(例如，至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％同一)的核酸序列。在一些实施方案中，自复制RNA分子包含复制酶编码序列，所述复制酶编码序列包含与SEQ ID NO:5或5A至少95％同一(例如与SEQ ID NO:5或5A至少96％、至少97％、至少98％或至少99％(例如，至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％同一)的核酸序列。在一些实施方案中，自复制RNA分子包含复制酶编码序列，所述复制酶编码序列包含与SEQ ID NO:7或7A至少95％同一(例如与SEQ ID NO:7或7A至少96％、至少97％、至少98％或至少99％(例如，至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％同一)的核酸序列。在一些实施方案中，自复制RNA分子包含复制酶编码序列，所述复制酶编码序列包含与SEQ ID NO:1或1A至少95％同一(与SEQ ID NO:1或1A至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的第一核酸序列、与SEQ ID NO:3或3A至少95％同一(与SEQ ID NO:3或3A至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的第二核酸序列、与SEQ ID NO:5或5A至少95％同一(与SEQ ID NO:5或5A至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的第三核酸序列、以及与SEQ ID NO:7或7A至少95％同一(与SEQ ID NO:7或7A至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的第四核酸序列。在一些实施方案中，自复制RNA分子包含含有SEQ ID NO：1、1A、3、3A、5、5A、7和7A的核酸序列。在一些实施方案中，复制酶编码序列编码与SEQ ID NO:2至少95％同一(例如与SEQ ID NO:2至少96％、至少97％、至少98％或至少99％(例如，至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％)同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，复制酶编码序列编码与SEQ ID NO:4至少95％同一(例如与SEQ ID NO:4至少96％、至少97％、至少98％或至少99％(例如，至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％)同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，复制酶编码序列编码与SEQ ID NO:6至少95％同一(例如与SEQID NO:6至少96％、至少97％、至少98％或至少99％(例如，至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％)同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，复制酶编码序列编码与SEQ ID NO:8至少95％同一(例如与SEQ ID NO:8至少96％、至少97％、至少98％或至少99％(例如，至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％或至少99.9％)同一)的氨基酸序列。在一些实施方案中，复制酶编码序列编码与SEQ ID NO:2至少95％同一(例如与SEQ ID NO:2至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的第一氨基酸序列、与SEQ ID NO:4至少95％同一(例如与SEQ ID NO:4至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的第二氨基酸序列、与SEQ ID NO:6至少95％同一(例如与SEQ ID NO:6至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的第三氨基酸序列和与SEQ ID NO:8至少95％同一(例如与SEQ ID NO:8至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一)的第四氨基酸序列。在一些实施方案中，复制酶编码序列编码包含SEQID NO:2、4、6和8的氨基酸序列。

可以使用突变型或野生型病毒序列。例如，在一些情况下，自复制RNA包括VEE复制酶的减弱的TC83突变体。本文包括复制酶中的其他突变，包括通过体外进化方法(例如，如Yingzhong等人,Sci Rep.2019,9:6932教导的，其方法通过引用并入本文)获得的复制酶突变的复制酶(例如突变的VEE复制酶)。

在一些情况下，自复制RNA分子包括(i)复制酶编码序列(例如，编码可从自复制RNA分子转录RNA的RNA依赖性RNA聚合酶的RNA序列)和(ii)异源调节基因。聚合酶可以是甲病毒复制酶，例如包含一种、两种、三种或全部四种甲病毒非结构蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4的甲病毒复制酶。在一些情况下，聚合酶是VEE复制酶，例如包含一种、两种、三种或全部四种甲病毒非结构蛋白nsP1、nsP2、nsP3和nsP4的VEE复制酶。

在本发明的一些情况下，自复制RNA分子不编码甲病毒结构蛋白(例如衣壳蛋白)。这样的自复制RNA可以在细胞中产生其自身的基因组RNA拷贝，但不会产生含有RNA的病毒颗粒。无法产生这些病毒颗粒意味着，与野生型甲病毒不同，自复制RNA分子无法以传染性形式使其自身长存。甲病毒结构蛋白可以被编码目标异源调节蛋白的基因替代，使得亚基因组转录物编码异源调节蛋白而不是结构性甲病毒病毒颗粒蛋白。

因此，在一些情况下，本发明的自复制RNA分子可以具有两个开放阅读框。第一(5')开放阅读框编码复制酶；第二(3')开放阅读框编码一种或多种(例如两种或三种)异源调节蛋白(例如本文所述的任何免疫调节蛋白或其组合)。在一些实施方案中，RNA可以具有额外的(例如下游)开放阅读框，例如以编码进一步的异源基因或编码辅助多肽。

合适的自复制RNA分子可以具有不同的长度。在本发明的一些实施方案中，自复制RNA分子的长度为5,000至50,000个核苷酸(即，5kb至50kb)。在一些情况下，自复制RNA分子的长度为5kb至20kb(例如，长度为6kb至18kb、7kb至16kb、8kb至14kb或9kb至12kb，例如长度为5kb至6kb、6kb至7kb、7kb至8kb、8kb至9kb、9kb至10kb、10kb至11kb、11kb至12kb、12kb至13kb、13kb至14kb、14kb至15kb、15kb至16kb、16kb至18kb或18kb至20kb，例如长度为约5kb、约6kb、约7kb、约8kb、约9kb、约10kb、约10.5kb、约11kb、约11.5kb、约12kb、约12.5kb、约13kb、约14kb、约15kb、约16kb、约17kb、约18kb、约19kb或约20kb)。

自复制RNA分子可具有3'poly-A尾。另外，自复制RNA分子可包括poly-A聚合酶识别序列(例如，AAUAAA)。

自复制RNA分子可以通过本领域已知的或本文所述的任何方法来制备，例如通过体外转录(IVT)。IVT可以使用在细菌中以质粒形式产生和繁殖的(cDNA)模板或合成产生的(例如通过基因合成和/或聚合酶链反应(PCR)工程方法)。例如，DNA依赖性RNA聚合酶(例如噬菌体T7、T3或SP6 RNA聚合酶)可用于从DNA模板转录RNA。可以根据需要使用适当的加帽和poly-A添加反应(尽管复制子的poly-A通常在DNA模板内编码)。这些RNA聚合酶可能对转录的5'核苷酸有严格的要求，并且在一些实施方案中，这些要求必须与编码的复制酶的要求相匹配，以确保IVT转录的RNA可以作为其自编码复制酶的底物有效地发挥作用。

在一些情况下，自复制RNA可以包括(除了任何5'帽结构之外)一种或多种具有修饰核碱基的核苷酸。例如，自复制RNA分子可以包括m5C(5-甲基胞苷)、m5U(5-甲基尿苷)、m6A(N-6-甲基腺苷)、s2U(2-硫尿苷)、Um(2'-O-甲基尿苷)、m1A(1-甲基腺苷)、m2A(2-甲基腺苷)、Am(2'-β-甲基腺苷)、ms2m6A(2-甲硫基-N-6-甲基腺苷)、i6A(N-6-异戊烯基腺苷)、ms2i6A(2-甲硫基-N6异戊烯基腺苷)、io6A(N-6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷)、ms2io6A(2-甲硫基-N-6-(顺式羟基异戊烯基)腺苷)、g6A(N-6-甘氨酰氨基甲酰腺苷)、t6A(N-6-苏氨酰氨基甲酰腺苷)、ms2t6A(2-甲硫基-N-6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷)、m6t6A(N-6-甲基-N-6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷)、hn6A(N6-羟基正戊酰氨基甲酰腺苷)、ms2hn6A(2-甲硫基-N-6-羟基正戊酰氨基甲酰基腺苷)、Ar(p)(2'-O-核糖腺苷(磷酸))、I(肌苷)、m11(1-甲基肌苷)、m'Im(1,2'-O-二甲基肌苷)、m3C(3-甲基胞苷)、Cm(2T-O-甲基胞苷)、s2C(2-硫胞苷)、ac4C(N-4-乙酰胞苷)、f5C(5-甲酰胞苷)、m5Cm(5,2-O-二甲基胞苷)、ac4Cm(N4乙酰基2TO甲基胞苷)、k2C(赖氨酸)、m1G(1-甲基鸟苷)、m2G(N2-甲基鸟苷)、m7G(7-甲基鸟苷)、Gm(2'-O-甲基鸟苷)、m22G(N2,N2-二甲基鸟苷)、m2Gm(N2,2'-O-二甲基鸟苷)、m22Gm(N2,N2,2'-β-三甲基鸟苷)、Gr(p)(2'-O-核糖基鸟苷(磷酸盐))、yW(怀丁苷)、o2yW(过氧怀丁苷)、OHyW(羟基怀丁苷)、OHyW*(未修饰的羟基怀丁苷)、imG(怀俄苷)、mimG(甲基鸟苷)、Q(辫苷)、oQ(环氧辫苷)、galQ(半乳糖基-辫苷)、manQ(甘露糖基-辫苷)、preQo(7-氰基-7-脱氮鸟苷)、preQi(7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷)、G(古嘌苷)、D(二氢尿苷)、m5Um(5,2'-O-二甲基尿苷)、s4U(4-硫尿苷)、m5s2U(5-甲基-2-硫尿苷)、s2Um(2-硫代-2'-O-甲基尿苷)、acp3U(3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷)、ho5U(5-羟基尿苷)、mo5U(5-甲氧基尿苷)、cmo5U(尿苷5-氧乙酸)、mcmo5U(尿苷5-氧乙酸甲酯)、chm5U(5-(羧羟甲基)尿苷))、mchm5U(5-(羧基羟甲基)尿苷甲酯)、mcm5U(5-甲氧基羰基甲基尿苷)、mcm5Um(S-甲氧基羰基甲基-2-O-甲基尿苷)、mcm5s2U(5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿苷)、nm5s2U(5-氨甲基-2-硫尿苷)、mnm5U(5-甲基氨基甲基尿苷)、mnm5s2U(5-甲基氨基甲基-2-硫尿苷)、mnm5se2U(5-甲基氨基甲基-2-硒尿苷)、ncm5U(5-氨基甲酰基甲基尿苷)、ncm5Um(5-氨基甲酰基甲基-2'-O-甲基尿苷)、cmnm5U(5-羧甲基氨基甲基尿苷)、cnmm5Um(5-羧甲基氨基甲基-2-L-O甲基尿苷)、cmnm5s2U(5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷)、m62A(N6,N6-二甲基腺苷)、Tm(2'-O-甲基肌苷)、m4C(N-4-甲基胞苷)、m4Cm(N4,2-O-二甲基胞苷)、hm5C(5-羟甲基胞苷)、m3U(3-甲基尿苷)、cm5U(5-羧甲基尿苷)、m6 Am(N6,T-O-二甲基腺苷)、rn62 Am(N6,N6,O-2-三甲基腺苷)、m2'7G(N2,7-二甲基鸟苷)、m2'2'7G(N2,N2,7-三甲基鸟苷)、m3Um(3,2T-O-二甲基尿苷)、m5D(5-甲基二氢尿苷)、f5Cm(5-甲酰基-2'-O-甲基胞苷)、m1Gm(1,2'-O-二甲基鸟苷)、m'Am(1,2-O-二甲基腺苷)亚氨基甲基尿苷)((1,2-O-dimethyl adenosine)irinomethyluridine))、tm5s2U(S-牛磺酸甲基-2-硫尿苷)、imG-14(4-去甲基鸟苷)、imG2(异鸟苷)、或ac6A(N-6-乙酰腺苷)、次黄嘌呤、肌苷、8-氧代-腺嘌呤、其7-取代衍生物、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(C1-C6)-烷基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(C2-C6)-烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)-炔基尿嘧啶、5-(羟甲基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-(C1-C6)-烷基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-(C2-C6)-烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N2-二甲基鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮杂-7-取代的鸟嘌呤、7-脱氮杂-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤、7-脱氮杂-8-取代的鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、8-氧代鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2,4-二氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、8-氮杂嘌呤、取代的7-脱氮杂嘌呤、7-脱氮杂-7-取代的嘌呤、7-脱氮杂-8-取代的嘌呤，或脱碱基核苷酸。例如，自复制RNA分子可以包括一种或多种修饰的嘧啶核碱基，例如假尿苷和/或5-甲基胞嘧啶残基。

在本发明的其他实施方案中，自复制RNA分子基本上不含具有修饰的核酸酶的核苷酸。例如，在一些情况下，自复制RNA分子不包含修饰的核碱基，并且可以不包含修饰的核苷酸，即，RNA中的所有核苷酸都是标准的A、C、G和U核糖核苷酸(除了任何5'帽结构，其可以包括7'-甲基鸟苷)。

在一些情况下，自复制RNA仅包含核苷之间的磷酸二酯键。在一些情况下，自复制RNA包括氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和/或甲基膦酸酯键。在本文所述的任何多顺反子自复制RNA分子中，在蛋白编码区之间可以设计切割位点。

在一个具体实施方案中，本发明的RNA不编码报告分子，例如荧光素酶(luciferase)或荧光蛋白(fluorescent protein)，例如绿色荧光蛋白(GFP)。

在一些实施方案中，由自复制RNA编码的异源蛋白是本文所述的任何异源蛋白的变体。另外或可选地，由自复制RNA编码的复制酶可以是本文所述的任何复制酶的变体。在一些实施方案中，变体是功能片段(例如，与蛋白功能相似或功能等同的蛋白片段)。

