一种用于类风湿关节炎诊疗一体化响应型纳米探针

技术领域

本发明属于生物医学纳米材料领域，具体涉及一种用于类风湿关节炎诊疗一体化响应型纳米探针。

背景技术

近年来，类风湿关节炎的发病率正在逐年上升。类风湿关节炎(RA)是一种T细胞和B细胞参与的以滑膜炎为主的全身性免疫性疾病，RA不仅会导致严重的炎症，还会导致骨骼组织的形态变化，包括骨骼和关节损伤、软骨退化、滑膜增生、成纤维样滑膜细胞向软骨和骨表面浸润等。全世界每200名成年人中大约1人受累，女性的发病率是男性的2～3倍，且主要发病年龄集中在50～59岁。RA滑膜成纤维细胞(RASF)已成为RA发病机制中的关键参与者，具有转化细胞的表型和分子特征。RASF能分泌细胞因子、趋化因子和关节损伤酶，从而促成RA的炎症状态和关节损伤。RASF具有的凋亡抗性及对巨噬细胞和淋巴细胞等炎症细胞的招募，是RA关节滑膜组织过度增生的主要原因。此外，RASF具有侵袭性和迁移性，可导致疾病传播到未受影响的关节。因此，亟待开发一种通过体内外光热疗法抑制RASF的分泌、延缓关节损伤并可监测治疗过程的荧光探针来治疗该疾病。

近年来，纳米医学的蓬勃发展为治疗类风湿性关节炎提供了新的思路，纳米材料通常在炎症部位具有靶向递送的功能，可将纳米药物递送至特定部位，而纳米药物可以通过抑制RASF的分泌来治疗类风湿性关节炎。但类风湿关节炎中的RASF具有的凋亡抗性及对巨噬细胞和淋巴细胞等炎症细胞的招募使得治疗效果并不理想。

因此，亟待开发一种可通过乏氧响应释放功能化的小颗粒在患处富集，再结合体内外光热疗法达到可持续治疗效果的新型纳米探针。

发明内容

基于上述背景技术，本发明的目的在于提供一种用于类风湿关节炎诊疗一体化响应型纳米探针，该纳米探针可以特异性地对肿瘤微环境中的乏氧状况进行响应性地释放，利用纳米颗粒的EPR效应在肿瘤部位发生聚集，增强材料在肿瘤部位的光声信号，从而达到实现氢热治疗的目的。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现：

第一方面，本发明提供了一种用于类风湿关节炎诊疗一体化响应型纳米探针的制备方法，包括以下步骤：

S1：将2-硝基咪唑(2-NI)溶于二甲基甲酰胺(DMF)后，加入K

S2：将透明质酸溶于PBS中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和n-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，冰浴激活，再加入步骤S1所得的2-硝基咪唑衍生物，室温反应，反应结束后将所得产物透析、冻干，得到硝基咪唑接枝透明质酸(NI-HA)；

S3：将步骤S2所得的硝基咪唑接枝透明质酸溶于PBS中，溶胀一段时间后加入氨基硼烷、黑色素与吲哚菁绿，冰浴混合，超滤离心，冷冻干燥，即可得到所述纳米探针(MAH-ICG)。

进一步地，所述步骤S1中2-硝基咪唑的用量为0.34-0.42g；二甲基甲酰胺的用量为5mL；K

进一步地，所述步骤S1中加入6-(Boc-氨基)溴己基反应的时间为12h；室温搅拌反应的时间为4h，转速为700r/min。

进一步地，所述步骤S2中透明质酸的用量为0.1g，PBS用量为5mL；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为0.192-0.22g；n-羟基琥珀酰亚胺的用量为0.115-0.12g；2-硝基咪唑衍生物的用量为106-110mg。

进一步地，所述步骤S2中冰浴激活的时间为30min，室温反应的时间为24h。

进一步地，所述步骤S2中透析的具体过程为：将所得产物转移到规格为MW＝8000Da的透析袋，先使用体积比为1:1的甲醇/水透析1天，再使用超纯水透析2天。

进一步地，所述步骤S3中硝基咪唑接枝透明质酸的用量为100mg，PBS用量为10mL；氨基硼烷的浓度为2mg/mL，用量为0.5mL；黑色素的浓度为5mg/mL，用量为2mL；吲哚菁绿的浓度为1mg/mL，用量为0.5mL。

进一步地，所述步骤S3中溶胀的时间为12h；冰浴混合的时间为4h；超滤离心使用规格为MW＝10000Da的透析袋。

第二方面，本发明提供了前述方法制备得到的用于类风湿关节炎诊疗一体化响应型纳米探针，所述纳米探针的形貌为类球形，多呈聚集性分布。

第三方面，本发明提供了前述的用于类风湿关节炎诊疗一体化响应型纳米探针在制备类风湿性关节炎诊断和/或类风湿性关节炎治疗试剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)本发明纳米探针具有通过乏氧响应释放功能化的小颗粒在患处富集，再结合体内外光热疗法达到可持续治疗的效果。

