用于使用磁性隧道结对脂质层进行免疫传感的方法

本发明涉及诊断测试和技术。特别地，本发明涉及一种用于确定疑似存在于样品中的分析物的方法，该方法包括：使所述样品与传感器元件在一定时间内并且在一定条件下接触，该传感器元件包括：锚定层，其存在于固体支持物上；第一结合剂，其能够与分析物特异性结合，其被锚定在锚定层中并且其包含至少一个磁性标记，其中所述至少一个磁性标记位于锚定层内；第二结合剂，其能够在分析物结合至第一结合剂的情况下与分析物特异性结合并且其被固定在固体支持物上；以及与第二结合剂功能临近的磁性隧道结，该磁性隧道结产生与第一结合剂的至少一个磁性标记临近引发的信号；这些时间和条件允许疑似存在于样品中的分析物与第一结合剂特异性结合以及第二结合剂与结合至第一结合剂的分析物特异性结合；以及基于由磁性隧道结产生的信号来检测第一结合剂、分析物和第二结合剂的复合物的形成，由此确定分析物。此外，提供了一种用于确定疑似存在于样品中的分析物的装置及其用于确定样品中疑似存在于所述样品中的分析物的用途。此外，本发明设想了一种用于确定疑似存在于样品中的分析物的试剂盒。

免疫测定广泛用于各种诊断目的。已经开发了若干种用于免疫测定的设置。最流行的免疫测定中的一者为酶联吸附免疫测定(ELISA)。

在ELISA中，将含有目标分析物或疑似含有目标分析物的液体样品施加到由于存在抗体或抗体样分子(诸如适体)而具有特殊结合性质的固定固相上。在样品施加之后，依序添加、孵育并洗掉多种试剂，以进行和停止分析检测反应。在进行所有这些步骤之后，设置中的物理或化学性质(即液相)发生了可以检测到的变化。通常，光学变化(诸如酶促反应的产物的显色)将发生在最终液相中。这些变化与存在于所研究样品中的目标分析物的存在或丰度相关。典型的定量读出通常基于通过分光光度法对透射光的强度的检测，这涉及对某一特定波长的光通过液体的透射的定量。检测的灵敏度取决于分析反应期间信号的放大。由于酶反应是众所周知的扩增过程，因此信号由酶产生，这些酶以固定比例连接到检测试剂，以实现准确的定量。

对于ELISA设置，分析物结合剂(例如，抗体)固定在固相(诸如固体支持结构)上。通常，将抗体涂覆并干燥到分析多孔板或分析小瓶中的孔的透明底部上，有时也涂覆并干燥到侧壁上。然而，纳米粒子或其他珠子也可以用作ELISA的固相。

对于研究和诊断，ELISA通常以所谓的夹心ELISA的形式使用。在夹心测定形式中，固定化捕获抗体用于捕获存在于施加到所述固定化抗体的样品中的分析物(即与该分析物特异性结合)。在捕获抗体已与分析物特异性结合之后，样品材料被洗掉。在后续步骤中，将与固定化抗体结合的分析物与特异性结合至分析物或分析物与捕获抗体的复合物的检测抗体一起孵育。检测抗体通常含有可检测接头或衔接子分子，该可检测接头或衔接分子允许从溶液中吸引此类可检测标记。

然而，鉴于信号产生所需的脆弱的免疫复合物和用于此类呈夹心形式的ELISA的各种组分，存在许多不期望的检测抗体结合和因此假阳性信号产生的可能性。因此，由于存在假阳性结果的风险，用于研究的夹心ELISA通常需要验证。此外，由于此类脆弱的多组分测定形式的各种缺点，在灵敏度和特异性方面存在限制。

