一种千斤拔标准汤剂中染料木苷的含量测定方法及特征图谱的构建方法

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，尤其是涉及一种千斤拔标准汤剂中染料木苷的含量测定方法及特征图谱的构建方法。

背景技术

千斤拔原植物为豆科植物千斤拔Flemingia philippinensis Merr.et Rolfe的干燥根或大叶千斤拔F.macrophylla(Willd.)Prain的干燥根和茎。常生于海拔50～300米的平地旷野或山坡路旁草地上。在中国云南、四川、贵州、湖北等地分布,其中以云南的资源最为丰富根部具有祛风除湿、舒筋活络、强筋壮骨及消炎止痛等功效,千斤拔属植物的主要活性成分为黄酮类物质,此外还含有香豆素类、萜类、挥发性油类、脂肪酸类等物质,具有抗炎镇痛、抗病原微生物、抗氧化、抗血栓、保护神经及脑组织等功能。

文献《大叶千斤拔根、茎的HPLC指纹图谱及成分差异研究》中公开了：为了研究大叶千斤拔根、茎的化学成分差异,首先建立大叶千斤拔根的HPLC指纹图谱,对根、茎的成分差异进行定性分析；其次,针对二者共有成分染料木苷、6"-O-丙二酰染料木苷、染料木素建立含量测定方法,进行定量评价。采用Agilent Zorbax SB-phenyl(4.6mm×250mm,5μnm)色谱柱,以乙腈-0.5％乙酸水溶液为流动相,梯度洗脱,流速1.0mL·min

以上文献的研究对象均为千斤拔药材，与之不同的是，千斤拔标准汤剂是由千斤拔饮片经水提、浓缩、干燥等而成的冻干粉，与药材和饮片相比，已失去其固有的形态，以及对应的活性成分也有相应的变化。目前对千斤拔药材质量控制较少，难以全面反映其内在质量，而目前对于千斤拔高效液相定性及定量检测技术的文献报道非常少。因此，有必要建立一种千斤拔标准汤剂的HPLC含量测定及特征图谱方法，为有效控制和较全面评价千斤拔标准汤剂的质量提供依据。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种千斤拔标准汤剂中染料木苷的含量测定方法及特征图谱的构建方法，为千斤拔标准汤剂的质量和一致性评价提供保障。