药物组合物

本文提供了药物组合物，其具有在药学上可接受的载体中的本文所述的任何核酸载体(例如，环状DNA载体或自复制RNA分子)。因此，在一些情况下，本发明的药物组合物包含药学上可接受的载体中的具有免疫调节序列(例如，具有多个转录单元的免疫调节序列，或多顺反子免疫调节序列)的核酸载体(例如，环状DNA载体或自复制RNA分子)，所述免疫调节序列包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)和一个或多个免疫调节蛋白编码基因(例如，树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如FLT3L编码基因、GMCSF编码基因或CD40L编码基因)或淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。

在其他情况下，本发明的药物组合物包含一种或多种核酸载体(例如，一种或多种环状DNA载体，例如异源组合物核酸载体(例如环状DNA载体)，各自编码不同的免疫调节基因)。例如，在此类情况下，本发明的药物组合物包含药学上可接受的载体中的两种或更多种(例如，两种或三种)核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中每种载体包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如，FLT3L编码基因、GMCSF编码基因或CD40L编码基因)或淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。

在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体中的两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)或树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如，FLT3L编码基因、GMCSF编码基因或CD40L编码基因)；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。

在一些情况下，药物组合物包含药学上可接受的载体中的两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。在一些情况下，药物组合物包含药学上可接受的载体中的两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。在一些情况下，药物组合物包含药学上可接受的载体中的两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如环状DNA载体)包含IL-12编码基因。在一些情况下，药物组合物包含药学上可接受的载体中的两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含IL-15编码基因。在一些情况下，药物组合物包含药学上可接受的载体中的两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含CXCL9编码基因。在一些情况下，药物组合物包含药学上可接受的载体中的两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含CXCL10编码基因。

在一些情况下，药物组合物包含药学上可接受的载体中的两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL2编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。在一些情况下，药物组合物包含药学上可接受的载体中的两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL2编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含IL-12编码基因。在一些情况下，药物组合物包含药学上可接受的载体中的两种核酸载体(例如环状DNA载体)，其中(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL2编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含IL-15编码基因。在一些情况下，药物组合物包含药学上可接受的载体中的两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL2编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含CXCL9编码基因。在一些情况下，药物组合物包含药学上可接受的载体中的两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL2编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含CXCL10编码基因。

在一些情况下，药物组合物包含药学上可接受的载体中的两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含CCL4编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。在一些情况下，药物组合物包含药学上可接受的载体中的两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含CCL4编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如环状DNA载体)包含IL-12编码基因。在一些情况下，药物组合物包含药学上可接受的载体中的两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含CCL4编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含IL-15编码基因。在一些情况下，药物组合物包含药学上可接受的载体中的两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含CCL4编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含CXCL9编码基因。在一些情况下，药物组合物包含药学上可接受的载体中的两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含CCL4编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含CXCL10编码基因。

在一些情况下，药物组合物包含药学上可接受的载体中的两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含CCL5编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。在一些情况下，药物组合物包含药学上可接受的载体中的核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含CCL5编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如环状DNA载体)包含IL-12编码基因。在一些情况下，药物组合物包含药学上可接受的载体中的两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含CCL5编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含IL-15编码基因。在一些情况下，药物组合物包含药学上可接受的载体中的两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含CCL5编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含CXCL9编码基因。在一些情况下，药物组合物包含药学上可接受的载体中的两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含CCL5编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含CXCL10编码基因。

在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体中的两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如FLT3L编码基因、GMCSF编码基因或CD40L编码基因)；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。

在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体中的三种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含(a)免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)；(ii)第二核酸载体(例如环状DNA载体)包含树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如FLT3L编码基因、GMCSF编码基因或CD40L编码基因)；和(iii)第三核酸载体(例如，环状DNA载体)包含淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。

在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体中的三种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含FLT3L编码基因；和(iii)第三核酸载体(例如，环状DNA载体)包含淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体中的三种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含GM-CSF编码基因；和(iii)第三核酸载体(例如，环状DNA载体)包含淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。

在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体中的三种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含FLT3编码基因；和(iii)第三核酸载体(例如，环状DNA载体)包含IL-12编码基因。在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体中的三种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含FLT3编码基因；和(iii)第三核酸载体(例如，环状DNA载体)包含IL-15编码基因。在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体中的三种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含FLT3编码基因；和(iii)第三核酸载体(例如，环状DNA载体)包含CXCL9编码基因。在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体中的三种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含FLT3编码基因；和(iii)第三核酸载体(例如环状DNA载体)包含CXCL10编码基因。

在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体中的三种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含GM-CSF编码基因；和(iii)第三核酸载体(例如，环状DNA载体)包含IL-12编码基因。在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体中的三种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含GM-CSF编码基因；和(iii)第三核酸载体(例如，环状DNA载体)包含IL-15编码基因。在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体中的三种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含GM-CSF编码基因；和(iii)第三核酸载体(例如，环状DNA载体)包含CXCL9编码基因。在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体中的三种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含GM-CSF编码基因；和(iii)第三核酸载体(例如环状DNA载体)包含CXCL10编码基因。

在任何前述药物组合物中，免疫调节序列可以位于自复制RNA编码序列内，所述自复制RNA编码序列含有从自复制RNA分子转录RNA的复制酶编码序列。

在一些情况下，药物组合物包含药学上可接受的载体中的两种自复制RNA分子，其中：(i)第一自复制RNA分子包含(a)从自复制RNA分子转录RNA的复制酶编码序列，和(b)免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，其包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)；和(ii)第二自复制RNA分子包含(a)从自复制RNA分子转录RNA的复制酶编码序列和(b)淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。

在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体中的三种自复制RNA分子，其中：(i)第一自复制RNA分子包含(a)从自复制RNA分子转录RNA的复制酶编码序列，和(b)包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)的免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)；(ii)第二自复制RNA分子包含(a)从自复制RNA分子转录RNA的复制酶编码序列，和(b)树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如FLT3L编码基因、GMCSF编码基因或CD40L编码基因)；和(iii)第三自复制RNA分子包含(a)从自复制RNA分子转录RNA的复制酶编码序列和(b)淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，细胞因子编码基因)例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。药学上可接受的载体可以包括在所采用的剂量和浓度下对个体无毒的赋形剂和/或稳定剂。在一些实施方案中，药学上可接受的载体是水性pH缓冲溶液。药学上可接受的载体的实例包括缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如吐温、聚乙二醇(PEG)和普朗尼克(pluronics)。

具有本发明的自复制RNA分子的药物组合物可以含有药学上可接受的载体。如果组合物以液体形式提供，则载体可以是水(例如，无热原水)、等渗盐水或缓冲水性溶液，例如磷酸盐缓冲溶液或柠檬酸盐缓冲溶液。药物组合物的注射可以在水或缓冲液中进行，例如水性缓冲液，例如含有钠盐(例如，至少50mM的钠盐)、钙盐(例如，至少0.01mM的钠盐)或钾盐(例如，至少3mM的钾盐)。根据具体实施方案，钠盐、钙盐或钾盐可以以其卤化物例如氯化物、碘化物或溴化物的形式存在，或者以其氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或硫酸盐等的形式存在。不限于此，钠盐的实例包括NaCl、NaI、NaBr、Na

一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封化合物可适合施用于人。本发明的药物组合物的成分能够以不发生相互作用的方式与如本文所定义的本发明的核酸载体混合，所述相互作用将显著降低本发明的(药物)组合物在通常使用条件下的药物有效性。药学上可接受的载体、填充剂和稀释剂可以具有足够高的纯度和足够低的毒性以使得它们适合施用于被治疗的个体。可用作药学上可接受的载体、填充剂或其成分的化合物的一些实例是糖，例如乳糖、葡萄糖、海藻糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉或马铃薯淀粉；葡萄糖；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、醋酸纤维素；粉化的黄芪胶；麦芽；明胶；动物油脂(tallow)；固体助流剂，例如硬脂酸、硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油(oil from theobroma)；多元醇，例如聚丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇等；或海藻酸。

药学上可接受的载体的选择可以根据药物组合物的施用方式来确定。

适合注射的单位剂型包括无菌水溶液、生理盐水及其混合物。此类溶液的pH可调节至约7.4。适合注射的载体包括水凝胶、用于控释或延迟释放的装置、聚乳酸和胶原基质。用于局部应用的合适的药学上可接受的载体包括适用于洗剂、乳膏、凝胶等的那些。如果药物组合物将以广泛施用，则片剂、胶囊等是优选的单位剂型。

药物组合物中可包含的其他添加剂是乳化剂，例如吐温；润湿剂，例如十二烷基硫酸钠；着色剂；药物载体；稳定剂；抗氧化剂；和防腐剂。

本发明的药物组合物可以以液体或干燥(例如冻干)形式提供。在具体的实施方案中，药物组合物的核酸载体以冻干形式提供。包括本发明的核酸载体的冻干组合物可以在施用前在合适的缓冲液中重构，有利地基于水性载体，例如林格-乳酸盐溶液、林格溶液或磷酸盐缓冲溶液。

在本发明的某些实施方案中，本发明的任何核酸载体可以与一种或多种阳离子或聚阳离子化合物复合，例如阳离子或聚阳离子聚合物、阳离子或聚阳离子肽或蛋白，例如鱼精蛋白、阳离子或聚阳离子多糖和/或阳离子或聚阳离子脂质。

根据具体的实施方案，本发明的核酸载体可以与脂质复合以形成一种或多种脂质体、脂质复合物或脂质纳米颗粒。因此，在一个实施方案中，本发明的组合物包括包含核酸载体的脂质体、脂质复合物和/或脂质纳米颗粒。

基于脂质的制剂由于其生物相容性和易于大规模生产而可以成为核酸载体的有效递送系统。阳离子脂质作为核酸递送的合成材料已被广泛研究。混合在一起后，核酸通过阳离子脂质缩合，形成脂质/核酸复合物，称为脂质复合物。这些脂质复合物能够保护遗传物质免受核酸酶的作用，并通过与带负电荷的细胞膜相互作用将遗传物质递送到细胞中。脂质复合物可以通过直接混合在生理pH下带正电荷的脂质与带负电荷的核酸来制备。

常规脂质体包括可由阳离子、阴离子或中性磷脂和胆固醇组成的脂质双层，其包围水性核心。脂质双层和水性空间都可以分别掺入疏水性或亲水性化合物。脂质体的体内特性和行为可以通过将亲水性聚合物包衣如聚乙二醇(PEG)添加到脂质体表面以赋予空间稳定性来改变。此外，通过将配体(例如，抗体、肽和碳水化合物)附接至脂质体表面或所连接的PEG链的末端，可将脂质体用于特异性靶向。

脂质体是基于胶体脂质和基于表面活性剂的递送系统，由包围水性区室的磷脂双层组成。它们可能呈球形囊泡，大小范围从20nm至数微米。基于阳离子脂质的脂质体能够通过静电相互作用与带负电荷的核酸复合，形成提供体内临床应用所需的生物相容性、低毒性以及大规模生产可能性的复合物。脂质体可以与质膜融合以进行摄取；一旦在细胞内，脂质体就会通过内吞途径被加工，然后遗传物质从内体/载体释放到细胞质中。

阳离子脂质体可以作为RNA递送系统。阳离子脂质，例如MAP、(1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷)和DOTMA(N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基-铵甲基硫酸)可以与带负电荷的核酸形成复合物或脂质复合物，通过静电相互作用形成纳米颗粒，提供高体外转染效率。此外，可以使用用于核酸载体递送的基于中性脂质的纳米脂质体，例如基于中性1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)的纳米脂质体。

因此，在本发明的一个实施方案中，本发明的核酸载体与阳离子脂质和/或中性脂质复合，从而形成脂质体、脂质纳米颗粒、脂质复合物或基于中性脂质的纳米脂质体。

在一个具体的实施方案中，本发明的药物组合物包含与阳离子或聚阳离子化合物和/或与聚合载体一起配制的本发明的核酸载体。因此，在本发明的另一个实施方案中，如本文定义的核酸载体与阳离子或聚阳离子化合物或聚合载体结合或复合，任选地以选自约5:1(w/w)至约0.25:1(w/w)、例如约5:1(w/w)至约0.5:1(w/w)、例如约4:1(w/w)至约1:1(w/w)或约3:1(w/w)至约1:1(w/w)、例如约3:1(w/w)至约2:1(w/w)范围的重量比例的核酸载体与阳离子或聚阳离子化合物和/或与聚合载体；或者任选地，以约0.1-10的范围内、例如约0.3-4或0.3-1的范围内、例如约0.5-1或0.7-1的范围内、例如约0.3-0.9或0.5-0.9的范围内的氮/磷酸盐(N/P)比例的核酸载体与阳离子或聚阳离子化合物和/或聚合载体。例如，核酸载体与一种或多种聚阳离子的N/P比例在约0.1至10的范围内，包括约0.3至4、约0.5至2、约0.7至2以及约0.7至1.5的范围。