作为本发明的基础的技术问题可以被看作是提供满足前述需要的手段和方法。该技术问题通过权利要求书和下文中表征的实施方案来解决。

因此，本发明涉及一种用于确定疑似存在于样品中的分析物的方法，该方法包括：

(a)使所述样品与传感器元件在一定时间内并且在一定条件下接触，该传感器元件包括：

(i)锚定层，其存在于固体支持物上；

(ii)第一结合剂，其能够与分析物特异性结合，其被锚定在锚定层中并且其包含至少一个磁性标记，其中所述至少一个磁性标记位于锚定层内；

(iii)第二结合剂，其能够在分析物结合至第一结合剂的情况下与该分析物特异性结合并且其被固定在固体支持物上；以及

(iv)与第二结合剂功能临近的磁性隧道结，该磁性隧道结产生与第一结合剂的至少一个磁性标记临近引发的信号；

所述时间和所述条件允许疑似存在于所述样品中的所述分析物与所述第一结合剂特异性结合以及所述第二结合剂与结合至所述第一结合剂的所述分析物特异性结合；以及

(b)基于由磁性隧道结产生的信号来检测第一结合剂、分析物和第二结合剂的复合物的形成，由此确定分析物。

应当理解，在说明书和权利要求书中，“一”或“一个”可以意指一个或多个，取决于其所用的上下文。因此，例如，对“一个”项目的提及可意指能够利用至少一个项目。

如下文中所用，术语“具有”、“包括(comprise)”或“包括(include)”意指具有非限制性含义或限制性含义。因此，具有限制性含义的这些术语可以指除了这些术语所引入的特征之外，在所描述的实施方案中不存在其他特征，即这些术语在“由......组成”或“基本上由......组成”的意义上具有限制性含义的情况。具有非限制性含义的这些术语是指除了这些术语所引入的特征之外，在所描述的实施方案中还存在一个或多个其他特征的情况。

另外，如下文中所用，术语“优选地”、“更优选地”、“最优选地”、“特别地”、“更特别地”、“通常地”和“更通常地”或类似的术语与附加或替代特征结合使用，而不限制替代的可能性。

进一步地，应当理解，如本文所用的术语“至少一个”意指根据本发明可以使用该术语后面提及的项目中的一者或多者。例如，如果该术语指示应当使用至少一个项目，则可以被理解为一个项目或多于一个项目，即两个、三个、四个、五个或任何其他数量。根据该术语所指的项目，本领域技术人员理解该术语可以指的上限(如果有的话)。

根据本发明的方法可以由前述步骤(a)和(b)组成，或者可以包括另外的步骤，诸如在步骤(a)之前和/或在步骤(b)之后预处理或隔离样品、评估所确定的分析物的另外一个或多个步骤，例如，通过将其与参考进行比较，以便根据分析物的确定的目的提供诊断、预后、环境相关、农业相关或分析相关的结论。

本文所用的术语“确定”涵盖分析物的任何种类的定性或定量确定。定性确定旨在确定样品中存在或不存在分析物，而定量确定旨在确定分析物的量。定量确定，即量的测定，包括确定绝对量(例如存在于样品中的分子的重量或数量的总量)或相对量(例如，相对于样品体积(浓度)或诸如评分的分类的量(例如，“高量”、“低量”等))。通常，确定分析物包括确定所述分析物的存在、不存在或量。

本文所提及的术语“分析物”涉及适合于通过本发明的方法确定的任何类型的分子或药剂。应当理解，此类分子或药剂可以具有允许本文所提及的第一结合剂和第二结合剂结合的尺寸和/或结构。此外，也可能存在尺寸上限，因为第一结合剂和第二结合剂以及连接剂必须能够发挥其功能，如本文别处详细描述的。通常，本文所提及的分析物为生物分子，诸如蛋白质、肽、核酸(例如，DNA、或RNA、或诸如脂质或代谢物的小分子)、聚酮化合物(包括例如类黄酮和异黄酮)、类异戊二烯(包括例如萜烯、甾醇、类固醇、类胡萝卜素、叶黄素)、碳水化合物、苯丙素、生物碱、苯甲素、吲哚、卟啉、激素、维生素、辅因子、木质素、芥子油苷、嘌呤、嘧啶、核苷、核苷酸、醇、烷烃、烯烃、炔烃、芳香族化合物、酮、醛、羧酸、酯、胺、亚胺、酰胺、氰化物、氨基酸、硫醇、硫酯、磷酸酯、硫酸酯、硫醚、亚砜或醚。小分子可以为例如毒素。然而，本发明的方法还可以用于确定作为分析物的病毒或者甚至细菌细胞。本发明待确定的分析物还可以为存在于环境样品中并且可以用作例如环境污染、农业或其他环境条件的指示剂的分子。通常，所述分析物为蛋白质、肽、病毒、细菌细胞或小分子、优选地小分子毒素。

本文所用的术语“样品”涉及包括或疑似包括待确定的分析物的组合物的任何部分或等分试样。此类样品可以为通常从生物体分离的生物学样品，诸如体液或活检样品，或者可以为包括生物体的组合物，诸如培养细胞。通常，出于医学目的，诸如诊断或预测疾病或医学病况，通过本发明的方法研究所述生物学样品。此外，样品可以为环境样品或人工样品。环境样品可以源自任何非生物、天然来源，例如，环境中存在的溶液(诸如水)或来自组合物(诸如土壤)。人工样品可以为从人工来源获得的样品，例如，可以制造的产品组合物或可以在产品的制造过程期间出现的中间组合物。可以研究此类人工样品，例如用于质量控制目的或用于确定特定成分的量。通常，根据本发明的方法的所述样品为生物学样品、优选地体液或活检样品。