本发明的第一方面，提供一种千斤拔标准汤剂中染料木苷的含量测定方法，采用外标法，通过高效液相色谱法测定，所述高效液相色谱法的条件包括：

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

以甲醇为流动相A，以体积百分数为0.1～0.3％的甲酸水溶液为流动相B，梯度洗脱；

所述梯度洗脱的条件为：

表中百分号的含义为体积百分数。

根据本发明的一些实施例，所述流动相B为体积百分数为0.1～0.2％的甲酸水溶液。

优选地，所述流动相B为体积百分数为0.1％的甲酸水溶液。

根据本发明的一些实施例，所述色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。

其中，所述色谱柱可以为Agilent Eclipse Plus C18和Agilent ZORBAX SB-C18。

根据本发明的一些实施例，所述色谱柱的规格为4.6mm×250mm，5μm。

根据本发明的一些实施例，所述高效液相色谱法的条件还包括：流动相的流速为0.8～1.2mL/min。

优选地，所述高效液相色谱法的条件还包括：流动相的流速为1.0mL/min。

根据本发明的一些实施例，所述高效液相色谱法的条件还包括：色谱柱的柱温为30～35℃。

优选地，所述高效液相色谱法的条件还包括：色谱柱的柱温为30℃。

根据本发明的一些实施例，所述高效液相色谱法的条件还包括：进样量为5～20μL。

优选地，所述高效液相色谱法的条件还包括：进样量为20μL。

根据本发明的一些实施例，所述高效液相色谱法的条件还包括：检测波长为260nm。

根据本发明的一些实施例，所述高效液相色谱法的检测器为紫外检测器。

根据本发明的一些实施例，所述高效液相色谱的理论塔板数按染料木苷峰计算，不低于2000。

根据本发明的一些实施例，所述含量测定方法还包括供试品溶液的制备；所述制备步骤包括：将千斤拔标准汤剂与溶剂混合，超声，即得。

根据本发明的一些实施例，所述供试品溶液的质量浓度为1～10mg/mL。

进一步地，所述试品溶液的溶剂为水或醇水混合溶液。

更进一步地，所述溶剂为体积百分数为75～95％的甲醇水溶液、体积百分数为75～95％的乙醇水溶液或水；优选地，所述溶剂为体积百分数为85～95％的甲醇水溶液；更优选地，所述溶剂为体积百分数为95％的甲醇水溶液。

根据本发明的一些实施例，本发明所述超声条件包括以下i-iii中的至少一项：

i.功率：400～600W；

ii.频率：30～50kHz；

iii.时间：20～40min。

根据本发明的一些实施例，所述含量测定方法还包括对照品溶液的制备，所述制备步骤包括：将对照品与溶剂混合，即得。

根据本发明的一些实施例，所述对照品为染料木苷。

根据本发明的一些实施例，所述对照品溶液的质量浓度为20～100μg/mL。

进一步地，所述对照品溶液的溶剂为水或醇水混合溶液。

更进一步地，所述溶剂为体积百分数为75～95％的甲醇水溶液、体积百分数为75～95％的乙醇水溶液或水。

优选地，所述溶剂为体积百分数为85～95％的甲醇水溶液。

更优选地，所述溶剂为体积百分数为95％的甲醇水溶液。

本发明的第二方面，提供一种千斤拔标准汤剂特征图谱的构建方法，将对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液分别经高效液相色谱法测定，标定共有峰，即得；所述高效液相色谱法采用上述的条件。

根据本发明的一些实施例，所述特征图谱包括五个特征峰，其中，以峰2染料木苷为参照峰，计算其余各特征峰与所述参照峰的相对保留时间，所述相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，所述规定值为：峰1：0.64、峰3：1.30。

根据本发明的一些实施例，所述对照药材溶液的制备步骤包括：将对照药材与溶剂混合，超声，即得。

根据本发明的一些实施例，所述对照药材溶液的质量浓度为50～150mg/mL。

根据本发明的一些实施例，本发明所述溶剂为水或醇水混合溶液。

根据本发明的一些优选的实施例，所述溶剂为体积百分数为75～95％的甲醇水溶液、体积百分数为75～95％的乙醇水溶液或水。

优选地，所述溶剂为体积百分数为85～95％的甲醇水溶液。

更优选地，所述溶剂为体积百分数为95％的甲醇水溶液。

根据本发明的一些实施例，所述超声条件包括以下i-iii中的至少一项：

i.功率：400～600W；

ii.频率：30～50kHz；

iii.时间：20～40min。

本发明的第三方面，提供上述的含量测定方法或构建方法在检测千斤拔标准汤剂的质量中的应用。

有益效果：

本发明提供了一种千斤拔标准汤剂特征图谱及含量测定方法，确定了染料木苷等三个共有峰，所构建的HPLC特征图谱中色谱峰实现较好分离，特征图谱信息丰富，色谱峰形好，可以全面的反应千斤拔标准汤剂的主要化学成分信息，检测方法具有良好的稳定性和重复性，便于推广应用；

本发明基于高效液相色谱仪构建了千斤拔标准汤剂的HPLC特征图谱，并进行特征图谱的检测，能整体控制千斤拔标准汤剂中的特征成分，能有效保证千斤拔标准汤剂的整体质量的稳定性，使千斤拔标准汤剂的质量控制技术更为完善、科学；且本方法操作简单，具有精密度高、稳定性好、重复性好及准确度高等优势，为中药材质量鉴别提供有效依据。

定义：

本发明所述的千斤拔均指千斤拔的干燥叶。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为实施例1中最佳吸收波长考察的色谱图(260nm)；

