一种黄曲霉素B1的检测方法

技术领域

本发明涉及黄曲霉检测技术领域，更具体地说，它涉及一种黄曲霉素B1的检测方法。

背景技术

中药材在中国有着悠久的使用历史，随着越来越多的中药被用于疾病治疗，中药安全性问题逐渐暴露出来。中药材的培育大多在土壤中进行，其在生长、收获和储存过程中都可能被霉菌毒素感染，从而增加中药引起健康问题的几率。此外，农作物的培育也是在土壤中进行，因此也同样存在容易被霉菌毒素感染的问题。部分西药由于基质的原因，存放不当也会出现类似问题。目前，已识别出500多种不同的霉菌毒素，其中最常见和最受关注的是黄曲霉毒素类(Aflatoxins，AFs)，有些中药如薏苡仁、酸枣仁和甘草等很容易被AFs污染。

目前已分离鉴定出的黄曲霉毒素有20余种，主要有黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2四类。在这些毒素中毒性最大的是黄曲霉毒素B1(AflatoxinB1，AFB1)，AFB1不仅能直接损害人体的器官，还会破坏动物肠道菌群平衡，对动物的正常免疫功能、生殖功能和生长发育都有较大的影响。AFB1的污染严重影响了药品、食品的安全性，因此，需要加强对AFB1的检测，从而加强药品、食品的安全性，进而更好的保护人类身体健康。而目前检测AFB1的方法主要是色谱技术，这些方法具有高的准确度，但存在预处理繁琐，耗时久，不能快速筛选等缺点。为了克服上述限制，其他检测技术如霉菌毒素检测试剂盒、表面等离子体共振、电化学和表面增强拉曼光谱等技术被陆续开发用来检测AFB1。

荧光适配体传感技术是一种利用适配体作为识别元件，荧光团作为指示剂的技术。在一定的激发波长下照射时，它们可以将被分析样品的理化信息转化为荧光信号。然而，在应用过程中，发现该类传感器也存在许多难以解决的问题，比如，有机染料荧光团发光时间短，易受外界影响，稳定相差，金属量子点的毒性大，成本高等。因此，需要开发更稳定性、更廉价、易得、毒性低的材料来制备荧光传感器。

磁固相萃取技术(Magnetic solid phase extraction，MSPE)是分析化学中一项非常重要的前处理技术，利用磁场从混合溶液中收集和分离分析物，从而避免了繁琐的沉降、过滤和离心过程，MSPE具有接触面积大、扩散距离短、试剂消耗少等优点，还具有良好的提取能力和效率，广泛应用于样品的分离和分析物的富集。许多具有大比表面积的纳米材料已被用作MSPE材料。新型MSPE材料的使用推动了MSPE技术向简单、高效、快速和可持续的目标前进。

氧化石墨烯(Graphene oxide，GO)是单原子碳层结构，具有非常大的比表面积，可以通过静电键合或π-π协同相互作用吸附物质，对芳香族化合物具有高吸附容量和快速吸附平衡作用。此外，GO可用作SERS基底以增强拉曼信号(Graphene-enhanced Ramanscattering，GERS)，其不仅拥有化学电荷转移特性，而且可以观察到吸附在石墨烯上的荧光染料的荧光猝灭效应，并获得它们的拉曼光谱信号。由于观察到的荧光信号横截面大得多，因此拉曼特性通常会受到强荧光背景的干扰，甚至被淹没。石墨烯基板提供了一种直接有效的方法来测量共振激发下荧光染料的拉曼散射光谱。而且，在生物传感器中，GO本身不仅具有荧光发射特性，还可以淬灭荧光，覆盖从近红外到紫外的宽波段。这种光学特性，既作为受体又作为供体，为科学家们提供了多种可能性来设计使用荧光信号检测目标的检测模式。

发明内容

本发明的目的是提供一种黄曲霉素B1的检测方法，将简便的适配体荧光光谱技术与特异性的适配体识别技术以及快速磁分离技术相结合，以实现对AFB1的快速检测。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种黄曲霉素B1的检测方法，包括以下步骤：