本文所述的核酸载体还可以与媒介物、转染剂或复合剂结合以增加本发明的调节基因的转染效率和/或表达。

在一些情况下，本发明的核酸载体与一种或多种聚阳离子复合，优选与鱼精蛋白或oligofectamine复合。可以用作转染剂或复合剂的其他阳离子或聚阳离子化合物可以包括阳离子多糖如壳聚糖、聚凝胺，阳离子聚合物如聚乙烯亚胺(PEI)，阳离子脂质如DOTMA:[1-(2,3-甲硅烷基氧基)丙基)]-N,N,N-三甲基氯化铵、DMRIE、二-C14-脒、DOTIM、SAINT、DC-Chol、BGTC、CTAP、DOPE、LEAP、DOPE：二油基磷脂酰乙醇胺、DOSPA、DODAB、DOIC、DMEPC，DOGS：双十八烷基酰胺甘酰精胺(Dioctadecylamidoglicylspermin)，DIMRI：二肉豆蔻酰-氧基丙基二甲基羟乙基溴化铵，MAP：二油酰氧基-3-(三甲基铵)丙烷，DC-6-14：O,O-双十四烷酰基-N-(α-三甲基铵乙酰)氯化二乙醇胺，CLIP1：外消旋-[(2,3-双十八烷氧基丙基)(2-羟乙基)]-二甲基氯化铵，CLIP6：外消旋-[2(2,3-双十六烷氧基丙基-氧基甲基氧基)乙基]三甲基铵，CLIP9：外消旋-[2(2,3-双十六烷氧基丙基-氧基琥珀酰氧基)乙基]-三甲基铵，oligofectamine，或阳离子或聚阳离子聚合物如改性聚氨基酸，例如β-氨基酸聚合物或反相聚酰胺等，改性聚乙烯，例如PVP(聚(N-乙基-4-乙烯基吡啶鎓溴化物))等，改性丙烯酸酯，例如pDMAEMA(聚(二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯))等，改性酰胺胺例如pAMAM(聚(酰胺胺))等，改性聚β氨基酯(PBAE)，例如二胺末端改性的1,4丁二醇二丙烯酸酯-共-5-氨基-1-戊醇聚合物等，树枝状聚合物如聚丙胺树枝状聚合物或基于pAMAM的树枝状聚合物等，聚亚胺，例如PEI：聚(乙烯亚胺)、聚(丙烯亚胺)等，聚烯丙胺，基于糖骨架的聚合物，例如基于环糊精的聚合物、基于葡聚糖的聚合物、壳聚糖等，基于硅烷骨架的聚合物，例如PMOXA-PDMS共聚物等，由一种或多种阳离子嵌段(例如选自如上所述的阳离子聚合物)和一种或多种亲水性或疏水性嵌段(例如聚乙二醇)的组合组成的嵌段聚合物；等等。

根据一个具体的实施方案，本发明的药物组合物包括包封在聚合物载体内或附接至聚合物载体的核酸载体(例如，环状DNA载体)。根据本发明使用的聚合物载体可以是由二硫键交联的阳离子组分形成的聚合物载体。二硫键交联的阳离子组分可以彼此相同或不同。聚合物载体还可以包含另外的组分。还特别优选的是，根据本发明使用的聚合物载体包含本文定义的阳离子肽、蛋白或聚合物和任选的其他组分的混合物，其通过本文所述的二硫键交联。在本文中，WO 2012/013326的公开内容通过引用并入本文。在本文中，通过二硫键交联形成聚合物载体基础的阳离子组分通常选自用于此目的的任何合适的阳离子或聚阳离子肽、蛋白或聚合物，特别是能够与本文所定义的核酸载体或包含在组合物中的另外的核酸复合，并由此优选地浓缩核酸载体的任何阳离子或聚阳离子肽、蛋白或聚合物。阳离子或聚阳离子肽、蛋白或聚合物可以是线性分子；然而，也可以使用支链阳离子或聚阳离子肽、蛋白或聚合物。

可用于复合作为本发明药物组合物的一部分所包含的本发明核酸载体的聚合载体的每种二硫键交联的阳离子或聚阳离子蛋白、肽或聚合物可含有至少一个SH部分(例如，至少一个半胱氨酸残基或任何呈现SH部分的其他化学基团)，其能够在与作为本文提及的聚合载体的阳离子组分的至少一种另外的阳离子或聚阳离子蛋白、肽或聚合物缩合时形成二硫键。

用于复合本发明的核酸载体的此类聚合载体可以通过二硫键交联的阳离子(或多阳离子)组分形成。特别地，包含或另外经修饰而包含至少一个SH部分的聚合载体的此类阳离子或聚阳离子肽或蛋白或聚合物可以选自蛋白、肽和聚合物作为复合剂。

在其他实施方案中，本发明的药物组合物可以以裸的形式施用，而不与任何另外的媒介物、转染剂或复合剂结合。

本文提供的药物组合物还可以含有所治疗特定癌症必需的多于一种活性成分。例如，在一些情况下，本文所述的任意药物组合物可包含另外的治疗剂，例如抗癌剂(例如化疗剂、检查点抑制剂、细胞毒性剂、生长抑制剂、抗血管生成剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体-药物缀合物、癌症疫苗或其组合)。在具体实施方案中，所述另外的治疗剂是检查点抑制剂，例如PD-1轴结合性拮抗剂(例如抗PD-1拮抗剂或抗PD-L1抗体)，例如派姆单抗(MK-3475)、纳武单抗(ONO-4538/BMS-936558，MDX1106)、匹地利珠单抗(CT-011)、阿替利珠单抗(MPDL3280A)或AMP-224)。在一些实施方案中，抗癌剂是BCL-2抑制剂(例如GDC-0199/ABT-199)、来那度胺

III.治疗方法

本文提供了通过向有此需要的个体施用治疗有效量的任何核酸载体(例如环状DNA载体或自复制RNA分子)或其组合物来治疗该个体中的癌症的方法。在特定情况下，核酸载体的治疗效果(例如，肿瘤微环境的免疫调节)在向肿瘤微环境传输电场之后发生。

核酸载体及其组合物的施用

本发明涉及将本文所述的核酸载体(例如环状DNA载体和自复制RNA分子)或其药物组合物施用于患有癌症的个体(例如人类癌症患者)。在一些实施方案中，施用(例如，作为药物组合物或本文所述的任何治疗方法的一部分)的核酸载体(例如，环状DNA载体)是上述多顺反子核酸载体中的任一种。例如，本发明的方法包括向个体(例如人类癌症患者)施用包含多顺反子(例如双顺反子或三顺反子)免疫调节序列的免疫调节核酸载体，所述多顺反子免疫调节序列包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)和一种或多种免疫调节蛋白编码基因(例如，树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如，FLT3L编码基因、GMCSF编码基因或CD40L编码基因)或淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。因此，在特定情况下，本发明的方法包括向个体(例如人类癌症患者)施用包含三顺反子免疫调节序列的免疫调节核酸载体(例如，环状DNA载体)，所述三顺反子免疫调节序列包含XCL1编码基因、FLT3L编码基因和IL-12编码基因；包括三顺反子免疫调节序列的免疫调节核酸载体(例如，环状DNA载体)，所述三顺反子免疫调节序列包含XCL1编码基因、FLT3L编码基因和IL-15编码基因；或包含三顺反子免疫调节序列的免疫调节核酸载体(例如，环状DNA载体)，所述三顺反子免疫调节序列包含XCL1编码基因、GM-CSF编码基因和IL-15编码基因。

本发明的可选方法包括向个体(例如，人类癌症患者)施用包含免疫调节序列的免疫调节核酸载体，所述免疫调节序列包含多个转录单元，其中一个转录单元包括树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)，并且另一转录单元包括一个或多个免疫调节蛋白编码基因(例如，树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如，FLT3L编码基因、GMCSF编码基因或CD40L编码基因)或淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。因此，在特定情况下，本发明的方法包括向个体(例如，人类癌症患者)施用包含免疫调节序列的免疫调节核酸载体(例如，环状DNA载体)，所述免疫调节序列包含三个转录单元，其中第一转录单元包含XCL1编码基因，第二转录单元包含FLT3L编码基因，并且第三转录单元包括包含IL-12编码基因；包含免疫调节序列的免疫调节核酸载体(例如，环状DNA载体)，所述免疫调节序列包含三个转录单元，其中第一转录单元包含XCL1编码基因，第二转录单元包含FLT3L编码基因，并且第三转录单元包含IL-15编码基因；或包含免疫调节序列的免疫调节核酸载体(例如，环状DNA载体)，所述免疫调节序列包含三个转录单元，其中第一转录单元包含XCL1编码基因，第二转录单元包含GM-CSF编码基因，并且第三转录单元包含IL-15编码基因。

在其他情况下，本发明的治疗方法包括施用一种或多种单顺反子核酸载体(例如，环状DNA载体)。例如，在这种情况下，本发明的方法包括向个体(例如人类癌症患者)施用一种或多种具有免疫调节序列(例如单顺反子免疫调节序列)的免疫调节核酸载体(例如环状DNA载体)，所述免疫调节序列包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)、树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如，FLT3L编码基因、GMCSF编码基因或CD40L编码基因)或淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。

在一些实施方案中，所述方法包括施用两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)或树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如，FLT3L编码基因、GMCSF编码基因或CD40L编码基因)；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。

在一些情况下，所述方法包括施用两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。在一些情况下，所述方法包括施用两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。在一些情况下，所述方法包括施用两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如环状DNA载体)包含IL-12编码基因。在一些情况下，所述方法包括施用两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如环状DNA载体)包含IL-15编码基因。在一些情况下，所述方法包括施用两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含CXCL9编码基因。在一些情况下，所述方法包括施用两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如环状DNA载体)包含CXCL10编码基因。

在一些情况下，所述方法包括施用两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL2编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。在一些情况下，所述方法包括施用两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL2编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含IL-12编码基因。在一些情况下，所述方法包括施用两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL2编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环形DNA载体)包含IL-15编码基因。在一些情况下，所述方法包括施用两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL2编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含CXCL9编码基因。在一些情况下，所述方法包含施用两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL2编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如环状DNA载体)包含CXCL10编码基因。

在一些情况下，所述方法包括施用两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含CCL4编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因)。在一些情况下，所述方法包含施用两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含CCL4编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如环状DNA载体)包含IL-12编码基因。在一些情况下，所述方法包括施用两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含CCL4编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如环状DNA载体)包含IL-15编码基因。在一些情况下，所述方法包括施用两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含CCL4编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含CXCL9编码基因。在一些情况下，所述方法包括施用两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含CCL4编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如环状DNA载体)包含CXCL10编码基因。

在一些情况下，所述方法包括施用两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含CCL5编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因)。在一些情况下，所述方法包括施用两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含CCL5编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如环状DNA载体)包含IL-12编码基因。在一些情况下，所述方法包括施用两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含CCL5编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如环状DNA载体)包含IL-15编码基因。在一些情况下，所述方法包括施用两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含CCL5编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含CXCL9编码基因。在一些情况下，所述方法包括施用两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含CCL5编码基因；和(ii)第二核酸载体(例如环状DNA载体)包含CXCL10编码基因。

在一些实施方案中，所述方法包括施用两种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如FLT3L编码基因、GMCSF编码基因或CD40L编码基因)；和(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。

在一些实施方案中，所述方法包括施用三种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含(a)免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含树突细胞化学引诱剂编码基因(例如，XCL1编码基因、XCL2编码基因、CCL5编码基因或CCL4编码基因)；(ii)第二核酸载体(例如环状DNA载体)包含树突细胞生长因子或激活剂编码基因(例如FLT3L编码基因、GMCSF编码基因或CD40L编码基因)；和(iii)第三核酸载体(例如，环状DNA载体)包含淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。

在一些实施方案中，所述方法包括施用三种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含FLT3L编码基因；和(iii)第三核酸载体(例如，环状DNA载体)包含淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如，CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。在一些实施方案中，所述方法包括施用三种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含GM-CSF编码基因；和(iii)第三核酸载体(例如，环状DNA载体)包含淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(例如，细胞因子编码基因(例如，IL-12编码基因或IL-15编码基因)或趋化因子编码基因(例如CXCL9编码基因或CXCL10编码基因))。

在一些实施方案中，所述方法包括施用三种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含FLT3编码基因；和(iii)第三核酸载体(例如环状DNA载体)包含IL-12编码基因。在一些实施方案中，所述方法包括施用三种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含FLT3编码基因；和(iii)第三核酸载体(例如环状DNA载体)包含IL-15编码基因。在一些实施方案中，所述方法包括施用三种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含FLT3编码基因；和(iii)第三核酸载体(例如，环状DNA载体)包含CXCL9编码基因。在一些实施方案中，所述方法包括施用在药学上可接受的载体中的三种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含FLT3编码基因；和(iii)第三核酸载体(例如环状DNA载体)包含CXCL10编码基因。

在一些实施方案中，所述方法包括施用三种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含GM-CSF编码基因；和(iii)第三核酸载体(例如环状DNA载体)包含IL-12编码基因。在一些实施方案中，所述方法包括施用三种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含GM-CSF编码基因；和(iii)第三核酸载体(例如环状DNA载体)包含IL-15编码基因。在一些实施方案中，所述方法包括施用三种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含GM-CSF编码基因；和(iii)第三核酸载体(例如，环状DNA载体)包含CXCL9编码基因。在一些实施方案中，所述方法包括施用三种核酸载体(例如，环状DNA载体)，其中：(i)第一核酸载体(例如，环状DNA载体)包含免疫调节序列(例如，单顺反子免疫调节序列)，所述免疫调节序列包含XCL1编码基因；(ii)第二核酸载体(例如，环状DNA载体)包含GM-CSF编码基因；和(iii)第三核酸载体(例如环状DNA载体)包含CXCL10编码基因。