图2为实施例1中最佳吸收波长考察的色谱图(350nm)；

图3为实施例1中最佳吸收波长考察的色谱图(375nm)；

图4为实施例1中不同梯度结果色谱图；

图5为实施例1中提取超声结果色谱图；

图6为实施例1中提取溶剂用量考察结果色谱图；

图7为实施例1中染料木苷对照品特征图谱；

图8为实施例1中千斤拔对照药材特征图谱；

图9为实施例1中15批千斤拔标准汤剂特征图谱叠加图；

图10为实施例1中千斤拔标准汤剂对照特征图谱；

图11为实施例2中染料木苷对照品最大吸收图谱；

图12为实施例2中千斤拔不同水相色图谱；

图13为实施例2中千斤拔专属性色图谱；

图14为实施例2中染料木苷对照品标准曲线；

图15为对比例1中色谱柱A的结果色谱图；

图16为对比例1中色谱柱B的结果色谱图；

图17为对比例1中色谱柱C的结果色谱图；

图18为对比例2中梯度1的结果色谱图；

图19为对比例2中梯度2的结果色谱图；

图20为对比例2中梯度3的结果色谱图；

图21为对比例3中流动相为甲醇-0.1％磷酸的结果色谱图；

图22为对比例3中流动相为甲醇-0.1％甲酸的结果色谱图；

图23为对比例4中采用常规方法对染料木素的结果色谱图；

图24为对比例4中采用常规方法对染料木苷的结果色谱图；

图25为对比例4中采用常规方法对实施例1样品的结果色谱图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

本发明所述的千斤拔标准汤剂冻干粉，其制备方法如下：取千斤拔药材，除去杂质，洗净，切粗丝片，干燥，得到千斤拔饮片。取千斤拔饮片100g，置于电陶瓷壶中，加水煎煮两次：第一次加入8倍量(按质量比计)的水浸泡30min，武火煮沸后文火保持微沸90min，煎液经200目筛网趁热过滤，备用；第二次加60倍量(按质量比计)的水，武火加热煮沸后文火保持微沸60min，煎液用200目筛网趁热过滤。合并两次煎液，65℃下减压浓缩至120g左右的浸膏，分装至6mL～14mL容器中，每瓶分装体积为2mL～3mL，分装完毕后冻干，取出，轧铝盖，即得。千斤拔标准汤剂冻干粉的性质：棕色粉末；气微，味微甘涩。制备工艺符合《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》项下的相关规定。

实施例1千斤拔标准汤剂UPLC特征图谱方法的建立

1仪器和试药

1.1仪器

岛津LC-20AT高效液相色谱仪(岛津公司)；

KM-500DB型超声波清洗器(昆山美美超声仪器有限公司)；

T-214型万分之一电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；

XPE105型十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；

MWO-ABS20-DW型超纯水机(铭沃科技)；

色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(5μm，4.6*250mm)。

1.2试剂

甲醇为分析纯(批号：20211115，湖南汇虹试剂有限公司)；

甲醇为色谱纯(批号：21115198，美国天地有限公司)；

甲酸为色谱纯(批号：20210303，天津市科密欧化学试剂有限公司；)

水为怡宝水(批号：20220217，华润怡宝饮料有限公司)。

1.3试药

染料木苷(纯度99％，中国食品药品检定研究院，批号：111709-201702)；

千斤拔(中国食品药品检定研究院，批号：121502-201803)，

千斤拔标准汤剂(冻干粉)，批号：DGQJB2021070801、DGQJB2021070802、DGQJB2021070803、DGQJB2021070804、DGQJB2021070805、DGQJB2021070806、DGQJB2021070807、DGQJB2021070808、DGQJB2021070809、DGZS-PF-YL-197-210801、DGZS-PF-YL-197-210802、DGZS-PF-YL-197-210803、DGZS-PF-YL-197-210804、DGZS-PF-YL-197-210805、DGZS-PF-YL-197-210806。

2色谱条件与系统适用性试验

2.1拟定的色谱条件

色谱条件：采用Agilent Eclipse Plus C18(5μm，4.6*250mm)为色谱柱，以甲醇为流动相A，0.1％甲酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为350nm。理论板数按染料木苷峰计算应不低于2000。