(2)本发明纳米探针的吸收光谱位于近红外二区(NIR-II)，具有更深的穿透深度，可以达到更好的成像及治疗效果。同时以体内外光热疗法作为辅助疗法，可以全面提高该探针在类风湿关节炎治疗各阶段发挥的作用。

附图说明

图1为本发明实施例1所合成的纳米探针的透射电子显微镜图。

图2为本发明实施例1中MNP、NI-HA、ICG以及MAH+ICG的吸光度对比图。

图3为本发明实施例1中MAH、ICG以及MAH+ICG的荧光强度对比图。

图4为本发明实施例1所合成的纳米探针的降解性能。

图5为本发明实施例1所合成的纳米探针的抗氧化性能。

图6为本发明实施例1所合成的纳米探针在不同浓度下的光热成像图。

图7为本发明实施例1所合成的纳米探针的NIR-II活体成像图(a为健康小鼠和类风湿关节炎小鼠双下肢荧光成像对比图，b为关节部位荧光强度量化值)。

图8为本发明不同实验组的小鼠鼠掌厚度与临床指数对比图。

图9为本发明不同实验组的体内治疗活体效果对比图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

实施例1

称0.34g(3mmol)2-NI到圆底烧瓶中，加入5mL DMF，加热至50℃，以700r/min的转速，完全溶解，加入0.83g(6mmol)K

在圆底烧瓶中，加入0.1g(0.25mmol)透明质酸并溶解于5mL PBS中。搅拌2h后，加入0.192g EDC·HCl(1mmol)和0.115g NHS(1mmol)，冰浴激活30min，缓慢滴加106mg(0.5mmol)2-硝基咪唑衍生物，室温下反应24h。反应结束后，转移到透析袋(MW＝8000Da)，甲醇/水(V:V＝1:1)透析1天，超纯水透析2天，冻干得到硝基咪唑接枝透明质酸(NI-HA)。

再将所得的NI-HA称100mg溶于10mL PBS中，溶胀12h，得到10mg/mL聚合物溶液。在快速搅拌的NI-HA溶液中，滴加0.5mL氨基硼烷(2mg/mL)、2mL黑色素MNP(5mg/mL)、0.5mL吲哚菁绿ICG(1mg/mL)，冰浴混合4h，超滤离心(MW＝10000Da)，冷冻干燥得到两亲性纳米探针MAH-ICG。

实施例2

称0.40g(3mmol)2-NI到圆底烧瓶中，加入5mL DMF，加热至50℃，以700r/min的转速，完全溶解，加入0.90g(6mmol)K

在圆底烧瓶中，加入0.1g(0.25mmol)透明质酸并溶解于5mL PBS中。搅拌2h后，加入0.20g EDC·HCl(1mmol)和0.12g NHS(1mmol)，冰浴激活30min，缓慢滴加110mg(0.5mmol)2-硝基咪唑衍生物，室温下反应24h。反应结束后，转移到透析袋(MW＝8000Da)，甲醇/水(V:V＝1:1)透析1天，超纯水透析2天，冻干得到硝基咪唑接枝透明质酸(NI-HA)。

再将所得的NI-HA称100mg溶于10mL PBS中，溶胀12h，得到10mg/mL聚合物溶液。在快速搅拌的NI-HA溶液中，滴加0.5mL氨基硼烷(2mg/mL)、2mL黑色素MNP(5mg/mL)、0.5mL吲哚菁绿ICG(1mg/mL)，冰浴混合4h，超滤离心(MW＝10000Da)，冷冻干燥得到两亲性纳米探针MAH-ICG。

实施例3

称0.42g(3mmol)2-NI到圆底烧瓶中，加入5mL DMF，加热至50℃，以700r/min的转速，完全溶解，加入0.92g(6mmol)K

在圆底烧瓶中，加入0.1g(0.25mmol)透明质酸并溶解于5mL PBS中。搅拌2h后，加入0.22g EDC·HCl(1mmol)和0.12g NHS(1mmol)，冰浴激活30min，缓慢滴加110mg(0.5mmol)2-硝基咪唑衍生物，室温下反应24h。反应结束后，转移到透析袋(MW＝8000Da)，甲醇/水(V:V＝1:1)透析1天，超纯水透析2天，冻干得到硝基咪唑接枝透明质酸(NI-HA)。

再将所得的NI-HA称100mg溶于10mL PBS中，溶胀12h，得到10mg/mL聚合物溶液。在快速搅拌的NI-HA溶液中，滴加0.5mL氨基硼烷(2mg/mL)、2mL黑色素MNP(5mg/mL)、0.5mL吲哚菁绿ICG(1mg/mL)，冰浴混合4h，超滤离心(MW＝10000Da)，冷冻干燥得到两亲性纳米探针MAH-ICG。