根据本发明使用的术语“传感器元件”包括具有被锚定层覆盖的表面的固体支持物。此外，传感器元件应当进一步包括如上所述的分子排列，即：第一结合剂，其能够与分析物特异性结合，其被锚定在锚定层中并且其包含至少一个磁性标记；以及第二结合剂，其能够在分析物结合至第一结合剂的情况下与该分析物特异性结合并且被固定在固体支持物上。此外，磁性隧道结应当与第二结合剂功能临近，使得如果第一结合剂的至少一个磁性标记临近所述磁性隧道结，则可以引发信号。

本文所提及的术语“锚定层”涵盖能够缔合分子且特别是根据本发明的第一结合剂的任何分子层。根据本发明提及的第一结合剂的缔合应当允许第一结合剂或附着于其上的任何锚定分子在锚定层内或其表面上的分子移动。所述锚定层通常为脂质层或脂质双层。本领域技术人员熟知可以如何通过此类锚定层覆盖固体支持物以及可以使用哪些脂质来产生脂质层或脂质双层。适合用作根据本发明的锚定层的典型脂质层或脂质双层可以包括例如磷脂层或磷脂双层。所述磷脂层或磷脂双层可以特别包括一种或多种磷脂酰胆碱，诸如1-油酰基-2-棕榈酰基-磷脂酰胆碱、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱和/或1，2-二油酰-sn-甘油-3-[(N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰]、或一种或多种磷脂酰胆碱与胆固醇的混合物。此外，所支持的脂质双层和所系链的双层脂质膜可以用作根据本发明的锚定层。这些是本领域已知的常用模型脂质双层。

本文所用的术语“固体支持物”涉及可以用作固定分子且特别是第二结合剂的基础的固体物质组合物。固体支持物可以包括无机化合物或有机化合物或这两者。通常，用于固体支持物的合适的无机化合物可以选自由以下项组成的组：二氧化硅、多孔玻璃、铝硅酸盐、硼硅酸盐、金属氧化物(例如氧化铝、氧化铁、氧化镍)和含有这些中的一种或多种的粘土。替代地，固体支持物可以包括有机化合物，诸如交联聚合物。合适的交联聚合物的非限制性实例可以选自由以下项组成的组：聚酰胺、聚醚、聚苯乙烯及其混合物。本领域技术人员熟知如何基于待研究的样品的种类、设想用于检测分析物的方法、用于检测分析物的磁性标记的种类和/或用于传感器元件的第二结合剂的种类来选择合适的固体支持物。固体支持物还应当包括与被固定在所述固体支持物上的第二结合剂功能临近的磁性隧道结。在功能临近的情况下，应当理解，如果所述第一结合剂与如本文别处所定义的第二结合剂和分析物一起成为复合物的一部分，则磁性隧道结相对于第二结合剂位于远处并且位于允许产生由第一结合剂的至少一个磁性标记引发的信号的位置处。

传感器应当进一步包括能够与分析物特异性结合的第一结合剂。所述第一结合剂应当被锚定在锚定层中。此外，其应当包括至少一个磁性标记。

本文所提及的术语“第一结合剂”涉及能够与分析物特异性结合的分子，即不与除疑似存在于样品中的分析物以外的其他分子结合且因此不与这些其他分子发生交叉反应的分子。原则上，可以通过本领域熟知的技术来测试特异性结合，这些技术包括用于识别特异性结合来自包括不同的候选药剂的库的分析物的药剂的筛选测定。

可以优选地用作能够与所需分析物特异性结合的第一结合剂的分子可以为抗体。根据本发明，作为结合剂的抗体涵盖优选地与分析物特异性结合的所有类型的抗体。优选地，本发明的抗体可以为单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体或此类抗体的仍能够与分析物特异性结合的任何片段。本文所用的术语抗体所包括的此类片段涵盖双特异性抗体、合成抗体、Fab、F(ab)2 Fv或scFv片段、或任何这些抗体片段的化学修饰衍生物。一般而言，与所需分析物特异性结合的抗体或其片段可以通过使用例如Harlow和Lane″Antibodies，A Laboratory Manual″，CSH Press，Cold Spring Harbor，1988中描述的方法来获得。单克隆抗体可以通过包括以下的技术来制备：将小鼠骨髓瘤细胞与源自免疫哺乳动物并且优选地免疫小鼠的脾细胞融合(