S1.制备捕获探针MGO-apt；

S2.制备荧光探针N-CDs-cDNA；

S3.结合捕获探针MGO-apt和荧光探针N-CDs-cDNA的荧光检测技术检测AFB1。

本发明进一步设置为：所述制备捕获探针MGO-apt具体操作如下：

(1)水热法合成Fe

(2)使用芳香族重氮盐修饰MGO，获得表面修饰氨基的MGO-NH

(3)适配体偶联在MGO-NH

本发明进一步设置为：所述制备荧光探针N-CDs-cDNA具体操作如下：先以对苯二胺和柠檬酸为前体，以水为溶剂，通过水热碳化来制备N-CDs碳点，活化碳点表面羧基，与cDNA-NH

综上所述，本发明具有以下有益效果：本发明在纳米材料表面修饰功能基团后，将快速磁分离技术、特异性的适配体技术和荧光光谱技术相结合，实现对AFB1的快速检测，为AFB1的检测提供了新的思路与方法。

附图说明

图1是本发明中MGO的透射电镜图(A)和MGO的尺寸分布图(B)；

图2是本发明中MGO的X射线粉末衍射谱图；

图3是本发明中Fe

图4是本发明中GO(a)、MGO(b)、MGO-NH

图5是本发明中MGO(a)和MGO-NH

图6是本发明中N-CDs的透射电镜图(A)和N-CDs的尺寸分布图(B)；

图7是本发明中N-CDs的XPS光谱。(A)全扫描光谱，(B)C1s高分辨率XPS光谱，(C)O1s高分辨率XPS光谱，(D)N1s高分辨率XPS光谱；

图8是本发明中N-CDs与cDNA偶联前后荧光发射光谱图；

图9是本发明中MGO-apt-cDNA-N-CDs在无外加磁场和有外加磁场时的状态图；

图10是本发明中不同浓度AFB1的荧光图谱；

图11是本发明中AFB1的标准曲线图；

图12是本发明中特异性检测图。

具体实施方式

以下结合附图1-12对本发明作进一步详细说明。

实施例1：Fe

在连续机械搅拌下将2.0g聚乙烯醇(PVA)溶解于10mL热水中(水温保持在95-98℃)。然后在室温下，将2.29g九水合硝酸铁(Fe(NO

实施例2：Fe

称量50mg GO溶解于20mL去离子水中，超声20min使之分散完全。称取1.0g聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol，PVA)溶解于5.0mL水中，在98℃条件下加热10min使之溶解。随后将2.0gFe(NO

实施例3：MGO-NH

MGO-NH

实施例4：MGO-apt的合成

将10mg MGO-NH

适配体的序列如下：GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCT CGTGCCCTTCGCTAGGCCC-NH

实施例5：N-CDs-cDNA荧光探针的制备

通过PPD和CA的水热碳化制备N-CDs。将0.5g PPD和0.5g CA溶解于20mL超纯水中，然后超声处理10min使之充分溶解。将所得溶液转移至100mL内衬聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，在200℃下加热8h，然后冷却至室温。随后，将溶液用0.45μm滤膜过滤去除大颗粒，获得棕黄色滤液通过500Da透析袋在超纯水中纯化透析24h。最后，通过冷冻干燥获得N-CDs并在4℃冰箱储存备用。

将cDNA-NH

实施例6：N-CDs-cDNA-apt-MGO荧光传感器的组装

通过适配体(Aptamer)和互补DNA(cDNA)之间的配对反应制备N-CDs-cDNA-apt-MGO荧光传感器。具体操作步骤如下：首先将MGO-apt振荡混匀，取30μL于离心管中，将碳点溶液振荡均匀，取100μL于离心管中，于气浴振荡器中37℃避光条件下振荡反应2h。随后，将N-CDs-cDNA-apt-MGO复合物使用磁分离法分离，PBS清洗三次纯化，除去未连接的碳点。最后，在N-CDs-cDNA-apt-MGO复合物中重新加入300μLPBS，储存在4℃冰箱中保存备用。