实施例4

称0.38g(3mmol)2-NI到圆底烧瓶中，加入5mL DMF，加热至50℃，以700r/min的转速，完全溶解，加入0.88g(6mmol)K

在圆底烧瓶中，加入0.1g(0.25mmol)透明质酸并溶解于5mL PBS中。搅拌2h后，加入0.20g EDC·HCl(1mmol)和0.10g NHS(1mmol)，冰浴激活30min，缓慢滴加109mg(0.5mmol)2-硝基咪唑衍生物，室温下反应24h。反应结束后，转移到透析袋(MW＝8000Da)，甲醇/水(V:V＝1:1)透析1天，超纯水透析2天，冻干得到硝基咪唑接枝透明质酸(NI-HA)。

再将所得的NI-HA称100mg溶于10mL PBS中，溶胀12h，得到10mg/mL聚合物溶液。在快速搅拌的NI-HA溶液中，滴加0.5mL氨基硼烷(2mg/mL)、2mL黑色素MNP(5mg/mL)、0.5mL吲哚菁绿ICG(1mg/mL)，冰浴混合4h，超滤离心(MW＝10000Da)，冷冻干燥得到两亲性纳米探针MAH-ICG。

实施例5

称0.37g(3mmol)2-NI到圆底烧瓶中，加入5mL DMF，加热至50℃，以700r/min的转速，完全溶解，加入0.90g(6mmol)K

在圆底烧瓶中，加入0.1g(0.25mmol)透明质酸并溶解于5mL PBS中。搅拌2h后，加入0.20g EDC·HCl(1mmol)和0.10g NHS(1mmol)，冰浴激活30min，缓慢滴加108mg(0.5mmol)2-硝基咪唑衍生物，室温下反应24h。反应结束后，转移到透析袋(MW＝8000Da)，甲醇/水(V:V＝1:1)透析1天，超纯水透析2天，冻干得到硝基咪唑接枝透明质酸(NI-HA)。

再将所得的NI-HA称100mg溶于10mL PBS中，溶胀12h，得到10mg/mL聚合物溶液。在快速搅拌的NI-HA溶液中，滴加0.5mL氨基硼烷(2mg/mL)、2mL黑色素MNP(5mg/mL)、0.5mL吲哚菁绿ICG(1mg/mL)，冰浴混合4h，超滤离心(MW＝10000Da)，冷冻干燥得到两亲性纳米探针MAH-ICG。

实施例6

称0.36g(3mmol)2-NI到圆底烧瓶中，加入5mL DMF，加热至50℃，以700r/min的转速，完全溶解，加入0.86g(6mmol)K

在圆底烧瓶中，加入0.1g(0.25mmol)透明质酸并溶解于5mL PBS中。搅拌2h后，加入0.21g EDC·HCl(1mmol)和0.10g NHS(1mmol)，冰浴激活30min，缓慢滴加110mg(0.5mmol)2-硝基咪唑衍生物，室温下反应24h。反应结束后，转移到透析袋(MW＝8000Da)，甲醇/水(V:V＝1:1)透析1天，超纯水透析2天，冻干得到硝基咪唑接枝透明质酸(NI-HA)。

再将所得的NI-HA称100mg溶于10mL PBS中，溶胀12h，得到10mg/mL聚合物溶液。在快速搅拌的NI-HA溶液中，滴加0.5mL氨基硼烷(2mg/mL)、2mL黑色素MNP(5mg/mL)、0.5mL吲哚菁绿ICG(1mg/mL)，冰浴混合4h，超滤离心(MW＝10000Da)，冷冻干燥得到两亲性纳米探针MAH-ICG。

实施例7

称0.42g(3mmol)2-NI到圆底烧瓶中，加入5mL DMF，加热至50℃，以700r/min的转速，完全溶解，加入0.91g(6mmol)K

在圆底烧瓶中，加入0.1g(0.25mmol)透明质酸并溶解于5mL PBS中。搅拌2h后，加入0.20g EDC·HCl(1mmol)和0.10g NHS(1mmol)，冰浴激活30min，缓慢滴加117mg(0.5mmol)2-硝基咪唑衍生物，室温下反应24h。反应结束后，转移到透析袋(MW＝8000Da)，甲醇/水(V:V＝1:1)透析1天，超纯水透析2天，冻干得到硝基咪唑接枝透明质酸(NI-HA)。

再将所得的NI-HA称100mg溶于10mL PBS中，溶胀12h，得到10mg/mL聚合物溶液。在快速搅拌的NI-HA溶液中，滴加0.5mL氨基硼烷(2mg/mL)、2mL黑色素MNP(5mg/mL)、0.5mL吲哚菁绿ICG(1mg/mL)，冰浴混合4h，超滤离心(MW＝10000Da)，冷冻干燥得到两亲性纳米探针MAH-ICG。