此外，可以优选地用作能够与所需分析物特异性结合的第一结合剂的分子可以为适体。作为根据本发明的结合剂的适体可以为与特定靶分析物结合的寡核酸或肽分子(Ellington 1990，Nature 346(6287)：818-22)。Bock 1992，Nature 355(6360)：564-6)。寡核酸适体是通过重复选择轮次或所谓的指数富集配体系统进化(SELEX技术)而设计的。肽适体通常由两端附着于蛋白质支架的可变肽环构成。这种双重结构约束应当将肽适体的结合亲和力增加到纳摩尔范围。所述可变肽环长度优选地由十个至二十个氨基酸构成，并且支架可以为具有改善的溶解度和容量性质的任何蛋白质，诸如硫氧还蛋白-A。可以使用不同的系统进行肽适体选择，包括例如酵母双杂交系统(参见例如Hoppe-Seyler 2000，J MolMed.78(8)：426-30)。根据本发明还涵盖所述适体的仍然能够与分析物特异性结合的任何片段。所述片段可以以分离形式使用，或者可以为融合分子的一部分，即包括所述适体片段以及其他部分(诸如接头部分或衔接头分子)的分子。本领域技术人员熟知可以如何通过本领域熟知的技术来测试特异性结合，这些技术为诸如等离子体表面共振测量。

可以优选地用作能够与所需分析物特异性结合的第一结合剂的分子可以为受体分子。作为根据本发明所提及的结合剂的受体分子通常为与配体特异性结合并且在配体结合后就被激活以发挥其生物学功能的蛋白质。此类仍然能够与配体特异性结合的受体分子或其片段也可以用作根据本发明的结合剂，用于作为分析物的配体或衍生自配体但仍然能够被受体分子或其片段结合的分子，诸如配体的拮抗或激动作用变体。优选地，设想作为根据本发明的结合剂的受体分子可以为跨膜型受体蛋白，诸如G蛋白偶联受体，例如代谢受体；酶联受体，诸如受体酪氨酸激酶，例如生长因子受体；免疫受体，诸如病毒受体、细胞表面抗原、T细胞受体，例如CD4、CD3或CD8、或MHC蛋白质；细胞粘附分子，诸如整联蛋白、钙粘蛋白、选择蛋白或多聚糖；神经元受体；或病原体受体，诸如Toll样受体。受体分子还可以为核受体蛋白，诸如核激素受体，例如糖皮质激素受体、视黄酸受体或甲状腺激素受体。本领域技术人员熟知与待确定的分析物或其片段特异性结合的受体分子或其片段。此外，可以通过本领域熟知的技术来测试特异性结合，这些技术为诸如等离子体表面共振测量。

然而，可以优选地用作能够与所需分析物特异性结合的第一结合剂的分子可以为配体分子。作为根据本发明所提及的结合剂的配体分子通常为与受体分子特异性结合并且在受体与所述受体分子结合时激活的蛋白质或肽。此类仍然能够与受体分子特异性结合的配体分子或其片段也可以用作根据本发明的结合剂，用于作为分析物的受体或衍生自受体分子但仍然能够被配体分子或其片段结合的分子，诸如受体的可溶性变体。此外，配体还可以为可以用于确定生物体的样品中的某种抗体的任何抗原。优选地，设想作为根据本发明的结合剂的配体分子可以为肽激素、神经递质、生长因子，诸如血管生成素、BMP、中性营养因子、EGF、表皮蛋白、EPO、FGF、GDNF、GDF、胰岛素或胰岛素样生长因子、TGF、中性粒细胞、VEGF、细胞因子，诸如白细胞介素、干扰素、淋巴因子、单核因子、集落刺激因子或趋化因子、细胞外基质蛋白，诸如纤连蛋白、玻连蛋白、胶原、锚蛋白或层粘连蛋白等。本领域技术人员熟知与待确定的分析物或其片段特异性结合的配体分子或其片段。此外，可以通过本领域熟知的技术来测试特异性结合，这些技术为诸如等离子体表面共振测量。

更优选地，第一结合剂可以为设计锚蛋白重复蛋白(DARPin)。DARPin为可以被设计用于实现高度特异性和高亲和力的靶蛋白结合的基因工程抗体模拟蛋白。它们衍生自天然锚蛋白重复蛋白。通常，DARPin包括至少三个重复模块，其中最N末端和最C末端模块(也称为“帽”)保护蛋白质的疏水核心(Binz 2003，Journal of Molecular Biology.332(2)：489-503)。