在任何前述方法中，免疫调节序列可以位于自复制RNA编码序列内，所述自复制RNA编码序列含有从自复制RNA分子转录RNA的复制酶编码序列。

本发明提供了多种施用途径。在具体实施方案中，核酸载体(例如，环状DNA载体)或其药物组合物瘤内施用。在其他实施方案中，核酸载体(例如，环状DNA载体)或其药物组合物瘤周施用。在其他实施方案中，核酸载体(例如，环状DNA载体)或其药物组合物皮下施用(例如，靠近肿瘤的皮下施用)。在其他实施方案中，核酸载体(例如，环状DNA载体)或其组合物全身施用(例如，静脉内)。

在一些情况下，核酸载体(例如，环状DNA载体)或其药物组合物的单次注射是在治疗过程中施用给个体的。在一些实施方案中，核酸载体(例如，环状DNA载体)或其药物组合物的单次注射是通过瘤内向个体施用的。

核酸载体(例如，环状DNA载体)或其药物组合物可以以单剂量施用。或者，核酸载体(例如，环状DNA载体)或其药物组合物可以在治疗过程中以多个剂量(例如，两个或更多个剂量、三个或更多个剂量、四个或更多个剂量、五个或更多个剂量、六个或更多个剂量，例如两个剂量、三个剂量、四个剂量、五个剂量或六个剂量)施用。

在一些实施方案中，给药频率为每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次、或每十周一次；或每月一次、每两个月一次、或每三个月一次、或更小的频率。根据本领域已知的和本文所述的方法，可以容易地监测(例如，检测或定量)治疗(例如，调节肿瘤微环境)的进展。核酸载体(例如环状DNA载体)或其药物组合物的给药方案可以随时间变化。

可以在已被给予一次或多次核酸载体(例如，环状DNA载体)或其药物组合物的个体中根据经验确定如本文所述的核酸载体(例如，环状DNA载体)或其药物组合物的剂量。向个体给予递增剂量的核酸载体(例如环状DNA载体)或其药物组合物。为了评估核酸载体(例如环状DNA载体)或其药物组合物的功效，可以监测疾病/病症的指标。对于几天或更长时间的重复施用，根据病况，持续治疗直至达到期望的肿瘤微环境调节水平。

在一些情况下，本文所述的核酸载体(例如，环状DNA载体)的适当剂量将取决于具体的核酸载体(例如，环状DNA载体)、癌症的类型和严重程度、先前的治疗、个体的临床病史和对核酸载体(例如环状DNA载体)的反应以及主治医师的判断。临床医师可以施用核酸载体(例如，环状DNA载体)或其药物组合物，直到达到实现期望结果(例如，肿瘤微环境调节和本文定义)的剂量。在一些实施方案中，期望结果是与肿瘤进展相关的生物标志物的表达水平降低或与肿瘤清除相关的生物标志物(例如，免疫调节蛋白)的表达水平增加。在其他实施方案中，期望结果是肿瘤负荷减少、肿瘤细胞数量或代谢活性降低或免疫细胞活性增加。确定剂量是否产生期望结果的其他方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。一种或多种核酸载体(例如环状DNA载体)的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如个体的生理状况和技术人员已知的其他因素。核酸载体(例如，环状DNA载体)的施用可以在预选的时间段内基本上连续，或者可以是一系列间隔剂量，例如，在发展目标疾病或病症之前、期间或之后。

通常来说，施用于人的核酸载体(例如环状DNA载体)的治疗有效量可以在1.0pg至1mg核酸的范围内(例如0.01ng至100μg、0.1ng至50μg、1ng至10μg、或10ng至1μg，例如0.01ng至0.05ng、0.05ng至0.1ng、0.1ng至0.5ng、0.5ng至1ng、1ng至5ng、5ng至10ng、10ng至50ng、50ng至100ng、100ng至500ng、500ng至1μg、1μg至5μg或5μg至10μg，例如约1pg、约5pg、约10pg、约20pg、约25pg、约50pg、约75pg、约100pg、约1ng、约5ng、约10ng、约20ng、约25ng、约50ng、约75ng、约100ng、约1μg、约2μg、约3μg、约4μg、约5μg、约6μg、约7μg、约8μg、约9μg、约10g、约15g、约20μg、约25μg、约50μg、约75μg、约100μg或约500μg)。

本发明的治疗还可以包括施用一种或多种适合于所治疗的特定癌症的另外的治疗剂(例如抗癌剂)。例如，可能期望进一步施用选自化疗剂、细胞毒性剂、生长抑制剂和/或抗激素剂的另外的治疗剂(例如抗癌剂)。

电场的传输

在本发明的一些方面，将电场传输到肿瘤微环境中。传输到肿瘤微环境中的电场可以促进核酸载体(例如，环状DNA载体)转移到肿瘤微环境中的靶细胞(例如，肿瘤细胞或肿瘤浸润性免疫细胞(例如，肿瘤浸润性淋巴细胞或肿瘤驻留抗原呈递细胞(例如，肿瘤驻留树突细胞)))中。这样的电场介导的核酸转移(电转移)可以通过几种机制中的任意一种(及其组合)发生，包括电泳、电动驱动的药物摄取和/或电穿孔。不希望受到理论的束缚，在某些情况下，传输到肿瘤微环境中的电场可以促进由核酸载体(例如，环状DNA载体)传播的抗肿瘤适应性免疫。产生用于在哺乳动物组织中电转移核酸的电场的合适的装置是本领域已知的，并且本领域已知的或本文所述的任何合适的装置都可以使其适合用作本发明的一部分。

可以在施用核酸载体(例如，环状DNA载体)或其药物组合物的时间或该时间附近将适合用于电转移的电场传输至肿瘤微环境(例如，作为同一程序的一部分)。例如，本发明包括其中在施用核酸载体(例如，环状DNA载体)或其药物组合物的一小时内(例如，施用核酸载体(例如，环状DNA载体)或其药物组合物的55分钟内、50分钟内、45分钟内、40分钟内、35分钟内、30分钟内、25分钟内、20分钟内、15分钟内、10分钟内、5分钟内、4分钟内、3分钟内、2分钟内、90秒内、60秒内、45秒内、30秒内、20秒内、15秒内、10秒内、9秒内、8秒内、7秒内、6秒内、5秒内、4秒内、3秒内、2秒内或1秒内)传输电场的方法(例如，与施用核酸载体(例如，环状DNA载体)或其药物组合物同时，或在施用后但在上述任何时间段内)。在一些实施方案中，在施用核酸载体(例如，环状DNA载体)或其药物组合物的24小时内(例如，施用核酸载体(例如，环状DNA载体)或其药物组合物的22小时内、20小时内、18小时内、16小时内、14小时内、12小时内、10小时内、8小时内、6小时内、5小时内、4小时内、3小时内、2小时内、90分钟内、60分钟内、45分钟内、30分钟内、20分钟内、15分钟内、10分钟内、8分钟内、6分钟内、5分钟内、4分钟内、3分钟内或2分钟内)传输电场。在一些实施方案中，在施用核酸载体(例如，环状DNA载体)或其药物组合物的7天内(例如，施用核酸载体(例如，环状DNA载体)或其药物组合物的6天内、5天内、4天内、3天内或2天内)传输电场。

本文包括产生电场并将其传输到肿瘤微环境中的各种方式作为本方法的一部分。具有适于在哺乳动物组织中传输电场(例如，在适于电转移的条件下)的电极的装置和系统是可商购的并且可以用于本文公开的方法中。在一些情况下，电场通过电极传输，所述电极包括一根或多根针(例如，位于肿瘤内(瘤内)或肿瘤附近(瘤周)的一根或多根针，例如单针电极、多针电极或针阵列电极)。合适的针电极包括由

在其他情况下，电场通过非针电极(例如，镊子电极(例如，

适于电转移的电场可以具有任何合适的电压、波形、频率等。在本文所述的传输电场的任何方法的一些实施方案中，传输脉冲电场。适合电转移的脉冲电场可以在一定范围的电压、波形和频率下传输。在一些情况下，脉冲电场以包括0.001ms至100ms的脉冲持续时间的一系列脉冲来传输(例如，0.005ms至50ms、0.05ms至25ms或0.1ms至5ms，例如0.001ms至0.01ms、0.01ms至0.1ms、0.1ms至1.0ms、1ms至2ms、2ms至4ms、4ms至6ms、6ms至10ms、10ms至20ms、20ms至50ms或50ms至100ms，例如约0.005ms、约0.01ms、约0.05ms、约0.1ms、约0.5ms、约0.6ms、约0.7ms、约0.8ms、约0.9ms、约1ms、约1.5ms、约2ms、约2.5ms、约3ms、约4ms、约5ms、约6ms、约7ms、约8ms、约9ms、约10ms、约12ms、约15ms、约20ms、约25ms、约30ms、约35ms、约40ms、约50ms、约60ms、约70ms、约80ms、约90ms或约100ms)。

在一些实施方案中，脉冲电场包括2至100个脉冲(例如，4至50个脉冲、5至40个脉冲、6至30个脉冲、7至25个脉冲或8至20个脉冲，例如1至5个脉冲、5至10个脉冲、8至12个脉冲、10-15个脉冲、15-20个脉冲、20至50个脉冲或50至100个脉冲)。脉冲可以具有任何合适的波形，例如方波、正弦波或锯齿波。在一些实施方案中，以一定频率传输脉冲电场。

在包括脉冲电场传输的方法的任何前述实施方案中的一些中，一个或多个脉冲的能量(例如，靶组织处的电压)为50V至10,000V(例如，100V至5,000V、200V至4,000V、300V至3,000V、400V至2,000V、500V至1,500V或600V至100V，例如100V至200V、200V至300V、300V至400V、400V至500V、500V至600V、600V至700V、700V至800V、800V至900V、900V至1,000V、1,000V至1,500V、1,500V至2,000V、2,000V至3,000V、3,000V至5,000V或5,000V至10,000V，例如约100V、约150V、约200V、约250V、约300V、400V、500V、600V、700V、800V、900V、1,000V、1,500V、约2,000V、约3,000V、约4,000V、约5,000V、约6,000V、约7,000V、约8,000V、约9,000V或约10,000V)。在一些情况下，一个或多个(例如，所有)脉冲的振幅为50V至10,000V(例如，100V至5,000V、200V至4,000V、300V至3,000V、400V至2,000V、500V至1,500V或600V至100V，例如100V至200V、200V至300V、300V至400V、400V至500V、500V至600V、600V至700V、700V至800V、800V至900V、900V至1,000V、1,000V至1,500V、1,500V至2,000V、2,000V至3,000V、3,000V至5,000V或5,000V至10,000V，例如约100V、约150V、约200V、约250V、约300V、400V、500V、600V、700V、800V、900V、1,000V、1,500V、约2,000V、约3,000V、约4,000V、约5,000V、约6,000V、约7,000V、约8,000V、约9,000V或约10,000V)。上述电压中的任何一个可以是方波波形的顶值、正弦波形的峰值、锯齿波形的峰值、正弦波形的均方根(RMS)电压或锯齿波形的RMS电压。

适于电转移的电场可以在核酸载体(例如环状DNA载体)或其药物组合物的施用位点处或其附近传输。例如，在一些实施方案中，将电场传输至与其中施用核酸载体(例如，环状DNA载体)或其药物组合物同一肿瘤微环境中。在一些情况下，将核酸载体(例如，环状DNA载体)或其药物组合物递送至暴露于电场的位置(或在随后的电场传输的情况下将暴露于电场)。在一些实施方案中，递送核酸载体(例如，环状DNA载体)或其药物组合物的位置所暴露的(或将要暴露)的电压是最大组织电压的1％或更高(例如，最大组织电压的至少5％、最大组织电压的至少10％、最大组织电压的至少20％、最大组织电压的至少30％、最大组织电压的至少40％、最大组织电压的至少50％、最大组织电压的至少60％、最大组织电压的至少70％、最大组织电压的至少80％或最大组织电压的至少90％电压，例如，最大组织电压的1％至10％、最大组织电压的10％至20％、最大组织电压的20％至30％、最大组织电压的30％至40％、最大组织电压的40％至50％、最大组织电压的50％至60％、最大组织电压的60％至70％、最大组织电压的70％至80％、最大组织电压的80％至90％、最大组织电压的90％至95％或最大组织电压的95％至100％)。在一些情况下，核酸载体(例如，环状DNA载体)或其药物组合物瘤内施用(例如，在与其中递送电场的肿瘤相同的肿瘤(例如，相同的肿瘤微环境)中瘤内施用)。在一些情况下，核酸载体(例如，环状DNA载体)或其药物组合物瘤周施用。

或者，施用部位可以在远离电场的组织区域中。例如，核酸载体(例如环状DNA载体)或其药物组合物的施用可以是全身的(例如静脉内)，而电场在肿瘤处传输。在一些实施方案中，将核酸载体(例如，环状DNA载体)或其药物组合物施用至非肿瘤组织(例如，肌内、皮下(subcutaneously)或真皮下(subdermally))。

另外的治疗

在本文提供的治疗方法的某些实施方案中，一种或多种另外的治疗与核酸载体(例如环状DNA载体)或其组合物的施用一起施用，例如代替电场传输或与电场传输组合。示例性的另外的治疗包括抗癌治疗，例如放射治疗(例如细胞毒性放射治疗)、光动治疗、热疗、溶瘤治疗(例如施用溶瘤病毒)或抗癌剂(例如化疗剂、检查点抑制剂、细胞毒性剂、生长抑制剂、抗血管生成剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体-药物缀合物、癌症疫苗或其组合)。因此，在一些情况下，本发明包括施用任何本文所述的核酸载体(例如，本文所述的环状DNA载体(例如，单顺反子或多顺反子(例如，双顺反子或三顺反子)核酸载体(例如，环状DNA载体)或具有多个转录单元的核酸载体(例如环状DNA载体)与放射治疗(例如细胞毒性放射治疗)、光动治疗、热疗或溶瘤治疗(例如溶瘤病毒)的组合的任何方法，其中放射治疗、光动治疗、热疗或溶瘤治疗根据任何已知的或容易获得的方案进行施用(例如，代替电场传输)。