规定梯度洗脱程序：

表中百分号的含义为体积百分数。

2.2溶液的制备

(1)对照品溶液的制备：取染料木苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶液制成每1mL含50μg的溶液，即得。

(2)对照药材溶液的制备：取千斤拔对照药材粉末1g，置具塞锥形瓶中，精密加入95％甲醇水溶液10mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用95％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(3)供试品溶液的制备：取本品约0.1g，置具塞锥形瓶中，精密加入95％甲醇水溶液10mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用95％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3测定法

分别取所得的对照品溶液、对照药材溶液和供试品溶液各20μL，注入至高效液相色谱仪，测定，即得。

3色谱条件考察

3.1最佳吸收波长考察

在拟定的实验条件基础上，利用紫外检测器对千斤拔标准汤剂供试品溶液进行全波长扫描，并提取供试品溶液在260nm、350nm、375nm波长下的色谱图，所得结果如图1～3所示。

结果表明，在检测波长为350nm时色谱峰信息量较大，色谱图基线更平稳，各特征峰响应值较大，故检测波长确定为350nm。

3.2梯度选择

考察了三个不同梯度下千斤拔色谱图，梯度洗脱见下表，选择梯度洗脱3时，分离度较好，最终选择梯度洗脱3。千斤拔标准汤剂不同梯度下色谱图如图4所示。

表1梯度洗脱1

表1梯度洗脱2

表2梯度洗脱3

4供试品溶液制备方法考察

4.1超声提取时间的选择

称取千斤拔冻干粉0.10g，加入95％甲醇10ml，称重，分别超声20分钟、30分钟、40分钟，称重，用提取溶剂补足失重，过滤，即得。精密吸取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，结果超声30分钟总峰面积最高，最终选择超声时间为30分钟，如图5所示。

4.2溶剂用量的选择

称取千斤拔冻干粉0.10g，加入5ml、10ml、15ml的95％甲醇，称重，超声30分钟，称重，用提取溶剂补足失重，过滤，即得。精密吸取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，结果所示，峰形相差不大，当溶剂用量为10ml时，染料木苷的峰面积最高，最终溶剂用量为10ml，如图6所示。

综上所述，确定供试品溶液制备方法的主要参数如下：取千斤拔标准汤剂冻干粉约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇水溶液30mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用50％甲醇水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

5特征图谱方法学验证

5.1重复性试验

称取千斤拔标准汤剂冻干粉约0.1g(批号DGZS-PF-YL-197-210805)，按供试品方法平行制备6份，分别进样，记录色谱图并积分，以峰2为参照峰，计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积，结果见下表，各特征峰相对保留时间小于1％，相对峰面积RSD小于5％，试验表明，本方法重复性良好。

表4千斤拔标准汤剂重复性数据(相对保留时间)

表5千斤拔标准汤剂重复性数据(相对峰面积)

5.2精密度试验

称取千斤拔标准汤剂冻干粉约0.1g(批号DGZS-PF-YL-197-210805)，按供试品方法制备，连续进样6次并记录色谱图，以峰2为参照峰，计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积，结果见下表，各特征峰相对保留时间小于1％，相对峰面积RSD小于5％，试验表明，本方法精密度良好。

表6千斤拔标准汤剂精密度数据(相对保留时间)

表7千斤拔标准汤剂精密度数据(相对峰面积)

5.3稳定性试验

称取千斤拔标准汤剂冻干粉约0.1g(批号DGZS-PF-YL-197-210805)，按供试品方法制备，分别在12h内不同时间点进样，记录色谱图并积分，以峰3为参照峰，计算各特征峰相对保留时间和相对峰面积，结果见下表，各特征峰相对保留时间小于1％，相对峰面积RSD小于5％，试验表明，在12h内供试品溶液稳定性良好。

表8千斤拔标准汤剂稳定性数据(相对保留时间)

表9千斤拔标准汤剂稳定性数据(相对峰面积)