通常，所述第一结合剂选自由以下项组成的组：抗体或其片段、适体、受体分子或其片段以及配体分子或其片段。更通常，该第一结合剂为抗体或其片段或适体。

此外，根据本发明的第一结合剂应当被锚定在锚定层中。通常，根据本发明所提及的锚定的第一结合剂应当与锚定层相关联或位于锚定层内。因此，该第一结合剂的移动通常被限制在基本上二维的空间中。

优选地，所述第一结合剂经由锚定分子、更优选地脂质被锚定在锚定层中。用于锚定根据本发明的第一结合剂的合适的脂质取决于锚定层的性质并且可以由本领域技术人员毫不费力地选择。锚定分子通常可以经由接头分子连接到至少一种、优选地多种第一结合剂。合适的接头分子允许附着许多第一结合剂和至少一种锚定分子。优选地，合适的接头分子可以为环DNA分子。因此，多种第一结合剂可以经由相同的锚定分子被锚定到锚定层。

如本文所用，术语“磁性标记”涉及可以与磁性隧道结功能临近处被检测到的分子。因此，根据本发明，磁性标记通常被设想为磁性标记。典型的磁性标记包括铁-铂纳米颗粒、铁纳米颗粒、镍纳米颗粒或钴纳米颗粒。磁性标记可以与第一结合剂可逆地或永久地结合。为此，磁性标记可以为能够与第一结合剂可逆地结合的分子，或者它可以为已经作为所述第一结合剂的一部分的分子或部分。通常，所述磁性标记包括可以通过连接剂共价连接到固体支持物的接头。

第一结合剂可以包括至少一个磁性标记作为分子的一部分。替代地，至少一个磁性标记可以通过接头连接到第一结合分子。根据本发明设想了永久连接以及可逆连接。可逆连接可以例如通过使用本领域熟知的基于生物素-链霉抗生物素的分子衔接头系统来实现。

传感器还应当包括当分析物结合至第一结合剂时能够与该分析物特异性结合的第二结合剂。所述第二结合剂应当被固定在固体支持物上。此外，如本文别处所述，磁性隧道结与第二结合剂之间应当存在功能临近性。因此，第二结合剂同样应当与磁性隧道结功能临近。

能够与分析物特异性结合的术语“第二结合剂”涉及能够特异性结合至分析物或在分析物特异性结合至第一结合剂的情况下与该分析物特异性结合的分子，即不与除疑似存在于样品中的分析物或分析物与第一结合剂的复合物之外的其他分子结合且因此不与之发生交叉反应的分子。通常，所述第二结合剂选自由以下项组成的组：抗体或其片段、适体、受体分子或其片段以及配体分子或其片段。更通常，该第一结合剂为抗体或其片段或适体。通常，第二结合剂与第一结合剂来自相同的前述分子类别。根据第一结合剂制备的抗体或其片段、适体、受体分子或其片段以及配体分子或其片段的定义经必要修改后适用于第二结合剂。

第二结合剂应当被固定在固体支持物上。优选地，所述第二结合剂的固定为永久固定。用于将第二结合剂固定到固体支持物的合适技术取决于固体支持物的性质和/或第二结合剂的性质，并且是本领域技术人员熟知的。应当理解，在固定后，第二结合剂就不应能够在锚定层之内或之外移动其位置。然而，第二结合剂应当能够进行与分析物或者与结合至分析物的第一结合剂结合所需的弯曲和其他分子移动或构象改变。

此外，优选地，第二结合剂与分析物和第一结合剂的相互作用应当为可逆的相互作用。设想缔合速率通常大于解离速率，使得第一结合剂、分析物和第二结合剂的复合物在一定时间内保持稳定，从而允许在所述时间窗口期间通过检测在第二结合剂的位置附近的至少一个磁性标记的存在或丰度来确定它们。

通常，所述第一结合剂的量为所述第二结合剂的量的10倍至100倍、20倍至80倍、30倍至70倍或40倍至60倍。

如本文所用，术语“磁性隧道结”是指磁响应检测器(诸如磁性隧道结或磁性自旋阀)(参见例如US 5,981,297；Femandes 2020，Nanomedicine：Nanotechnology，Biology，和Medicine 30，102287或Denmark 2019，Journal of Electronic Materials(48)：4749-4761)。

通常，作为传感器元件的检测器的磁性隧道结被放置在固体支持物下方并且所述检测器能够选择性地检测与所述第二结合元件功能临近的信号。根据磁性标记，可以应用不同的检测技术。此外，根据检测技术，可能需要向磁性隧道结施加磁场。