在一些实施方案中，另外的治疗是另外的治疗剂，例如抗癌剂(例如化疗剂、检查点抑制剂、细胞毒性剂、生长抑制剂、抗血管生成剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、抗体-药物缀合物、癌症疫苗或其组合)。在具体实施方案中，另外的治疗是化疗剂。在其他具体实施方案中，另外的治疗是检查点抑制剂，例如PD-1轴结合性拮抗剂(例如抗PD-1拮抗剂或抗PD-L1抗体)，例如例如派姆单抗(MK-3475)、纳武单抗(ONO-4538/BMS-936558，MDX1106)、匹地利珠单抗(CT-011)、阿替利珠单抗(MPDL3280A)或AMP-224)。在一些实施方案中，另外的治疗是选自以下的另外的治疗剂：BCL-2抑制剂(例如GDC-0199/ABT-199)、来那度胺

在进一步的情况下，另外的治疗包括抗CD20抗体，例如利妥昔单抗或人源化B-Ly1抗体(例如obinituzumab)。在一些实施方案中，抗CD20抗体是奥法木单抗(ofatumumab)、乌妥昔单抗(ublituximab)和/或替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)。

在一些情况下，另外的治疗包括烷化剂，例如4-[5-[双(2-氯乙基)氨基]-1-甲基苯并咪唑-2-基]丁酸或其盐。在一些实施方案中，烷化剂是苯达莫司汀。

在本发明的另一个方面，另外的治疗包括BCL-2抑制剂。在一些实施方案中，BCL-2抑制剂是4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪--1-基)-N-({3-硝基-4-[(四氢-2H-吡喃-4-基甲基)氨基]苯基}磺酰基-1)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺(4-(4-{[2-(4-chlorophenyl)-4,4-dimethylcyclohex-1-en-1-yl]methyl}piperazin-

-1-yl)-N-({3-nitro-4-[(tetrahydro-2H-pyran-4-ylmethyl)amino]phenyl}sulfony-l)-2-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-5-yloxy)benzamide)及其盐。在一个实施方案中，BCL-2抑制剂是维奈托克(venetoclax)(CAS#：1257044-40-8)。

在本发明的另一个方面，另外的治疗包括磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂。在一个实施方案中，PI3K抑制剂抑制δ同工型PI3K(即，P110.δ.)。在一些实施方案中，PI3K抑制剂是5-氟-3-苯基-2-[(1S)-1-(7H-嘌呤-6-基氨基)丙基]-4(3H)-喹唑啉酮(5-Fluoro-3-phenyl-2-[(1S)-1-(7H-purin-6-ylamino)propyl]-4(3H)-quinazolino-ne)及其盐。在一些实施方案中，PI3K抑制剂是艾代拉里斯(CAS#：870281-82-6)。在一个实施方案中，PI3K抑制剂抑制PI3K的α和δ同工型(isoform)。在一些实施方案中，PI3K抑制剂是2-{3-[2-(1-异丙基-3-甲基-1H-1,2-4-三唑-5-基)-5,6-二氢苯并[f]i-咪唑并[1,2-d][1,4]氧氮杂卓-9-基]-1H-吡唑-1-基}-2-甲基丙酰胺(2-{3-[2-(1-Isopropyl-3-methyl-1H-1,2-4-triazol-5-yl)-5,6-dihydrobenzo[f]i-mida zo[1,2-d][1,4]oxazepin-9-yl]-1H-pyrazol-1-yl}-2-methylpropanamide)及其盐。

在本发明的另一个方面，另外的治疗包括布鲁顿氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂。在一个实施方案中，BTK抑制剂是1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]p-哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮(1-[(3R)-3-[4-Amino-3-(4-phenoxyphenyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-1-yl]p-iperidin-1-yl]prop-2-en-1-one)及其盐。在一个实施方案中，BTK抑制剂是依鲁替尼(ibrutinib)(CAS#：936563-96-1)。

在本发明的另一个方面，另外的治疗包括沙利度胺(thalidomide)或其衍生物。在一个实施方案中，沙利度胺或其衍生物是(RS)-3-(4-氨基-1-氧代1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮((RS)-3-(4-Amino-1-oxo1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl)piperidine-2,6-dione)及其盐。在一个实施方案中，沙利度胺或其衍生物是来那度胺(lendalidomide)(CAS#：191732-72-6)。

在本发明的另一个方面，另外的治疗包括环磷酰胺、多柔比星、长春新碱或泼尼松龙(CHOP)中的一种或多种。在一个实施方案中，另外的治疗还包含如上所述的抗CD20抗体(例如GA-101和/或

在某些实施方案中，另外的治疗剂是化疗剂、生长抑制剂、细胞毒性剂、放射治疗中使用的药剂、抗血管生成剂、细胞凋亡剂、抗微管蛋白剂或其他药剂，例如表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂(例如厄洛替尼(Tarceva))、血小板衍生的生长因子抑制剂(例如格列卫(甲磺酸伊马替尼))、COX-2抑制剂(例如塞来昔布)、干扰素、细胞因子、除本发明的抗CD3抗体之外的抗体，例如与以下靶标中的一种或多种结合的抗体：ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA VEGF或VEGF受体、TRAIL/Apo2、PD-1、PD-L1、PD-L2或其他生物活性的或有机的化学剂。

在一些实施方案中，本发明提供了一种方法，其中另外的治疗剂是糖皮质激素。在一个实施方案中，糖皮质激素是地塞米松(dexamethasone)。

肿瘤与个体

本文所述的组合物和方法适合于治疗各种癌症类型。在特定情况下，所治疗的癌症是实体瘤(例如，肉瘤、癌或淋巴瘤)。可通过本发明的方法治疗的实体瘤包括上皮细胞来源的实体瘤和非上皮细胞来源的实体瘤。上皮细胞来源的实体瘤的实例包括头颈、胃肠道、结肠、乳腺、前列腺、肺、肾、肝、胰腺、卵巢、口腔、胃、十二指肠、小肠、大肠、肛门、胆囊、阴唇、鼻咽、皮肤、子宫、雄性生殖器官、泌尿器官、膀胱和皮肤的肿瘤。非上皮细胞来源的实体瘤包括肉瘤和脑肿瘤。

在一些情况下，本发明的组合物和方法适合于治疗黑色素瘤。可以通过本发明的组合物和方法治疗的黑色素瘤包括浅表扩散性黑色素瘤(superficial spreadingmelanoma)、结节性黑色素瘤(nodular melanoma)、雀斑样黑色素瘤(lentigo melanoma)、肢端雀斑样黑色素瘤(acral lentiginous melanoma)、无色素黑色素瘤(amelanoticmelanoma)、痣样黑色素瘤(nevoid melanoma)、斯皮茨痣样黑素瘤(spitzoid melanoma)和促结缔组织增生性黑色素瘤(desmoplastic melanoma)。

在一些情况下，本发明的组合物和方法适合于治疗头颈癌。可以通过本发明的方法和组合物治疗的头颈癌包括鳞状细胞癌(例如，口腔鳞状细胞癌)。在一些情况下，本发明可治疗的头颈癌是鼻咽(nasopharynx)、口咽(oropharynx)、下咽(hypopharynx)、喉(larynx)或气管(trachea)的癌症(例如癌，例如鳞状细胞癌)。在一些实施方案中，头颈癌的特征在于唇、口腔、口咽、下咽、鼻咽、声门喉或声门上喉中的肿瘤。在一些实施方案中，头颈癌的特征在于筛窦肿瘤(ethmoid sinus tumor)、上颌窦肿瘤(maxillary sinustumor)、唾液腺肿瘤(salivary gland tumor)、隐匿性原发性肿瘤(occult primarytumor)或粘膜黑色素瘤(mucosal melanoma)。

在其他实施方案中，癌症选自由以下组成的组：硬纤维瘤(desmoid tumor)、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、食道癌、间皮瘤、甲状腺癌、肉瘤、前列腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、胸腺癌或淋巴瘤。在一些实施方案中，肿瘤是Klatskin肿瘤、肝门肿瘤(hilar tumor)、生殖细胞肿瘤、尤文氏肿瘤、阿斯金肿瘤、原始神经外胚层肿瘤、Leydig细胞肿瘤、Wilms肿瘤或支持细胞肿瘤(Sertoli cell tumor)。在一些实施方案中，肿瘤是选自由以下组成的组的癌：鳞状细胞癌、泄殖腔癌(cloacogenic carcinoma)、腺癌、腺鳞癌、胆管癌、肝细胞癌、侵袭性乳头状尿路上皮癌和扁平尿路上皮癌。

在一些实施方案中，肿瘤是可切除的肿瘤。在其他实施方案中，肿瘤是不可切除的肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤是晚期肿瘤。在其他实施方案中，肿瘤是早期肿瘤。在一些实施方案中，癌症是复发性和/或难治性癌症(例如，该方法是二线或三线治疗)。

根据本发明制备的核酸载体(例如环状DNA载体)和药物组合物可用于治疗儿童或成人。因此，个体(例如人类患者)可以是小于1岁、小于5岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。

检测肿瘤微环境调节

可以使用本领域已知的任何方法来检测本文提供的治疗方法对肿瘤微环境的调节(例如，通过检测肿瘤微环境调节的遗传或蛋白生物标志物)。用于确定治疗是否调节特定肿瘤微环境的基因和蛋白生物标志物对于技术人员来说是容易获得的，例如通过美国国家综合癌症网络(NCCN)提供的信息。另外或可选地，肿瘤微环境的调节可以根据临床反应标准来检测或定量，例如实体瘤反应评估标准(RECIST)指南中定义的读数。

在一些情况下，如果治疗(例如，本发明的治疗，例如包括施用核酸载体(例如，环状DNA载体)和/或传输电场的治疗)增加了与肿瘤清除相关的生物标志物(例如，肿瘤微环境中的免疫原性蛋白(例如，促炎细胞因子或树突细胞激活蛋白))的相对表达，则肿瘤微环境通过该治疗而被调节。另外或可选地，如果治疗降低了与肿瘤进展相关的生物标志物的相对表达(例如，T细胞耗竭的生物标志物，例如PD-1表达)，则称肿瘤微环境被该治疗调节。

在一些实施方案中，指示肿瘤微环境调节的生物标志物表达水平的可测量变化是生物标志物表达水平的至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少75％或至少90％的变化。例如，当相对于参考水平与肿瘤进展相关的生物标志物表达降低是至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少75％或至少90％时，所述标志物的表达水平的可测量的降低指示了期望的肿瘤微环境调节。另外或可选地，当相对于参考水平与肿瘤清除相关的生物标志物(例如，免疫原性蛋白)表达增加是增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少75％、至少90％、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍(例如，相对于参考水平增加1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％、90％至100％、2倍至3倍、3倍至5倍、5倍至10倍、10倍至20倍、20倍至50倍、50倍至100倍或更多；例如，相对于参考水平增加1％至100％、2倍至10倍、10倍至50倍、50倍至100倍或更多)时，所述生物标志物的表达水平的可测量的增加指示了期望的肿瘤微环境调节。

在一些实施方案中，与肿瘤清除相关的生物标志物是循环生物标志物，例如循环肿瘤DNA(ctDNA)，例如无细胞ctDNA、无细胞RNA、mRNA或非编码RNA(例如microRNA、短干扰、piwi相互作用RNA、小核RNA、小核仁RNA、长的非编码RNA、microRNA)。

在具体情况下，肿瘤微环境的调节的特征在于检测出抗肿瘤适应性免疫应答(例如，相对于参考水平，抗肿瘤适应性免疫应答的产生、传播或增强)，例如，针对由正在被治疗的个体中肿瘤表达的一种或多种肿瘤抗原产生的适应性免疫应答(例如，其中肿瘤抗原原位产生和识别并且不是通过治疗提供的)。因此，在一些情况下，本发明的任何方法还包括检测个体中的抗肿瘤适应性免疫应答的步骤(例如，在本发明的治疗之后、在本发明的治疗之前或两者)。

可以测定组织或细胞样品，例如使用Northern、斑点印迹、聚合酶链式反应(PCR)分析、阵列杂交、RNase保护测定或DNA SNP芯片微阵列(可商购，包括DNA微阵列快照)来测定来自基因生物标志物的mRNA或DNA。例如，实时PCR(RT-PCR)测定例如定量PCR测定是本领域公知的。在本发明的一些情况下，用于检测来自生物样品如肿瘤样品(例如实体瘤样品)中的目标基因生物标志物的mRNA的方法包括，使用至少一种引物通过逆转录从样品中产生cDNA；扩增如此产生的cDNA；并检测扩增的cDNA的存在。此外，此类方法可包括允许测定生物样品中mRNA水平的一个或多个步骤(例如，通过同时检查“管家”基因(例如肌动蛋白家族成员)的比较对照mRNA序列的水平)。任选地，可以测定所扩增的cDNA的序列。