综上所述：各特征峰相对保留时间的RSD在以上各项考察中均符合要求，该方法良好，并将上述3个特征峰纳入后续考察。

6特征图谱的建立及共有峰的指认

将15批千斤拔标准汤剂HPLC指纹图谱导入“中药色谱特征图谱相似度评价系统软件(2012版)”中生成叠加图及对照特征图谱，选择分离度较好、峰面积较大、峰形较好的3个共有峰作为特征峰。通过上述系列试验优化，在最佳特征图谱的色谱条件下，对各个峰采用对照药材定位，供试品溶液色谱中应呈现3个特征峰；用对照品定位指认，峰2为染料木苷，染料木苷峰面积较高，为主要药效成分，故以峰2(染料木苷)作为S峰，分析15批次千斤拔标准汤剂指纹图谱，计算3个共有峰相对于染料木苷的相对保留时间。染料木苷对照品特征图谱见图7、对照药材特征图谱见图8、15批千斤拔标准汤剂特征图谱叠加图见图9、千斤拔标准汤剂对照特征图谱见图10。由图9可见，15批标准汤剂中均有三个对应的特征峰。

表10 15批千斤拔标准汤剂相对保留时间结果

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7特征图谱标准的建立

综上所述，确定特征图谱的标准为结论：供试品溶液色谱中应呈现3个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中3个特征峰的保留时间相对应，其中1个峰的保留时间应与相应对照品参照物峰的保留时间相对应。与染料木苷参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内，规定值为0.64(峰1)、1.30(峰3)。

实施例2千斤拔标准汤剂UPLC含量测定方法建立

基于实施例1中的千斤拔标准汤剂的UPLC特征图谱的构建方法，实施例2还进行了如下的方法学考察，建立了千斤拔标准汤剂的UPLC含量测定方法，具体包括：

1仪器和试药

1.1仪器

岛津LC-20AT高效液相色谱仪(岛津公司)；

KM-500DB型超声波清洗器(昆山美美超声仪器有限公司)；

T-214型万分之一电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；

XPE105型十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；

Agilent Eclipse Plus C18色谱柱(5μm，4.6*250mm)；

Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(5μm，4.6*250mm)。

1.2试剂

甲醇为分析纯(批号：20211115，湖南汇虹试剂有限公司)；

甲醇为色谱纯(批号：21115198，美国天地有限公司)；

甲酸为色谱纯(批号：20210303，天津市科密欧化学试剂有限公司)；

水为怡宝水(批号：20220217，华润怡宝饮料有限公司)。

1.3试药

染料木苷(纯度99％，中国食品药品检定研究院，批号：111709-201702)；

千斤拔标准汤剂(冻干粉)，批号：DGQJB2021070801、DGQJB2021070802、DGQJB2021070803、DGQJB2021070804、DGQJB2021070805、DGQJB2021070806、DGQJB2021070807、DGQJB2021070808、DGQJB2021070809、DGZS-PF-YL-197-210801、DGZS-PF-YL-197-210802、DGZS-PF-YL-197-210803、DGZS-PF-YL-197-210804、DGZS-PF-YL-197-210805、DGZS-PF-YL-197-210806。

2拟定的色谱条件

21色谱条件与系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相A，0.1％甲酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为260nm，流速为1.0ml/min，柱温为30℃，理论板数按染料木苷峰计算应不低于2000。

规定梯度洗脱程序：

2.2供试品溶液的制备

取千斤拔冻干粉约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入95％甲醇10ml，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30min，放冷，称重，95％甲醇补足失重，过滤，即得。

2.3对照品溶液的制备

取染料木苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.05mg的溶液，即得。

2.4测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

3色谱条件考察

3.1被测成分选择

选择染料木苷作为评价指标，对千斤拔饮片标准汤剂含量测定的色谱条件和系统适应性进行验证，并且对样品的前处理方法进行考察，确定供试品制备方法。

3.2波长的选择

对染料木苷进行全波长扫描，最终选择染料木苷最大吸收波长260nm作为含量测定检测波长，结果如图11所示。

由结果如图11可知，波长为190-800nm之间对染料木苷进行扫描时，光谱图中在260nm波长下出现大的波峰，30.747为染料木苷的保留时间，1.00为缩放倍率，故260nm为染料木苷的最大吸收波长。