应当理解，检测到的磁性标记的存在、不存在或量可以随后传输到评估单元。所述评估单元可以优选地包括数据处理元件，诸如计算机，其具有用于基于检测到的磁性标记的存在、不存在或量来确定样品中分析物的存在、不存在或量的实施算法。

此类所实施的算法可以评估从第一结合剂、分析物和第二结合剂的复合物中的磁性标记引发的测量信号的信号强度、信号持续时间和其他预定参数。基于所述评估，可以识别和验证真正的积极信号，并且可以识别和忽略噪声信号，以进行进一步评估。本领域技术人员熟知可以使用何种算法以及可以如何在本发明的装置中实施它们。优选地，通过测量由至少一个磁性标记引发的信号的强度和/或持续时间来检测第一结合剂、分析物和第二结合剂的复合物的形成。更优选地，可以在预定特征时间周期内检测到所述信号。优选地，真实信号的特征为在第一时间窗内取决于包括第一结合剂、分析物和第二结合剂的复合物的一个或多个缔合常数的形成、预定义时间窗内的持续性以及第二时间窗内取决于包括第一结合剂、分析物和第二结合剂的复合物的一个或多个解离常数的解离。通常，真实信号的检测时间可以比由自由移动的第一结合剂包括的至少一个磁性标记引发的信号显著更长，该自由移动的第一结合剂随机地穿过固定的第二结合剂临近的锚定层。后者应当仅产生短噪声信号。

为了精确评估根据本发明的方法检测到的磁性标记的信号并基于其确定分析物，可以应用计算机实施的算法，特别是人工智能算法、机器学习算法等。

在根据本发明的方法的步骤(a)中，使包括待确定的分析物或疑似包括待确定的分析物的样品与如本文别处详细指定的生物传感器接触。

如本文所用，术语“接触”涉及使前述组分物理临近，使得第一和/或第二结合剂可以与分析物(如果存在于样品中)结合。应当理解，第一结合剂与分析物的结合以及第二结合剂与分析物或第一结合剂与分析物的复合物的结合可能需要时间并应用合适的条件。本领域技术人员熟知实现结合需要多长时间以及需要应用何种条件。例如，可以将样品和结合剂溶解或与调整盐浓度和/或pH值的缓冲液混合。应当理解，可以应用的合适的缓冲剂和其他辅助组分取决于待使用的结合剂和待确定的分析物的化学性质。

在本发明的方法的步骤(a)中，还使第一结合剂和分析物与被固定在固体支持物上的第二结合剂接触，该第二结合剂能够特异性结合至分析物或在第一结合剂结合至分析物的情况下与该第一结合剂特异性结合。通常，在施加样品之前提供包括锚定到锚定层的第一结合剂和固定的第二结合剂的传感器元件上的布置。然而，也可以使样品与第一结合剂接触，并且将样品施加到包括被固定在固体支持物上的第二结合剂的锚定层。

在本发明的方法中施加的第一结合剂应当与磁性标记结合，或者它可以与能够共价或可逆地结合至少一个磁性标记的连接剂连接。

由于在本发明的方法的步骤(a)期间发生的前述活动，分析物将被第一结合剂结合，该第一结合剂包括与其共价结合或任选地经由接头分子可逆地结合的磁性标记。分析物和第一结合剂的所述复合物应当在锚定层内移动，并且应当被固定在固体支持物上的第二结合剂结合，使得产生包括第一结合剂、分析物和第二结合剂的复合物(“锁定”)。由于分子结合动力学，该复合物将与固体支持物上的第二结合分子的固定位置临近持续存在一个特征时间窗，直到其溶解(“解锁”)。

在本发明的方法的步骤(b)中，基于由磁性隧道结产生的信号来检测第一结合剂、分析物和第二结合剂的前述复合物，由此确定分析物。

如本文所用，术语“检测”涉及识别磁性标记的存在、不存在和/或量。应当理解，磁性标记通常产生可以由磁性隧道结测量的信号。信号强度和/或持续时间通常指示存在于复合物中的与磁性隧道结功能临近的磁性标记分子的量。优选地，通过测量由至少一个磁性标记引发的信号的强度和/或持续时间来检测第一结合剂、分析物和第二结合剂的复合物的形成。更优选地，可以在预定特征时间周期内检测到所述信号。