实施例8

称0.40g(3mmol)2-NI到圆底烧瓶中，加入5mL DMF，加热至50℃，以700r/min的转速，完全溶解，加入0.89g(6mmol)K

在圆底烧瓶中，加入0.1g(0.25mmol)透明质酸并溶解于5mL PBS中。搅拌2h后，加入0.20g EDC·HCl(1mmol)和0.10g NHS(1mmol)，冰浴激活30min，缓慢滴加110mg(0.5mmol)2-硝基咪唑衍生物，室温下反应24h。反应结束后，转移到透析袋(MW＝8000Da)，甲醇/水(V:V＝1:1)透析1天，超纯水透析2天，冻干得到硝基咪唑接枝透明质酸(NI-HA)。

再将所得的NI-HA称100mg溶于10mL PBS中，溶胀12h，得到10mg/mL聚合物溶液。在快速搅拌的NI-HA溶液中，滴加0.5mL氨基硼烷(2mg/mL)、2mL黑色素MNP(5mg/mL)、0.5mL吲哚菁绿ICG(1mg/mL)，冰浴混合4h，超滤离心(MW＝10000Da)，冷冻干燥得到两亲性纳米探针MAH-ICG。

性能检测

对上述本发明实施例1中制得的纳米探针进行以下性能检测：

(1)对本发明实施例1制得的纳米探针进行透射电子显微镜检测。由图1可知，纳米探针的纳米颗粒分布均匀，形貌为类球形的结构，粒径分布直径平均为52.31nm。

(2)对本发明实施例1中黑色素MNP、硝基咪唑接枝透明质酸NI-HA、吲哚菁绿ICG以及纳米探针MAH+ICG的吸光度进行检测。由图2可知，与单纯材料组相比，纳米探针MAH+ICG在850-900nm处吸光度达到最强。

(3)对本发明实施例1中黑色素与透明质酸合成物MAH、吲哚菁绿ICG以及纳米探针MAH+ICG的荧光强度进行检测。由图3可知，该纳米探针在930nm处荧光强度达到最大。

(4)分析本发明实施例1制得的纳米探针的降解性能，称取少量的黑色素纳米颗粒和MAH+ICG纳米探针的冻干粉末，溶解在去离子水中，稀释为淡棕色的透明溶液，各自取少许滴于铜网上，待铜网过夜晾干后，应用透射电镜对纳米材料进行形貌和粒径的分析，由图4可知，在不同时间的透射电镜图显示，该纳米探针在3h开始降解，10h几乎完全降解。

(5)分析本发明实施例1制得的纳米探针的抗氧化性能，使用气相色谱仪监测常氧与低氧条件下MAH+ICG纳米探针在不同pH下的H

(6)对不同浓度下的MAH-ICG纳米探针温度变化的光热成像性能检测，在808nm激光连续激发下，温度出现明显的浓度依赖性升高，而去离子水的温度没有显著变化，如图6所示，由不同浓度的纳米探针在近红外辐照下的温度曲线可知，探针浓度越高升温越快，温度随辐照时间增长的越高。

(7)将实施例1制备得到的纳米探针通过鼠尾静脉注射进行给药，检测纳米探针的成像性能，光声(PA)成像由多光谱光声层析成像平台(MSOT)在脉冲激光(680-980nm)下进行。在对所获得的MSOT图像进行重建和分析之后，通过分析这些图像的目标区域来拟合线性关系，并进一步记录PA体内成像，在注射纳米颗粒之前和之后，在不同时间点(1、4、6、8小时)麻醉小鼠以进行PA成像。如图7所示，图a为健康小鼠类风湿关节炎小鼠双下肢荧光成像对比图，图b为健康小鼠与实验鼠的患部对照表，由图可知，在裸鼠尾静脉给药后2h患病部位药物聚集浓度最高，光声信号最强。

(8)对不同实验组的小鼠鼠掌厚度与临床指数对比，首先建立CIA小鼠模型进行体内治疗，8天后，小鼠随机分为4组进行不同处理：(1)PBS组；(2)MH-ICG组(未加氨硼烷)(100μL,5mg/mL)；(3)MAH-ICG组(100μL,5mg/mL)；(4)MAH-ICG(100μL,5mg/mL)+激光(1W/cm

(9)对不同实验组的体内治疗活体效果对比，将各组小鼠患部均暴露于相同功率密度为1W/cm

综合以上结果，表明本发明纳米探针是一种结合体内外光热疗法用以治疗类风湿关节炎的NIR-II诊疗一体化纳米探针。

以上所述仅为更好解释本发明的实施例，并非对其限制，凡未脱离本发明精神和范围的任何修改或同等替换，均属本发明所涵盖的范围内。