一种基于在线拉曼光谱的萜类物质原位无损快速检测方法

技术领域

本发明属于原位无损检测技术领域，具体涉及本发明涉及萜类物质，一种基于在线拉曼光谱的萜类物质原位无损快速检测方法。

背景技术

萜类物质是一类广泛存在于植物体内的天然来源碳氢化合物，因其独特的特性以及庞大多样的种类而广泛应用在制药、化妆品、食品等各个领域，在人们的日常生活中无处不在，同样的，在工业生产中也起着至关重要的作用。

萜烯类种类有很多，也有许多同分异构体展现出不同的性质。根据萜类化合物的结构可分为:单萜类、倍半萜类、二萜和类胡萝卜素。月桂烯是重要的单萜类化合物，可作为聚合单体用于合成生物基绿色材料具有重要的应用价值。而倍半萜类也在制药、生物燃料合成等领域发挥重要作用，如紫穗槐二烯是合成抗疟药物青蒿素的关键前驱体；β-法尼烯、红没药烯等，因其适当的十六烷值、密度、不含硫等优点，成为一种可以作为石油替代品的理想生物燃料，所以萜类化合物目前正在被积极探索用于开发先进生物燃料，缓解能源短缺压力，实现绿色环保可持续发展。

随着对萜烯类需求的增多，以及因短缺导致的价格不断上涨，生物合成和化学合成萜类物质成为获取的主要方式，而对其的快速检测对反应过程优化和控制起着关键性作用。

对于萜烯类的传统检测方法多为GC法、GC-MS法。但它们的缺点是样品预处理复杂且缓慢，检测时间长(大约需要30min)，不仅难以合成反应过程的突然变化做出快速反应，也无法实现快速高通量检测，对于反应过程优化有局限，不能作为一种快速便捷的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于针对上述检测方法的缺点与不足，提供一种基于在线拉曼光谱的萜类物质原位无损快速检测方法，该检测方法利用在线拉曼光谱仪对萜类物质含量的快速测定，相较于传统测试方法，不仅可实现原位无损检测，操作简单，还可以大幅度缩短检测时间，利于对反应过程进行及时优化操作。

为此，本发明提供了一种基于在线拉曼光谱的萜类物质原位无损快速检测方法，其包括：

步骤A，基于在线拉曼光谱确定待测萜类物质的在线拉曼光谱特征峰；

步骤B，基于待测萜类物质的在线拉曼光谱特征峰建立待测萜类物质在线拉曼光谱测定的标准工作曲线；

步骤C，对待测样品进行定量测定；

所用在线拉曼光谱仪配备有可移动光纤探头。

本发明中，所述待测萜烯类物质包括单萜和倍半萜类化合物，具体包括月桂烯、法尼烯、紫穗槐二烯、罗汉柏烯、石竹烯，优选为法尼烯。

在本发明的一些实施例中，在步骤A中，利用自主设计的测定池对待测萜类以及有机溶剂进行在线拉曼光谱检测获得拉曼光谱图，根据测定的光谱图确定萜类拉曼特征峰，对比确定萜类物质特征峰区间为1550-1800cm

在本发明的一些实施例中，在步骤B中，所述萜类物质特征峰区间为1550-1800cm

根据本发明，在步骤C中，对待测样品进行定量测定包括：

步骤M，采用在线拉曼光谱仪测定得到待测样品的拉曼光谱图；

步骤N，将待测样品的拉曼光谱图与标准工作曲线对比分析后获得萜类物质浓度；

其中，待测样品包括取样样品、多孔板中原位样品。

根据本发明的一些实施方式，在步骤M中，所述待测萜类物质样品为取样样品时，将待测萜类物质样品提取盛放至测定池内，在线拉曼光谱仪测定得到所述取样样品的拉曼光谱图，经与标准工作曲线对比分析后获得萜类物质浓度。

根据本发明的另一些实施方式，在步骤M中，所述待测萜类物质样品为多孔板中原位样品，所述多孔板中原位样品包括多孔板中溶解于有机溶剂萜类物质或多孔板中含贴类物质的双相发酵体系。

在本发明的一些实施例中，在步骤B中，所述待测萜类物质样品为多孔板中溶解于有机溶剂的萜类物质时，移动光纤探头浸没液面下1mm测得拉曼光谱图，经与标准工作曲线对比分析后获得萜类物质浓度。