3.3水相的选择

考察了甲醇和不同浓度的甲酸水，最终选择0.1％甲酸水作为水相，样品色谱图中峰形较好，分离度较好，结果如图12所示。

4供试品制备方法考察

4.1超声提取时间的选择

考察了不同超声时间对标准汤剂色谱图的影响，样品称取0.1g，分别超声20分钟、30分钟、40分钟，结果不同超声时间染料木苷含量分别为1.17mg/g，1.52mg/g，1.35mg/g，超声30分钟时染料木苷含量最高，最终选择超声时间30分钟。

5含量测定方法学验证

5.1专属性

取千斤拔标准汤剂(批号DGZS-PF-YL-197-210805)，制备供试品溶液。按上述色谱条件测定，绘制染料木苷对照品、千斤拔标准汤剂供试品、空白(95％甲醇)及其辅料(糊精)色谱图。在供试品色谱图中，呈现与对照品相同保留时间的色谱峰，空白无干扰。试验表明：本方法专属性良好，结果如图13所示。

5.2线性关系考察

取染料木苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.50mg的溶液，为对照品母液。结果见下表。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，作标准曲线，结果见图14，y＝114500x-13381，R

表11染料木苷浓度及峰面积数据

5.3重复性试验

称取千斤拔标准汤剂冻干粉约0.10g(批号DGZS-PF-YL-197-210805)，按供试品方法平行制备6份，依法测定，记录色谱图并积分，计算染料木苷的峰面积和含量，结果见下表，含量RSD值均小于5％，试验表明：本方法重复性良好。

表12千斤拔标准汤剂重复性含量数据

5.4精密度试验

称取千斤拔标准汤剂冻干粉约0.10g(批号DGZS-PF-YL-197-210805)，制备供试品溶液，连续进样6次，依法测定，记录色谱图并积分，以染料木苷为参照峰，计算峰面积，结果见下表，参照峰峰面积RSD小于2％，试验表明：本方法精密度良好。

表13千斤拔标准汤剂精密度峰面积数据

5.5稳定性试验

稳定性试验称取千斤拔标准汤剂冻干粉约0.10g(批号DGZS-PF-YL-197-210805)，制备供试品溶液，分别在12h内不同时间点进样，依法测定，记录色谱图并积分，计算染料木苷的峰面积，结果见下表，参照峰峰面积RSD小于3％，试验表明：供试品溶液在12小时内峰面积基本稳定。

表14千斤拔标准汤剂稳定性峰面积数据

5.6中间精密度试验

称取千斤拔标准汤剂冻干粉约0.10g(批号DGZS-PF-YL-197-210805)，按供试品方法平行制备6份，于不同分析人员、不同仪器下依法测定，记录色谱图并积分，计算染料木苷的峰面积和含量，结果见下表，与重复性测定结果含量的RSD在10％内，试验表明：本方法中间精密度良好。

表15千斤拔标准汤剂中间精密度含量数据

5.7加样回收率试验

称取已测定含量的千斤拔标准汤剂冻干粉6份(批号DGZS-PF-YL-197-210805)，每份约0.05g，精密称定，分别加入染料木苷适量，按供试品溶液制备方法处理，依法测定，记录色谱图并积分，结果见下表，回收率在90％～108％的规定范围之间，RSD小于3％，试验表明：本方法加标回收率较好。

表16千斤拔标准汤剂准确度数据

5.8耐用性

称取千斤拔标准汤剂冻干粉约0.10g(批号DGZS-PF-YL-197-210805)，制备供试品溶液。依法测定，记录色谱图并积分，以染料木苷为参照峰，计算含量，结果见下表。在不同的色谱条件下结果发现色谱流速影响较小，但是因染料木苷分离度原因，柱温应控制再30摄氏度最佳，柱子为Agilent Eclipse Plus C18。