在一个具体的实施方案中，本文所述的基因生物标志物的表达可以通过RT-PCR技术进行。用于PCR的探针可以用可检测标记物标记，例如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。此类探针和引物可用于检测样品中所表达基因(例如，免疫调节基因)的存在。如技术人员将理解的，可以制备多种不同的引物和探针并有效地使用它们来扩增、克隆和/或测定一种或多种调节(例如，免疫调节)基因的存在和/或表达水平。另外或可选地，可以使用已知方法检测和/或定量源自肿瘤样品的基因生物标志物，例如桑格测序、焦磷酸测序、等位基因特异性阵列引物延伸、下一代测序(NGS)、突变体富集液体芯片、扩增阻滞性突变系统、较低变性温度下的共扩增-PCR以及珠子/乳液/扩增/磁性PCR。

其他方法包括通过微阵列技术检查或检测来自组织(例如肿瘤组织，例如实体瘤组织)或细胞样品中的至少一种基因生物标志物的mRNA的方案。使用核酸微阵列，对来自测试和对照组织样品的测试和对照mRNA样品进行反转录和标记，以生成cDNA探针。然后将探针与固定在固体支持物上的核酸阵列杂交。该阵列被配置为已知该阵列中每个成员的序列和位置。例如，可以将在某些疾病状态下具有表达潜力的基因选项在固体支持物上进行排列。标记探针与特定阵列成员的杂交表明，探针来源的样品表达该基因。疾病组织的差异基因表达分析可以提供有价值的信息。微阵列技术利用核酸杂交技术和计算技术来评估单个实验中数千个基因的mRNA表达谱(参见例如WO 2001/75166)。参见，例如，美国专利号5,700,637、5,445,934和5,807,522、Lockart,Nat.Biotechnol.14:1675-1680(1996)；和Cheung等人,Nat.Genet.21(Suppl):15-19(1999)关于阵列制造的讨论。

另外，可以采用利用微阵列的DNA分析和检测方法，例如，如EP 1753878中所描述的。此类方法利用短串联重复(STR)分析和DNA微阵列来快速识别和区分不同的DNA序列。在一个实施方案中，标记的STR靶序列与携带互补探针的DNA微阵列杂交。这些探针的长度各不相同，覆盖了可能STR的范围。利用杂交后酶消化来选择性地从微阵列表面去除DNA杂交体的标记单链区域。未知靶标中的重复数目是根据与微阵列保持杂交的靶DNA谱图而推断的。微阵列处理器的一个实例是Affymetrix

除了RT-PCR或另一种基于PCR的方法之外，用于确定生物标志物水平的其他方法包括蛋白组学技术以及可用于根据患者在分子水平上的反应来治疗癌症的个体化基因谱。本文的专用微阵列，例如寡核苷酸微阵列或cDNA微阵列，可以包含一种或多种具有与肿瘤进展或肿瘤清除(例如，通过抗肿瘤免疫)相关的表达谱的生物标志物。可用于本发明的核酸检测中使用的其他方法包括高通量RNA序列表达分析，包括基于RNA的基因组分析，例如RNASeq。

在特定情况下，可以使用可用的NGS技术来检测、定量和/或监测肿瘤微环境的调节，例如肿瘤特异性NGS试剂盒，如

多种测定法可用于检测和定量蛋白生物标志物，包括例如基于抗体的方法以及质谱法和本领域已知的其他类似方法，包括但不限于免疫组织化学(IHC)、蛋白质印迹分析、免疫沉淀、分子结合测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶联免疫过滤测定(ELIFA)、荧光激活细胞分选(FACS)、MassARRAY、蛋白组学、定量的基于血液的测定(例如血清ELISA)、生化酶活性分析、原位杂交、荧光原位杂交(FISH)、Southern分析或Northern分析。在基于抗体的方法的情况下，例如，可以将样品与对所述生物标志物特异的抗体在足以形成抗体-生物标志物复合物的条件下接触，然后检测所述复合物。检测蛋白生物标志物的存在是可以通过多种方式完成的，例如免疫组织化学(IHC)、蛋白质印迹(有或没有免疫沉淀)、二维SDS-PAGE、免疫沉淀、荧光激活细胞分选(FACS)、流式细胞术和ELISA程序用于测定各种组织和样品，包括血浆或血清。有使用这样的测定形式的多种免疫测定技术都是可用的，参见例如美国专利号4,016,043、4,424,279和4,018,653。这些包括非竞争性类型的单位点和双位点或“夹心”测定，以及传统的竞争性结合测定。这些测定还包括标记抗体与靶标生物标志物的直接结合。

夹心测定法是最常用的测定法之一。夹心测定技术存在多种变型，并且所有变型都涵盖在本发明中。简言之，在典型的正向测定中，将未标记的抗体固定在固体基质上，并使待测试的样品与所结合的分子接触。经过适当的孵育时间，该时间足以形成抗体-抗原复合物，然后添加第二抗体并进行孵育(所述第二抗体对该抗原具有特异性，标记有能够产生可检测信号的报告分子)，时间足以形成另一种抗体-抗原标记抗体复合物。洗去任何未反应的物质，并通过观察报告分子产生的信号来确定抗原的存在。结果可以通过简单观察可见信号来定性，或者可以通过与含有已知量的生物标志物的对照样品比较来定量。

正向测定的变型包括同时测定，在该测定中将样品和标记抗体同时添加至所结合的抗体。这些技术对于本领域技术人员来说是公知的，包括显而易见的任何微小变化。在通常的正向夹心测定中，对生物标志物具有特异性的第一抗体共价结合或被动结合至固体表面。固体表面通常是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持物可以是管、珠子、微板盘或任何其他适合进行免疫测定的表面的形式。结合方法是本领域公知的，并且通常包括交联、共价结合或物理吸附，对聚合物-抗体复合物进行洗涤以制备测试样品。然后将待测试样品的等分试样添加到固相复合物中并在合适的条件下(例如从室温至40℃，例如在25℃和32℃之间(包括端值))孵育适当的时间段(例如，2-40分钟或过夜(如果更方便的话))，以允许抗体中存在的任何亚基的结合。孵育期后，洗涤并干燥抗体亚基固相，并与对生物标志物的一部分具有特异性的第二抗体一起孵育。第二抗体与报告分子连接，该报告分子用于指示第二抗体与分子标记物的结合。

另一种方法包括固定样品中的靶标生物标志物，然后使固定的靶标暴露于特异性抗体(可用或可不用报告分子标记)。根据靶标的量和报告分子信号的强度，可以通过用抗体直接标记来检测结合的靶标。或者，将对第一抗体具有特异性的第二标记抗体暴露于靶标-第一抗体复合物以形成靶标-第一抗体-第二抗体三级复合物。通过报告分子发出的信号来检测复合物。报告分子是一种通过其化学性质提供可通过分析鉴定的信号的分子，该信号允许检测抗原结合的抗体。此类测定中最常用的报告分子是酶、荧光团或含有放射性核素的分子(即放射性同位素)和化学发光分子。

在酶免疫测定的情况下，酶通常通过戊二醛或高碘酸盐与第二抗体缀合。然而，如将容易认识到的，存在多种不同的缀合技术，这些技术对于本领域技术人员来说是容易获得的。常用的酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶等。与特定酶一起使用的底物通常是根据在通过相应的酶水解时产生可检测的颜色变化而选择的。合适的酶的实例包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。还可以使用荧光生成性底物，其产生荧光产物而不是上述显色底物。在所有情况下，将酶标记抗体添加至第一抗体-标记物分子复合物，使它们结合，然后洗去多余的试剂。然后将含有适当底物的溶液添加至抗体-抗原-抗体的复合物。底物将与第二抗体连接的酶进行反应，产生定性视觉信号，该信号可以被进一步定量(通常通过分光光度法)，以指示样品中存在的生物标志物的量。或者，荧光化合物，例如荧光素和罗丹明，可以与抗体化学偶联，而不改变其结合能力。当用特定波长的光照射激活时，荧光染料标记的抗体会吸收光能，诱导分子进入激发状态，然后以光学显微镜可目测的特征颜色发射光。与在EIA中一样，荧光标记的抗体可以与第一抗体-分子标记物复合物结合。洗去未结合的试剂后，将剩余的三级复合物暴露于适当波长的光下，观察到的荧光指示了目标分子标记物的存在。免疫荧光和EIA技术在本领域中均十分成熟。也可以使用其他报告分子，例如放射性同位素、化学发光或生物发光分子。

临床反应标准也可用于确定肿瘤微环境是否被调节。可以使用任何已建立的临床反应标准，包括RECIST指南。例如，在一些实施方案中，确定肿瘤微环境已经通过延长无进展生存期、导致客观反应(包括部分反应或完全反应)、增加总生存时间和/或改善癌症的一种或多种症状的治疗而被调节。

IV.试剂盒和制品

在本发明的另一个方面，提供了包含可用于上述治疗的物质的制品或试剂盒。该制品包括容器和插入容器上或与容器结合的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由多种材料形成，例如玻璃或塑料。该容器容纳组合物，该组合物单独或与可有效治疗、预防和/或诊断病况的另一种组合物组合，并且可以具有无菌存取口(例如容器可以是静脉溶液袋或具有通过皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的核酸载体(例如，环状DNA载体或自复制RNA分子)或包含本发明的核酸载体的药物组合物。标签或包装插页表明该组合物用于治疗所选的癌症。此外，制品可包括(a)其中含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的核酸载体(例如，环状DNA载体)和/或组合物；(b)其中含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另外的治疗剂(例如，另外的抗癌剂)。制品还可包含包装插页，其指示组合物可用于治疗特定病况。另外或可选地，制品可进一步包含第二(或第三)容器，该容器包含药学上可接受的载体，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液或任何上面公开的药学上可接受的载体。它还可以包括从商业和用户角度来看所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。

在本发明的特定实情况下，提供了试剂盒，其包括(i)本发明的任何一种或多种上述物质(例如，核酸载体(例如，环状DNA载体或自复制RNA分子)，或组合物，该组合物包含核酸载体(例如，环状DNA载体)、另外的治疗剂(例如，另外的抗癌剂)和/或一种或多种药学上可接受的载体)和(ii)能量递送装置(例如，包括用于将电场传输至肿瘤微环境的电极的装置，例如上述任何合适的装置或系统)的一种或多种元件。在一些实施方案中，本文提供了包括本发明的核酸载体(例如，环状DNA载体)和电极的试剂盒。在一些实施方案中，本文提供了包括包含本发明的核酸载体(例如，环状DNA载体)的药物组合物和电极的试剂盒。

表1：序列

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实施例

以下是用于产生和测试上述组合物以及用此类组合物治疗个体的方法的非限制性实例。

实施例1：编码治疗三联体的合成环状DNA载体的无细胞生产

本实施例描述了编码治疗三联体的两种合成环状DNA载体的产生和表征：(1)单转录单元载体，其具有驱动所有三种治疗序列表达的单个启动子(如图1所示)；和(2)具有三个启动子的多转录单元载体，每个启动子驱动三个治疗序列之一的表达(如图2A所示)。在该实施例中，治疗序列是sFLT3L、IL-12和XCL1(以5'至3'方向有效连接)。

将以下试剂在1x Phi29缓冲液(New England Biolabs)中混合，以制备滚环扩增(RCA)溶液：含有单转录单元或多转录单元模式的治疗三联体的质粒DNA(5μg/mL最终浓度)、随机引物(50μM最终浓度)、NaOH(10mM最终浓度)、dNTP(2mM最终浓度)、牛血清白蛋白(BSA)(0.2mg/mL最终浓度)、Phi29DNA聚合酶(200U/mL最终浓度)和焦磷酸酶储备液(NewEngland Biolabs；0.4mU/mL最终浓度)。RCA溶液在30℃下连续混合18小时。

孵育后，将温度升至65℃，以将RCA溶液热灭活45分钟。然后将灭活的RCA溶液的温度降至37℃。

为了产生BsaI溶液，将灭活的RCA溶液(0.2mg DNA/mL最终浓度)添加到含有BsaI(2.5U/μg DNA最终浓度)的

为了产生连接溶液，将消化的BsaI溶液(40μg DNA/mL最终浓度)添加到含有T4连接酶(每μg DNA 10U的T4连接酶)和核糖ATP(1mM最终浓度)的

孵育后，将温度升至65℃，以将连接溶液热灭活45分钟。然后将灭活的连接溶液的温度降至37℃。

为了产生超螺旋溶液，将连接溶液添加到含有DNA旋转酶(每μg DNA 1.5U的旋转酶)的旋转酶缓冲液中。旋转酶缓冲液含有35mM Tris-HCl、24mM KCl、4mM MgCl2、1mM ATP、2mM DTT、1.8mM亚精胺、32％甘油(w/v)、100μg/mL BSA和500μg/mL BSA。将超螺旋溶液在37℃下连续混合两小时。不对超螺旋溶液进行热灭活。

接下来，将超螺旋溶液添加到含有T5核酸外切酶(每μg DNA 2.5U的T5核酸外切酶)的乙酸钾缓冲液(50mM乙酸钾，最终浓度)中以产生清洁溶液。将清洁溶液在37℃下连续混合至少两个小时。没有对清理溶液进行热灭活。