在本发明的一些实施例中，在步骤B中，所述待测萜类物质样品为多孔板中含贴类物质的双相发酵体系时，将多孔板首先以6000-8000r/min转速离心后，将探头浸入有机待测相液面下1mm，获得拉曼光谱图，经与标准工作曲线对比分析后获得萜类物质浓度。

在本发明的一些实施例中，在步骤N中，对拉曼位移为1550-1800cm

本发明的有益效果如下：

与常用GC、GC-MS检测法相比，无需过滤等样品预处理操作，测量时间大大缩短，GC法测定一个样品需要用时约30min，而拉曼光谱仅需要约30s，操作简单，极适合用于实验室大量样品筛选，还可以及时反映发酵进程，并进行过程优化。

附图说明

为使本发明容易理解，下面结合附图来详细说明本发明。

图1为本发明涉及在线拉曼光谱仪设备示意图；其中，1-可移动光纤探头，2-virsa在线拉曼分析仪，3-计算机。

图2为本发明自主设计的取样样品测定池的剖面图；其中，1-可移动光纤探头，2-测定池内胆，可用于固定探头距离硅片的距离，3-测定池外壳，4-硅片固定插口，5-取样样品盛放槽。

图3为本发明涉及不同萜类物质的拉曼光谱图。

图4为本发明实施例1提供的β-法尼烯含量分析流程示意图。

图5示出本发明实施例1所得β-法尼烯的拉曼光谱特征峰。

图6为本发明实施例1所得不同系列浓度下β-法尼烯标准溶液1(聚α烯烃)的拉曼光谱图；其中，(a)不同浓度β-法尼烯/聚α烯烃的拉曼光谱图；(b)1550-1800cm

图7为本发明实施例1所得不同系列浓度下β-法尼烯标准溶液2(正壬烷)的拉曼光谱图；其中，(a)不同浓度β-法尼烯/正壬烷的拉曼光谱图；(b)1550-1800cm

图8为本发明实施例1所得β-法尼烯标准溶液工作曲线1(聚α烯烃，5-250g/L)；其中，(a)以峰高度作为特征峰强度；(b)以峰面积作为特征峰强度。

图9为本发明实施例1所得β-法尼烯标准溶液工作曲线2(正壬烷，4-15g/L)；其中，(a)以峰高度作为特征峰强度；(b)以峰面积作为特征峰强度。

具体实施方式

为使本发明容易理解，下面将结合附图和具体实施方式来详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。

在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。

Ⅰ、术语

本发明所述用语“原位”是指样品无需从反应(发酵)体系中取出，可在反应过程中(结束后)直接在反应容器中进行检测。

本发明所述用语“无损”是指检测时无需对样品进行衍生或稀释等处理，可直接对样品进行检测且不引入其他物质。

本发明所述用语“快速”是指采用本发明方法通过拉曼光谱仪进行样品检测的时间为30s，这与萜类物质其他常用检测方法(GC、GC-MS等)所采用的时间(均在30-40min以上)(例如，Shanshan Su,Xueyan Liu,In vitro characterization of a(E)-β-farnesenesynthase from Matricaria recutita L.and its up-regulation by methyljasmonate，“In vitro characterization of a(E)-β-farnesene synthase fromMatricaria recutita L.and its up-regulation by methyl jasmonate”,Gene,Volume571,Issue 1,15October 2015,Pages 58-64)相比，大大缩短了检测时间，属于快速检测法。

Ⅱ、实施方案

本发明涉及一种基于在线拉曼光谱的萜类物质原位无损快速检测方法，待测萜类物质包括月桂烯、法尼烯、紫穗槐二烯、罗汉柏烯、石竹烯等单萜和倍半萜类化合物，包括如下步骤：

(一)基于在线拉曼光谱的萜类物质特征峰的确定：

使用配备可移动光纤探头的拉曼光谱仪(见图1)检测待测萜类物质的拉曼光谱图，如图3所示，确定萜类物质拉曼特征峰区域为1550-1800cm

表1几种常见萜类物质的在线拉曼光谱特征峰

(二)萜类物质在线拉曼光谱测定标准工作曲线的建立：

对1550-1800cm

(三)取样样品和多孔板中原位样品的定量测定方法：

1.样品测定

(1)对于取样样品测定，萜类物质取样样品提取盛放至测定池(结构如图2所示)内，经在线拉曼光谱仪测定得到取样样品的拉曼光谱图，经与标准工作曲线对比分析后获得萜类物质浓度；