在本发明的方法中，第一结合剂和第二结合剂可以用于确定不同的分析物。在此类情况下，应当理解，一旦形成针对此类不同的分析物的复合物，每种复合物必须拥有不同的磁性标记，该磁性标记能够在磁性隧道结上产生至少一种信号特征不同的信号。

在本发明的方法的一个特定实施方案中，所述固体支持物为孔或预定细分检测区域。优选地，每个孔或预定细分检测区域已在其上固定预定量的第二结合剂。所述方法对于确定分析物(包括确定所述分析物的量)特别有用。通常，通过对其中已形成复合物的孔或预定细分检测区域进行计数来确定所述量。根据该特定实施方案，针对每个孔或预定细分区域检测分析物的存在、不存在或量。然后，应当确定阳性孔或预定细分区域的数量。阳性孔或预定细分区域应当为展现出如本文别处所述的具有预定强度或持续时间的用于适当复杂形成的特征信号的孔或区域，该特征信号为例如高于预定强度阈值和/或超过预定时间窗的可测量信号。基于阳性孔或预定细分区域以及被固定在每个所述孔或预定细分区域上的第二结合剂的预定量，可以例如通过计算来确定分析物的量。例如，如果每个孔或预定细分区域理想地含有一种第二结合剂，则样品中分析物的一种分子的存在将产生一种复合物。因此，如果确定孔中或预定细分区域上存在复合物，则该存在反映了存在于样品中的一种分析物的存在。因此，在诸如孔或任何其他预定细分区域的隔离物品上使用预定量的第二结合剂会允许定量或半定量确定存在于样品中的分析物分子。该技术也称为“数字”检测。

在本发明的方法中，特别地，为了数字检测的目的，所述样品与至少100个传感器元件、至少300个传感器元件、至少500个传感器元件、至少1,000个传感器元件、至少5,000个传感器元件、至少10,000个传感器元件、至少50,000个传感器元件或至少100,000个传感器元件接触。更优选地，所述分析物的量包括对由磁性隧道结产生的单个经测量的信号进行计数。

有利地，根据本发明，已经发现，使用通过与锚定层(诸如脂质层)缔合而将其移动限制为基本上二维的第一结合剂以夹心测定形式提高了灵敏度并抑制了非所需背景噪声。根据本发明，包括第一结合剂(例如，抗体)、待确定的分析物、第二结合剂(例如，抗体)的免疫复合物以一定的动力学形成，持续一定的时间窗，并且以一定的动力学溶解(“锁定、解锁”原理)。此外，根据所使用的分子构造，可以预期产生一定强度的信号。因此，在本发明的方法中，确定复合物形成和复合物溶解的动力学测量，而不是单一形成事件的动力学测量。这允许动态实时测量，并且甚至可以使洗涤步骤和其他处理变得不必要。由于锚定层的使用，还应当减少固体支持物上引起噪声的事件。根据检测器的性质，基本上可以将复杂形成事件单一化。例如，如果应用与在分析物分子存在的情况下引发复合物形成的单一第二结合剂相关联的磁响应检测器或共焦检测器，则应当理解，复合物形成应当表示所述分析物分子存在于样品中。在此类数字格式中，各个检测器接收到的信号的数量可以用于对存在于样品中的分析物分子进行计数。

由于本发明，可以用改进的灵敏度和特异性来确定样品中的分析物。此外，甚至可以确定单一分子事件。

本发明涉及一种用于确定疑似存在于样品中的分析物的装置，该装置包括传感器元件，该传感器元件包括：

(i)锚定层，其存在于固体支持物上；

(ii)第一结合剂，其能够与分析物特异性结合，其被锚定在锚定层中并且其包含至少一个磁性标记；

(iii)第二结合剂，其能够在所述分析物结合至所述第一结合剂的情况下与所述分析物特异性结合并且其被固定在所述固体支持物上；以及

(iv)与第二结合剂功能临近的磁性隧道结，该磁性隧道结产生与第一结合剂的至少一个磁性标记临近引发的信号。

如本文所用，术语“装置”涉及包括前述组件的系统，这些前述组件彼此可操作地连接的以允许根据本发明的方法确定分析物。

根据本发明的传感器元件可以位于该装置所包括的反应区中。反应区可以直接进行样品施加，或者它可以连接到施加样品的上样区。在后一种情况下，样品可以经由上样区和反应区之间的连接主动或被动地输送至反应区。此外，反应区还应连接到检测器。合适的检测器和检测技术在本文别处详细描述。反应区与检测器之间的连接应当使得检测器可以检测磁性标记。合适的连接取决于用于测量磁性标记的存在或量的技术。传感器元件还包括与第二结合剂功能临近的磁性隧道结，该磁性隧道结产生与第一结合剂的至少一个磁性标记临近引发的信号。