然后将清洁溶液无菌过滤通过0.22μm过滤器，并在含有1.5M NaCl、100mM MOPS、30％异丙醇(IPA)和0.3％ Triton X-100(v/v)的缓冲液中按1:1稀释以达到760mM NaCl、50mM MOPS、15％异丙醇(IPA)和0.15％ Triton X-100(v/v)的最终浓度。将稀释的清洁溶液添加到Qiagen质粒制备柱中，并用QN缓冲液洗脱DNA。洗脱物用IPA(40％v/v)稀释，并在4℃、15,000g下离心30分钟。用70％ EtOH洗涤沉淀，并在4℃、15,000g下再次离心30分钟。第二次离心后，将沉淀以1.0mg/mL重悬于PBS中。

通过使用Image Lab软件

上述方法从0.42mg质粒产生了1.7mg的图1A的单转录单元载体(4537bp)(约增加4倍)，相比之下，从0.75mg质粒产生4.0mg的图2A的多转录单元载体(8035bp)(增加5.3倍)。通过上述光密度分析测量，单转录单元载体经计算为78％超螺旋。通过相同的分析，多转录单元载体经计算为85％超螺旋。作为比较，通过同样的方法生产编码由CAG启动子驱动的单基因(IL-12)的合成环状DNA载体(3466bp)的样品，从0.32mg质粒产生了2.5mg载体(7.8倍增加)。通过上述光密度分析测量，单基因载体经计算为具有84％超螺旋。该数据显示，除了含有单个基因的较小合成环状DNA载体之外，本文所述的无细胞生产方法还可用于有效生产含有多个基因的相对大的合成环状DNA载体。

实施例2：合成环状DNA载体的三个治疗序列中每一个的蛋白表达

表征了SEQ ID NO：37(c3-Tx)的8035bp多转录单元合成环状DNA载体的体外蛋白表达。HEK293T细胞以200K细胞/孔的密度接种于透明平底12孔板中，并与浓度为每孔1μg的质粒+每孔3μL Lipofetamine3000+每孔2μL P3000孵育48小时。使用培养基作为阴性对照，通过ELISA定量c3-Tx的sFlt3L、XCL1和IL-12蛋白表达。检测到sFlt3L(图3A)、IL-12(图3B)和XCL1(图3C)的蛋白表达，证明了c3-Tx导致所有三种免疫调节蛋白的蛋白表达。

实施例3：合成环状DNA载体表达的蛋白的功能测定

在如实施例2所述的体外孵育后，进行功能测定以确定由图2A的8035bp多转录单元合成环状DNA载体表达的蛋白是否具有生物学功能。

为了测量IL-12活性，使用HEK Blue-IL-12细胞进行Quanti Blue/分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)测定。简言之，将每孔50,000个HEK-Blue-IL12细胞置于96孔板中。用20μL/孔muIL12p70(标准曲线)、huINFα(阴性对照)或来自转染HEK293T细胞的条件培养基(1:100稀释)处理细胞，并在37℃下孵育24小时。将来自每个样品的20μL HEK-Blue-IL12细胞上清液转移至96孔板的孔中，并添加180μL Quanti-Blue溶液。将样品在37℃下孵育一小时，并测量630nm处的吸光度。图4显示了从图2的8035bp多转录单元合成环状DNA载体表达的IL-12p70具有生物学功能。

Flt3L活性是根据sFlt3L条件培养基的骨髓源性树突细胞(BMDC)分化来测量的。简言之，将HEK细胞与图2的8035bp多转录单元合成环状DNA载体一起孵育以产生条件培养基。从小鼠股骨中收获骨髓祖细胞，并在条件培养基(20ng/mL)、含有重组sFLT3L(20ng/mL)的培养基(作为阳性对照)和含有重组GMCSF(20ng/mL)的培养基(作为阴性对照)中培养。对于每种条件，在第3天和第6天补充培养基，并在第7天收获松散贴壁的细胞。通过对CD11c

实施例4：与质粒相比，合成环状DNA载体具有改善的瘤内表达持续性

在该实施例中，测试了合成环状DNA载体的瘤内表达持续性。使用本文所述的无细胞方法制备编码fLuc的合成环状DNA载体(c3-fLuc)，并与编码fLuc的质粒DNA载体(p-fLuc)进行比较。在治疗前11天向BALB/c小鼠在胁腹接种CT-26肿瘤细胞。瘤内施用c3-fLuc或p-fLuc(46uL至55uL，浓度为1mg/mL)，然后通过定位成接触肿瘤表面的板电极传输电能。对每个肿瘤以800V/cm施加八个5ms脉冲，以将载体电转移到肿瘤细胞中。通过活体成像对动物进行17天的监测。

图7A-7F是显示来自PBS(图7A和7B)、p-fLuc(图7C和7D)和c3-fLuc(图7E和7F)处理的3天(图7A、7C和7E)和17天(图7B、7D和7F)时小鼠中fLuc表达的图像。图8中的图表显示了这些数据的定量以及第7、10和14天的额外时间点。这些数据表明，在用合成环状DNA载体(c3 fLuc)处理的动物中，fLuc辐射在整个17天的时间过程中保持，而在用质粒DNA载体(pfLuc)处理的动物中，fLuc表达减弱，这表明与质粒相比，合成环状DNA载体表现出增强的表达持续性。

实施例5：用单剂量的合成的治疗性环状DNA载体治疗，小鼠肿瘤的生长降低

对图2A的8035bp多转录单元合成环状DNA载体测试了体内肿瘤的降低。在这项研究中，在治疗前8天向BALB/c小鼠在胁腹接种CT-26肿瘤细胞。图2A的合成治疗性环状DNA载体(c3-Tx)使用本文所述的无细胞方法制备，并以1mg/mL的浓度配制为在PBS中的药物组合物。PBS处理组作为阴性对照。将单剂量的50uL的合成环状DNA载体制剂或PBS施用到每只小鼠的肿瘤中，并且在每次施用后使用多针电极阵列进行电转移。将六根28号针排列成两行，每行三根，每行中每根针之间的距离为1.5mm(行长为3mm)，行与行之间的距离为2.5mm。将针阵列瘤内插入，并以800V/cm(电流在针行之间流动)施加八个5ms脉冲。

随时间监测肿瘤体积。如图9所示，与PBS对照组相比，c3 Tx治疗的小鼠在第7天及之后表现出显著较低的平均肿瘤体积。这些数据表明，在肿瘤组织中电转移合成治疗性环状DNA载体可以减少肿瘤生长。

收集肿瘤样品以确定观察到的c3 Tx效果是否与免疫细胞肿瘤浸润增加相关。如通过流式细胞术定量CD45

实施例6：延长合成的治疗性环状DNA载体的再次给药导致肿瘤生长减少和存活期延长

对图2A的8035bp多转录单元合成环状DNA载体测试了对荷瘤小鼠存活的影响。在这项研究中，在治疗前12天向BALB/c小鼠在胁腹接种CT-26肿瘤细胞。图2A的合成的治疗性环状DNA载体(c3-Tx)使用本文所述的无细胞方法制备，并以1mg/mL的浓度配制为在PBS中的药物组合物。阴性对照包括PBS组和编码fLuc的合成环状DNA载体(c3-fLuc；1mg/mL)。在研究的第1天和第4天将50uL合成环状DNA载体制剂或PBS施用到肿瘤中。每次施用载体后，使用如实施例5中所述的双极多针电极阵列进行电转移。以800V/cm施用八个5-ms脉冲。监测肿瘤体积，并在达到肿瘤负荷(2000mm

图11显示了每组(n＝10)的存活曲线。如通过随时间的肿瘤体积所测量的，用合成的治疗性环状DNA载体治疗的小鼠比PBS治疗的小鼠或c3fLuc对照组存活得更久并且平均经历更慢的肿瘤生长(图12)。该数据证实了实施例6中的观察结果。此外，这些数据表明合成环状DNA载体的治疗效果取决于治疗序列，而不是对DNA载体本身的非特异性免疫应答，如缺乏c3 fLuc的功效所示。

实施例7：mRNA载体的瘤内电转移

为了确定通过电转移在肿瘤组织中表达mRNA的可行性，在研究的第1天将编码GFP的50uL裸mRNA(1mg/mL)注射到BALB/c小鼠(N＝12)的CT-26胁腹肿瘤中。编码GFP的合成环状DNA载体(c3-GFP)用作阳性对照，PBS用作阴性对照。核酸注射后，立即使用双极多针阵列进行电转移，如实施例5中所述。以800V/cm施用八个5-ms脉冲。在终点(第2天、第5天和第8天)收集肿瘤以检测肿瘤中的GFP蛋白表达。

图13显示了随时间的GFP表达。在注射了合成环状DNA载体的肿瘤中，GFP在每个时间点都高度表达。尽管相对于合成环状DNA载体组表达较低，但注射裸mRNA的肿瘤在第2天和第5天显示出可检测的表达。

实施例8：三顺反子自复制RNA分子和编码三顺反子自复制RNA分子的质粒的三个治疗序列中每一个的蛋白表达

产生长度为10,429bp的编码sFLT3L、IL-12和XCL1的自复制RNA分子(SR-Tx；图14A)并表征其体外蛋白表达。为了比较，还产生编码长度为13,978pm的编码sFLT3L、IL-12和XCL1的自复制RNA分子的质粒(pSR-Tx；图14B)，并进行测试。还显示了转染对照(TC)。

将HEK293T细胞以200K细胞/孔的密度接种于透明平底12孔板中，并与浓度为每孔1μg的载体+每孔3μL Lipofetamine3000+每孔2μL P3000或每孔3lipofectamine信使maxP3000孵育48小时。通过ELISA定量c3-Tx的sFLT3L、XCL1和IL-12蛋白表达。检测自复制RNA(SR-Tx)和编码自复制RNA的质粒(pSR-Tx)的sFlt3L(图15A)、IL-12(图15B)和XCL1(图15C)蛋白表达。

实施例9：由三顺反子自复制RNA分子和编码三顺反子自复制RNA分子的质粒表达的蛋白的功能测定

进行功能测定以确定由三顺反子自复制RNA分子和编码三顺反子自复制RNA分子的质粒表达的蛋白在如实施例2中所述的体外孵育后是否具有生物学功能。

为了测量IL-12活性，如上文实施例3中所述进行Quanti Blue/SEAP测定。图16显示了从三顺反子自复制RNA分子和编码三顺反子自复制RNA分子的质粒表达的IL-12p70具有生物学功能。

如上文实施例3中所述，基于sFlt3L条件培养基的BMDC分化来测量Flt3L活性。通过对CD11c

实施例10：编码三顺反子自复制RNA分子的环状DNA载体的无细胞生产

在此描述的是合成编码用于免疫调节的三顺反子自复制RNA分子的DNA载体的示例性方法。本领域普通技术人员将认识到，可以使用其他方法来获得类似的自复制RNA分子或具有本说明书涵盖的其他序列的自复制RNA分子。

首先，将编码5'UTR非结构蛋白1-4(snP1-nsP4)和三个免疫调节基因(此处表示为sFlt3L、IL-12和XCL1)的各个DNA片段与3'UTR多腺苷酸化序列和质粒骨架通过golden-gate组装过程组装在一起(图18A和18B)。产物是大小为约13kb的环状质粒(图18B)。该环状质粒使用phi29聚合酶进行滚环扩增，并使用限制性酶进行消化。将DNA连接以形成环状DNA载体。

实施例11：使用脉冲电场介导的环状DNA载体的施用来治疗癌症

在此描述了作为癌症治疗的一部分而施用本发明的环状DNA载体的示例性方法。

在该实施例中，接受治疗的患者是已被诊断为患有结节性黑色素瘤的个体，其特征在于存在直径为约10mm的肿瘤。黑色素瘤的治疗包括施用含有免疫调节环状DNA载体的药物组合物并结合向肿瘤传输脉冲电场治疗。治疗在门诊进行。

根据本文和国际专利公布WO 2019/178500中描述的方法合成编码三种免疫调节蛋白(即，XCL1、sFlt3L和IL-12，如图1A或2A中所示)的环状DNA载体。含有环状DNA载体的组合物以冻干粉末的形式提供在含有药学上可接受的盐作为缓冲剂的一次性玻璃小瓶中。冻干组合物中DNA的量为约200μg。临床专业人员向小瓶中添加200L无菌水以重悬环状DNA载体，从而制备1.0mg/mL的液体药物组合物用于施用。将含有环状DNA载体的药物组合物装入配备有30号针头的无菌注射器中。

使用30号针，医师在直接视觉和/或计算机断层扫描(CT)引导下将含有环状DNA载体的药物组合物直接施用到肿瘤中，避开大血管。

在瘤内注射药物组合物的三十分钟内，医师将针电极插入注射部位处或注射部位附近并传输瘤内脉冲电场。通过生成一系列八个方波来传输电场，每个方波持续时间为50ms，振幅为500V。大约每一秒传送一次脉冲。脉冲电场传输后完成治疗。

治疗后每周通过CT监测患者的肿瘤进展情况。肿瘤直径的减小(即小于10mm)证实了治疗是有效的。

实施例12：三顺反子自复制RNA分子的合成

此处描述了合成用于免疫调节的三顺反子自复制RNA分子的示例性方法。本领域普通技术人员将认识到，可以使用其他方法来获得类似的自复制RNA分子或具有本说明书涵盖的其他序列的自复制RNA分子。

首先，将编码5'UTR非结构蛋白1-4(snP1-nsP4)和三个免疫调节基因(此处表示为XCL1、sFlt3L和IL-12)的各个DNA片段与3'UTR多聚腺苷酸化序列和质粒骨架通过golden-gate组装过程组装在一起(图14A和14B)。产物是大小为约13.5kb的环状质粒(图14B)。接下来，通过用限制性酶I-SceI消化来切割环状质粒，以产生具有5'T7启动子(P