(2)对于多孔板中溶解于有机溶剂萜类物质，移动光纤探头浸没液面下1mm测得拉曼光谱图，经与标准工作曲线对比分析后获得萜类物质浓度；

(3)对于多孔板中常用双相发酵体系，将多孔板首先以6000-8000r/min转速离心后，将探头浸入有机待测相液面下1mm，获得拉曼光谱图，经与标准工作曲线对比分析后获得萜类物质浓度。

2.样品测定过程中使用的在线拉曼光谱仪，所述测定条件为：

(1)拉曼光谱仪开机后等待30min，使激光达到稳定状态，测试前使用硅片校正，硅片矫正峰位置为520cm

(2)激光器为785nm激光器；激光功率为120mW；光谱范围为100～3200cm-1；曝光时间为10s；累计积分次数1次；使用浸入式光纤探头。

3.拉曼光谱数据预处理为：

(1)优先使用Wire 5.5软件(Renishaw)完成去除宇宙射线、基线扣除、平滑，设置参数为：smooth window:5，polynomial order:2；

(2)指纹特征峰区域1550-1800cm

(3)比较标准工作曲线计算得到对应样品的萜类物质含量，实现基于在线拉曼光谱的萜类物质原位无损快速检测方法。

本发明自主设计的取样样品测定池的剖面图如图2所示，从图2可以看出，所述样品池包括可移动光纤探头1、测定池内胆2、测定池外壳3、硅片固定插口4和取样样品盛放槽5，其中，测定池内胆2可用于固定探头距离硅片的距离。

本发明自主设计的取样样品测定池的尺寸可以根据需要确定，例如，图2所示样品池的尺寸适用于20-25mL体积量的取样样品测定，实际操作过程中可以根据不同的取样样品体积量可以缩放测定池尺寸。

所述根据不同的取样样品体积量可以缩放测定池尺寸大小，例如，可以采用20-25mL体积量。

本发明人自主设计的取样样品测定池可以实现硅片作为内标物的取样样品定量检测，图2中所示的测定池内胆2固定了可移动光纤探头1距离硅片固定插口4的距离为10mm。

若不需要硅片作为内标物，图2中所示的测定池内胆2可以取出，可用实验室铁架台固定可移动光线探头1，实现取样样品的在线拉曼光谱检测。

本发明提供了一种基于在线拉曼光谱的萜类物质原位无损快速检测方法，该检测方法可以实现实验室内取样样品、多孔板发酵等多场景的基于在线拉曼光谱的萜类物质原位无损快速检测方法。自主设计了取样样品测定池可进行在线拉曼光谱无损快速检测，对于多孔板检测，对孔板产物进行离心、提取，进行在线拉曼光谱仪原位无损快速检测。本发明首先确定萜类物质的拉曼光谱数据以及其定量关系表达，然后进一步应用于实际取样样品或多孔板萜类物质的快速检测过程中。该测试方法快速，便于操作，并且准确率较高，检测速度较GC-MS可提高60倍以上。

Ⅲ、实施例

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。

以下实施例中选择β-法尼烯为待测萜类物质，所采用的拉曼光谱仪结构示意图如图1所示，可移动光线探头1配备785nm激光器；经在线拉曼光谱仪分析系统2分析收集光纤输出，在笔记本3显示拉曼光谱图。取样样品测定池示意图如图2所示。

实施例1：

(一)试剂

(1)正壬烷、聚α烯烃(PAO)，购于上海安谱公司，均为分析纯。

(2)β-法尼烯标准储存溶液1：将β-法尼烯用聚α烯烃定容为500g/L的储备液，于冰箱冷藏避光保存。

β-法尼烯标准储存溶液2：将β-法尼烯用正壬烷定容为500g/L的储备液，于冰箱冷藏避光保存。

(3)β-法尼烯标准使用溶液1：将β-法尼烯标准储备液用聚α烯烃稀释至浓度为250、200、150、100、50、20、10、5g/L的标准系列点待用。

β-法尼烯标准使用溶液2：将β-法尼烯标准储备液用正壬烷稀释至浓度为15、10、8、5、4g/L的标准系列点待用。

(二)仪器

(1)主要设备：Renishaw Virsa在线拉曼光谱仪(785nm激光器)。

配备的光纤探头长度为5米，探头直径为15.9mm，长度330mm，20倍目镜，光谱范围为50～3100cm

待测样品的常规拉曼光谱测试方法为：全谱扫描(范围为：100～3200cm

优先采用Wire 5.5软件、以及Origin软件对拉曼光谱图进行分析和对相关数据进行处理。其中Wire 5.5软件为Renishaw Virsa在线拉曼光谱分析系统配备的操作控制软件及光谱采集软件，可以完成拉曼光谱基线校准，同时对拉曼光谱进行光滑处理，以及分峰处理，确定拉曼振动峰的中心位置等光谱处理和分析功能；Origin软件完成工作曲线拟合。