表17千斤拔标准汤剂耐用性数据

6样品含量测定

取15批千斤拔标准汤剂冻干粉，按上述方法测定，利用外标法计算染料木苷的含量，结果见表18，染料木苷的含量范围为4.87～7.74mg/g，均值为6.37mg/g，均值的±3SD范围为4.01～8.72。综合15批标准汤剂数据分布，确定以均值±3SD为染料木苷含量限度范围为：每1g千斤拔标准汤剂冻干粉中含染料木苷(C

表18 15批千斤拔标准汤剂中染料木苷含量

结论：15批标准汤剂染料木苷含量范围为1.3～3.4mg/g，平均含量为2.2mg/g，±30％含量范围1.6～2.9mg/g，±3SD含量范围0.2～4.2mg/g，3SD值为2.0。综合15批标准汤剂数据分布，数据偏差较大，可采用SD的算法，上限不超过3SD，下限为实测值的最低值，即确定1g标准汤剂含染料木苷限度范围为：1.3～4.2mg。

千斤拔含量测定的补充研究

色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(5μm，4.6*250mm，SN：USUXA42511)；以甲醇为流动相A，0.1％甲酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为260nm，柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml，理论板数按染料木苷峰计算应不低于2000。

供试品溶液的制备：取本品冻干粉约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入95％甲醇10ml，称定重量，超声处理(500W，40Kz)30分钟，放冷，称重，用95％甲醇补足失重，摇匀，滤过，即得。

对照品溶液的制备取染料木苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.05mg的溶液，即得。

测定法分别精密吸取参照物溶液、供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

对比例1不同色谱柱的对比

以流速为每分钟1.0ml，柱温30℃，按“规定梯度洗脱程序”进行梯度洗脱，考察三种不同的色谱柱，考察色谱峰的变化，对千斤拔含量测定色谱条件进行确定。

表19对比例1中色谱柱的类型

根据结果可知，采用3种不同的色谱柱，每种色谱柱均能达到分离度要求，并且峰形与出峰时间也比较好，体现出千斤拔含量方法适应性优秀，耐用性强。实验结果如图15～17所示。

对比例2不同梯度的对比

分别以不同的梯度方法，柱温30℃，按预设色谱柱(Agilent Eclipse Plus C18)，流动性进行洗脱，考察三种不同梯度方法的变化，对千斤拔含量测定色谱条件进行确定。

表20梯度1

表21梯度2

表22梯度3

由色谱图可知，梯度方法为3(即实施例1中规定梯度程序)时，峰形较好，分离程度较好，基线较平稳。因此，千斤拔含量方法为梯度3，色谱图结果如图18～20所示。

对比例3不同流动相种类的对比

以流速为每分钟1.0ml，柱温30℃，按“规定梯度程度”进行梯度洗脱，考察A：甲醇-0.1％磷酸；B:甲醇-0.1％甲酸；两种不同的流动相，采用特征图谱波长350nm，考察色谱峰的变化，对千斤拔测定色谱条件进行确定。

在含量方法比较考察中，0.1％磷酸与0.1％甲酸的流动相分离效果无明显区别，因其含量方法与特征方法，除检测波长不一致外，其余方法均一致；为更清楚探讨0.1％磷酸与0.1％甲酸的流动相的比较，考虑采用特征方法，进行不同流动相的考察，发现在部分峰中，0.1％甲酸的流动相优于0.1％磷酸的流动相，固采用为保证实验的简洁性，就将含量方法也采用与0.1％甲酸的流动相，实验结果如图21～22所示。

对比例4与常规色谱条件对比

常规色谱条件：色谱柱：Agilent Zorbax SB C

采用常规色谱条件中的方法进行测定，发现样品中染料木苷的峰形不佳，严重前沿且未完全达到基线分离，分离度不佳，故常规色谱条件的方法不适用于染料木苷的含量测定，实验结果如图23～25所示。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。