互补DNA序列如下：NH

实施例7：AFB1的荧光检测

取出50μL偶联好的N-CDs-cDNA-apt-MGO复合物溶液置于离心管中，振荡分散均匀，将不同浓度的AFB1(2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0和200ng/mL)标准溶液加入N-CDs-cDNA-apt-MGO复合物溶液中。随后在37℃条件下，置于气浴振荡器中振荡反应40min，反应完成后，外置磁铁分离复合物。最后使用移液枪吸取脱附的N-CDs-cDNA荧光探针上清液各50μL，在365nm的激发光，狭缝宽度为20nm下进行扫描，检测不同浓度的AFB1的荧光强度，绘制标准曲线，如图11所示。

如图10所示，随着浓度的增大，AFB1的荧光强度也呈增大的趋势。荧光强度与AFB1浓度之间的标准曲线在1-25ng/mL范围呈线性相关，线性回归方程为y＝14262.20x+22865.57(线性相关系数R

实施例8：方法的特异性检测

在有多种毒素存在的情况下检测AFB1，所用传感器能否对AFB1具有特异性决定了该检测方法能否准确的定量AFB1。如果该传感器对其他毒素特别是同类真菌毒素也有响应，在实验中可能把样品中的非靶标真菌毒素信号当做靶标AFB1的信号来识别，会大大增加实验的假阳性结果。为验证MGO-apt-cDNA-N-CDs荧光传感器能否对AFB1特异性识别，选AFG1、AFG2对MGO-apt-cDNA-N-CDs荧光传感器特异性进行检验。在3份MGO-apt-cDNA-N-CDs中，分别单独加入AFB1、AFG1、AFG2和PBS，使各毒素浓度均为20ng/mL。在上述实验确定的最优反应条件下，来检测磁分离之后上清液的荧光强度。

如图12所示，当检测物是AFB1的时候，荧光信号很强，而除加入AFB1的上清液检测到强的荧光外，加入其他真菌毒素的上清液的荧光都很弱，可以说明，构建的荧光传感器对AFB1有特异性，能够特异性识别AFB1，能够满足对AFB1的检测要求。

实施例9：中药莲子的加标回收实验

将所购莲子打成粉末(过4号筛)，精密称量莲子粉末1.0g，置于5mL离心管中，加入0.2gNaCl和2.5mL甲醇-水溶液(80：20，V/V)，于涡旋震荡器涡旋震荡2min混匀，置于超声仪中超声20min后，于10000rpm离心10min。准确移取上清液2mL于离心管中，在40℃下用氮气吹干，之后加入PBS溶液复溶，充分混合均匀后，使用0.45μm微孔滤膜过滤。将1mL萃取液与1mL不同浓度的AFB1标准溶液，以配置成浓度为5、2.5和1ng/mL的AFB1的加标液，将混合溶液振荡涡旋混合均匀，使用0.45μm微孔滤膜过滤。

(1)将30μL MGO-apt与100μLN-CDs-cDNA混合，在最适温度37℃下振荡反应2h，磁分离去除上清液，PBS清洗掉未连接的N-CDs-cDNA，将复合物重新分散于300μLPBS中；

(2)离心管中加入50μL的纳米复合物，随后加入50μL不同浓度的AFB1加标溶液，使二者发生竞争反应30min，反应完成后磁吸附纳米复合物，用移液枪吸取上清溶液进行检测。

检测条件为：激发波长365nm，发射波长380-600nm，狭缝宽度为20nm。每组实验平行进行3次，结果取平均值。

从表1可以看到，AFB1的加标回收率为95.19-104.75％之间，且相对标准偏差(Relative standard deviation，RSD)均低于3％，说明该检测方法可用于中药中AFB1的检测。

表1莲子中AFB1的检测结果

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。