(2)辅助设备：孔板离心机；移液工作台。

(三)基于在线拉曼光谱的β-法尼烯特征峰的确定(图5)，包括下述步骤：

(1)收集并提供β-法尼烯、聚α烯烃、正壬烷纯物质溶液以及β-法尼烯标准溶液1(聚α烯烃)、β-法尼烯标准溶液2(正壬烷)，进行在线拉曼光谱仪检测获得标准样品的拉曼光谱图；

(2)比对样品标准溶液的拉曼光谱图，确定β-法尼烯相较于聚α烯烃或正壬烷拉曼峰独立存在的位置峰为1634cm

(3)比对β-法尼烯标准溶液1/2在1634cm

(四)β-法尼烯在线拉曼光谱测定标准工作曲线的建立

1.β-法尼烯标准溶液工作曲线1的建立，包括下述步骤：

(1)收集并提供β-法尼烯标准溶液1，浓度为250、200、150、100、50、20、10、5g/L的标准系列点；

(2)使用在线拉曼光谱仪，检测得到每个样本的拉曼光谱(图6)，并对拉曼光谱进行基线校正、平滑、计算积分区域为1550-1800cm-1；

(3)分别以位于1634、1671cm-1的特征峰强度作为该样本在该浓度下对应的拉曼峰强度，得到不同标准系列点对应的标准峰强度。

(4)以β-法尼烯标准溶液浓度为横坐标，各自特征峰强度为纵坐标，作线性回归方程1(图8)，最后以测得待测取样样品的峰强度与标准曲线1比较定量。

2.β-法尼烯标准溶液工作曲线2的建立，包括下述步骤：

(1)收集并提供β-法尼烯标准溶液2，浓度为15、10、8、5、4g/L的标准系列点；

(2)使用在线拉曼光谱仪，检测得到每个样本的拉曼光谱(图7)，并对拉曼光谱进行基线校正、平滑、计算积分区域为1550-1800cm

(3)分别以位于1634、1671cm

(4)以β-法尼烯标准溶液浓度为横坐标，各自特征峰强度为纵坐标，作线性回归方程2(图9)，最后以测得待测24孔板中试样峰强度与标准曲线2比较定量。

本发明提供的基于拉曼光谱的β-法尼烯含量分析方法，其中，优选的是，所述数学模型为一元线性回归模型；所述β-法尼烯特征峰的拉曼峰强度不限于特征峰高度、峰面积以及面积之和。

本发明提供的基于拉曼光谱的β-法尼烯含量分析方法，其中，优选的是，基线校正、积分区域为1550-1800cm

实施例2：定量测定取样样品

对于待测取样样品，优选的β-法尼烯-聚α烯烃溶液。待测β-法尼烯取样样品提取盛放至测定池内，经在线拉曼光谱仪测定得到取样样品的拉曼光谱图；采用Wire 5.5软件完成拉曼光谱基线校准，光滑处理，以及1550-1800cm

表1取样样品中β-法尼烯的定量分析结果

实施例3：定量测定多孔板中的β-法尼烯样品

对于待测多孔板，优选的24孔板发酵产物。发酵完成后，向每个发酵孔中加入正壬烷5mL，使用孔板离心机对实验室发酵完成的24孔板进行离心分离，离心后油相(正壬烷)在上方与水相分离，使用移液工作站完成分离工作，再移动在线拉曼光谱仪探头进行每个孔位置的浸入式检测，得到每个孔的拉曼光谱图；采用Wire 5.5软件完成拉曼光谱基线校准，光滑处理，以及1550-1800cm

表2多孔板中的β-法尼烯样品定量分析结果

从上述实施例可以看出，本发明提出的一种基于在线拉曼光谱的萜类物质原位无损快速检测方法，基于萜类物质拉曼光谱的特征，标准工作曲线构建一元线性模型。与传统测量方法相比，不仅检测速度快(≤30s)，预测速度同样也加快，萃取液样品无需进一步预处理、检测过程操作简便。因此，对生物合成中的转化进程、产品质量控制都能有着重要的应用价值。

应当注意的是，以上所述的实施例仅为本发明较佳实施例，用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。