图14E示出了最终产物——5'加帽的自复制RNA分子，其具有延长的聚腺苷酸化序列、从自复制RNA分子转录RNA的复制酶编码序列(nsP1、nsP2、nsP3和nsP4)以及三顺反子免疫调节序列，所述三顺反子免疫调节序列具有树突细胞化学引诱剂编码基因(即，XCL1)、树突细胞生长因子或激活剂编码基因(即，sFlt3L)和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因(即，IL-12)。

实施例13：使用脉冲电场介导的自复制RNA分子的施用来治疗癌症

此处描述了作为癌症治疗的一部分而施用本发明的自复制RNA分子的示例性方法。

在该实施例中，接受治疗的患者是已被诊断为患有头颈鳞状细胞癌(HNSCC)的个体，其特征在于存在具有约10cm

根据实施例1的方法合成编码三种免疫调节基因(即XCL1、sFlt3L和IL-12)的自复制RNA分子，并以冻干粉末的形式提供在含有药学上可接受的盐作为缓冲剂的一次性玻璃小瓶中。冻干组合物中自复制RNA的量为约200μg。临床专业人员向小瓶中添加200L无菌水以重悬自复制RNA，从而制备1.0mg/mL的液体药物组合物用于施用。将含有自复制RNA的药物组合物装入配备有30号针头的无菌注射器中。

使用30号针，医师在直接视觉和/或计算机断层扫描(CT)指导下将含有自复制RNA的药物组合物直接施用到肿瘤中，避开大血管。

在瘤内注射含有自复制RNA的药物组合物的三十分钟内，医师将针电极插入注射部位处或注射部位附近并传输瘤内脉冲电场。通过生成一系列八个方波来传输电场，每个方波持续时间为50ms，振幅为500V。大约每一秒传送一次脉冲。脉冲电场传输后完成治疗。

治疗后每周通过CT监测患者的肿瘤进展情况。肿瘤体积缩小(即小于10cm

其他实施方案

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个独立出版物或专利申请被具体且单独地表明通过引用并入一样。

尽管已经结合其具体实施方案描述了本发明，但是应当理解，它能够进行进一步的修改，并且本申请旨在涵盖对本发明的任何变化、使用或修改，所述变化、使用或修改遵循本发明一般原理并包括属于本发明所属领域内的已知或惯常实践的本公开内容的偏离，并且可以应用于上文阐述的基本特征，并且落入权利要求的范围。

编号的实施方案

本文所述的技术的一些实施方案可以根据以下编号段落中的任一个来定义：

1.核酸载体，其包含树突细胞化学引诱剂编码基因、树突细胞生长因子或激活剂编码基因和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因。

2.段落1的核酸载体，其中所述树突细胞化学引诱剂编码基因是XCL1、XCL2、CCL5或CCL4。

3.段落1或2的核酸载体，其中所述树突细胞生长因子或激活剂是FLT3L、GMCSF或CD40L。

4.段落1-3中任一项的核酸载体，其中所述淋巴细胞信号传导蛋白是IL-12、IL-15、CXCL9或CXCL10。

5.段落1-4中任一项的核酸载体，其中所述核酸载体包含分别驱动树突细胞化学引诱剂编码基因、树突细胞生长因子或激活剂编码基因和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因表达的第一、第二和第三启动子。

6.段落1-4中任一项的核酸载体，其中所述核酸载体包含驱动树突细胞化学引诱剂编码基因、树突细胞生长因子或激活剂编码基因和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因表达的单个启动子。

7.核酸载体，其包含XCL1编码基因、FLT3L编码基因和IL-12编码基因。

8.核酸载体，其包含XCL1编码基因、FLT3L编码基因和IL-15编码基因。

9.核酸载体，其包含XCL1编码基因、GMCSF编码基因和IL-15编码基因。

10.段落1-9中任一项的核酸载体，其是DNA载体。

11.段落10的核酸载体，其是环状DNA载体。

12.段落11的核酸载体，其中环状DNA载体缺乏细菌复制起点和/或耐药基因。

13.段落1-12中任一项的核酸载体，其中所述核酸载体的长度为2.5kb至20kb。

14.段落13的核酸载体或环状DNA载体，其中所述核酸载体的长度为3.5kb至10kb。

15.环状DNA载体，在5'至3'方向包含：

(a)启动子；

(b)自复制RNA分子编码序列，其包含(i)从自复制RNA分子转录RNA的复制酶编码序列和(ii)一个或多个异源蛋白编码基因；和

(c)聚腺苷酸化序列，

其中环状DNA载体缺乏细菌复制起点和/或耐药基因。

16.段落15的环状DNA载体，其中所述一个或多个异源蛋白编码基因包含一个或多个免疫调节蛋白编码基因。

17.段落16的环状DNA载体，其中所述一个或多个免疫调节蛋白编码基因包括树突细胞化学引诱剂编码基因、树突细胞生长因子或激活剂编码基因和/或淋巴细胞信号传导蛋白编码基因。

18.段落17的环状DNA载体，其中所述树突细胞化学引诱剂编码基因是XCL1、XCL2、CCL5或CCL4。

19.段落17或18的环状DNA载体，其中所述树突细胞生长因子或激活剂是FLT3L、GMCSF或CD40L。

20.段落17-19中任一项的环状DNA载体，其中所述淋巴细胞信号传导蛋白是IL-12、IL-15、CXCL9或CXCL10。

21.段落15-20中任一项的环状DNA，其中核酸载体的长度为10kb至13kb。

22.段落21的环状DNA载体，其中核酸载体的长度为约11.5kb。

23.药物组合物，其包含：(a)段落1-14中任一项的核酸载体或段落15-22中任一项的环状DNA载体和(b)药学上可接受的载体。

24.一种治疗个体中的癌症的方法，所述方法包括以治疗癌症的有效量施用段落1-14中任一项的核酸载体、段落15-22中任一项的环状DNA载体或段落23的药物组合物。

25.一种调节有此需要的个体中的肿瘤微环境的方法，所述方法包括：

(a)向个体施用段落1-14中任一项的核酸载体、段落15-22中任一项的环状DNA载体或段落23的药物组合物；和

(b)将电场传输至肿瘤微环境中，其中电场促进核酸分子或环状DNA载体转移至肿瘤细胞中，从而将调节蛋白编码基因递送至肿瘤细胞以调节个体中的肿瘤微环境。

26.段落25的方法，其中步骤(b)包括传输脉冲电场。

27.段落26的方法，其中所述脉冲电场通过肿瘤内定位的电极传输。

28.段落24-27中任一项的方法，其中所述核酸载体、环状DNA载体或药物组合物是瘤内施用的。

29.段落24-27中任一项的方法，其中核酸载体、环状DNA载体或药物组合物是全身施用的。

30.段落24-29中任一项的方法，其中所述核酸载体、环状DNA载体或药物组合物与另外的抗癌治疗组合施用。

31.一种调节有此需要的个体中的肿瘤微环境的方法，所述方法包括：

(a)施用包含树突细胞化学引诱剂编码基因的非病毒核酸载体；和

(b)将电场传输至肿瘤微环境中，其中电场促进非病毒核酸载体转移至肿瘤细胞中，从而将树突细胞化学引诱剂编码基因递送至肿瘤细胞以调节个体中的肿瘤微环境。

32.段落31的方法，其中步骤(b)包括传输脉冲电场。

33.段落32的方法，其中所述脉冲电场通过肿瘤内定位的电极传输。

34.段落31-33中任一项的方法，其中所述非病毒核酸载体是瘤内施用的。

35.段落31-33中任一项的方法，其中所述非病毒核酸载体是全身施用的。

36.段落31-35中任一项的方法，其中所述非病毒核酸载体与另外的抗癌治疗组合施用。

本文所述的技术的其他实施方案可以根据以下编号段落中的任一个来定义：

1.一种免疫调节性自复制RNA分子，其包含(a)从所述自复制RNA分子转录RNA的复制酶编码序列和(b)包含树突细胞化学引诱剂编码基因和一个或多个免疫调节蛋白编码基因的多顺反子免疫调节序列。

2.段落1的免疫调节性自复制RNA分子，其中所述一个或多个另外的免疫调节蛋白编码基因包含树突细胞生长因子或激活剂编码基因。

3.段落1或2的免疫调节性自复制RNA分子，其中所述一个或多个另外的免疫调节蛋白编码基因包含淋巴细胞信号传导蛋白编码基因。

4.段落1的免疫调节性自复制RNA分子，其中所述免疫调节序列包含树突细胞化学引诱剂编码基因、树突细胞生长因子或激活剂编码基因和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因。

5.段落1-4中任一项的免疫调节性自复制RNA分子，其中所述树突细胞化学引诱剂编码基因是XCL1、XCL2、CCL5或CCL4。

6.段落2或4的免疫调节性自复制RNA分子，其中树突细胞生长因子或激活剂是FLT3L、GMCSF或CD40L。

7.段落3或4的免疫调节性自复制RNA分子，其中淋巴细胞信号传导蛋白是IL-12、IL-15、CXCL9或CXCL10。

8.免疫调节性自复制RNA分子，其包含(a)从自复制RNA分子转录RNA的复制酶；和(b)包含XCL1编码基因、FLT3L编码基因和IL-12编码基因的三顺反子免疫调节序列。

9.免疫调节性自复制RNA分子，其包含(a)从自复制RNA分子转录RNA的复制酶；和(b)三顺反子免疫调节序列，其包含XCL1编码基因、FLT3L编码基因和IL-15编码基因。

10.免疫调节性自复制RNA分子，其包含(a)从自复制RNA分子转录RNA的复制酶；和(b)包含XCL1编码基因、GMCSF编码基因和IL-15编码基因的三顺反子免疫调节序列。

11.段落1-10中任一项的免疫调节性自复制RNA分子，其中所述自复制RNA分子的长度为5kb至20kb。

12.段落11的免疫调节性自复制RNA分子，其中所述自复制RNA分子的长度为9kb至12kb。

13.段落1-12中任一项的免疫调节性自复制RNA分子，其中所述自复制RNA分子包含5'帽。

14.段落1-13中任一项的免疫调节性自复制RNA分子，其中所述自复制RNA分子包含延长的聚腺苷酸化序列。

15.药物组合物，其包含：(a)段落1-14中任一项所述的自复制RNA分子和(b)药学上可接受的载体。

16.一种治疗个体中的癌症的方法，所述方法包括以治疗癌症的有效量向个体施用段落1-14中任一项的免疫调节性自复制RNA分子或段落15的药物组合物。

17.段落16的方法，其中所述免疫调节自复制RNA分子或所述药物组合物是瘤内施用的。

18.段落16的方法，其中免疫调节性自复制RNA分子或药物组合物是全身施用的。

19.段落16-18中任一项的方法，其中所述免疫调节性自复制RNA分子与脉冲电场治疗组合施用。

20.段落19的方法，其中所述免疫调节性自复制RNA分子与另外的抗癌治疗组合施用。

21.一种调节有此需要的个体中的肿瘤微环境的方法，所述方法包括：

(a)向个体施用自复制RNA分子，其中所述自复制RNA分子包含：(i)从所述自复制RNA分子转录RNA的复制酶编码序列；和(ii)异源调节基因；和

(b)将电场传输至肿瘤微环境中，其中电场促进自复制RNA分子转移至肿瘤细胞中，从而将异源调节基因递送至肿瘤细胞以调节个体中的肿瘤微环境。

22.段落21的方法，其中所述异源调节基因是免疫调节蛋白编码基因。

23.段落22的方法，其中所述免疫调节蛋白是化学引诱剂。

24.段落23的方法，其中所述化学引诱剂是树突细胞化学引诱剂。

25.段落24的方法，其中所述树突细胞化学引诱剂是XCL1、XCL2、CCL5或CCL4。

26.段落21-25中任一项的方法，其中所述自复制RNA分子还包含一个或多个另外的免疫调节蛋白编码基因。

27.段落26的方法，其中所述一种或多种另外的免疫调节蛋白是树突细胞生长因子或激活剂。

28.段落26或27的方法，其中所述一种或多种另外的免疫调节蛋白是淋巴细胞信号传导蛋白。

29.段落28的方法，其中所述自复制RNA分子包含XCL1编码基因、树突细胞生长因子或激活剂编码基因和淋巴细胞信号传导蛋白编码基因。

30.段落29的方法，其中所述树突细胞生长因子或激活剂是FLT3L、GMCSF或CD40L。

31.段落29或30的方法，其中所述淋巴细胞信号传导蛋白是IL-12、IL-15、CXCL9或CXCL10。

32.段落31的方法，其中所述自复制RNA分子包含XCL1编码基因、FLT3L编码基因和IL-12编码基因。

33.段落31的方法，其中所述自复制RNA分子包含XCL1编码基因、FLT3L编码基因和IL-15编码基因。

34.段落31的方法，其中所述自复制RNA分子包含XCL1编码基因、GMCSF编码基因和IL-12编码基因。

35.段落21-34中任一项的方法，其中步骤(a)包括瘤内施用。

36.段落21-34中任一项的方法，其中步骤(a)包括全身施用。

37.段落21-36中任一项的方法，其中步骤(b)包括传输脉冲电场。

38.段落37的方法，其中所述脉冲电场通过肿瘤内定位的电极传输。

其他实施方案在权利要求内。