本发明总体上涉及本发明的前述装置用于确定样品中疑似存在于所述样品中的分析物的用途。

本发明还涉及一种用于确定疑似存在于样品中的分析物的试剂盒，该试剂盒包括本发明的装置。

如本文所用，术语“试剂盒”是指进行本发明的方法所需的组分的集合，包括本发明的装置。通常，在独立的容器中或单一容器内提供试剂盒的组分。容器通常还包括用于进行本发明方法的说明。这些说明可以为手册的形式，或者可以由计算机程序代码提供，该计算机程序代码当在计算机或数据处理装置上实现时能够进行或支持在本发明的方法中提及的分析物的确定。计算机程序代码可提供于数据存储介质或装置诸如光学存储介质(例如，光盘)上或直接提供于计算机或数据处理装置上或可以以下载格式提供，诸如链接至可访问的服务器或云。此外，试剂盒通常可以包括具有用于校准或验证的标准化量或其他参考量的分析物溶液。根据本发明的试剂盒还可以包括进行本发明的方法所必需的其他组分，诸如检测磁性标记所需的洗涤溶液、溶剂和/或试剂。此外，其可以部分地或以其整体构成本发明的装置。

以下实施方案为根据本发明设想的特定优选实施方案。上述术语的所有定义和解释均应比照适用。

实施方案1.一种用于确定疑似存在于样品中的分析物的方法，该方法包括：

(a)使所述样品与传感器元件在一定时间内并且在一定条件下接触，所述传感器元件包括：

(i)锚定层，其存在于固体支持物上；

(ii)第一结合剂，其能够与分析物特异性结合，其被锚定在锚定层中并且其包含至少一个磁性标记，其中所述至少一个磁性标记位于锚定层内；

(iii)第二结合剂，其能够在分析物结合至第一结合剂的情况下与该分析物特异性结合并且其被固定在固体支持物上；以及

(iv)与第二结合剂功能临近的磁性隧道结，该磁性隧道结产生与第一结合剂的至少一个磁性标记临近引发的信号；

所述时间和所述条件允许疑似存在于所述样品中的所述分析物与所述第一结合剂特异性结合以及所述第二结合剂与结合至所述第一结合剂的所述分析物特异性结合；以及

(b)基于由所述磁性隧道结产生的所述信号来检测第一结合剂、分析物和第二结合剂的复合物的形成，由此确定所述分析物。

实施方案2.根据实施方案1所述的方法，其中通过测量由至少一个磁性标记引发的信号的强度和/或持续时间来检测第一结合剂、分析物和第二结合剂的复合物的所述形成。

实施方案3.根据实施方案2所述的方法，其中能够在预定特征时间周期内检测到所述信号。

实施方案4.根据实施方案1至3中任一项所述的方法，其中所述分析物为蛋白质、肽、病毒、细菌细胞或小分子。

实施方案5.根据实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述锚定层为脂质层或脂质双层。

实施方案6.根据实施方案1至5中任一项所述的方法，其中所述第一结合剂经由锚定分子锚定在锚定层中。

实施方案7.根据实施方案6所述的方法，其中所述锚定分子为脂质。

实施方案8.根据实施方案6或7所述的方法，其中所述锚定分子经由接头分子、优选地环DNA分子来与至少一种第一结合剂连接。

实施方案9.根据实施方案1至8中任一项所述的方法，其中所述第一结合剂选自由以下项组成的组：抗体或其片段、适体、受体分子或其片段以及配体分子或其片段。

实施方案10.根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中所述第二结合剂选自由以下项组成的组：抗体或其片段、适体、受体分子或其片段以及配体分子或其片段。

实施方案11.根据实施方案1至10中任一项所述的方法，其中所述第一结合剂的量为所述第二结合剂的量的10倍至100倍、20倍至80倍、30倍至70倍或40倍至60倍。

实施方案12.根据实施方案1或11中任一项所述的方法，其中所述确定分析物包括确定所述分析物的量。

实施方案13.根据实施例1至12中任一项所述的方法，其中所述样品与至少100个传感器元件、至少300个传感器元件、至少500个传感器元件、至少1,000个传感器元件、至少5,000个传感器元件、至少10,000个传感器元件、至少50,000个传感器元件或至少100,000个传感器元件接触。

实施方案14.根据实施例13所述的方法，其中所述确定所述分析物的量包括对由磁性隧道结产生的单个经测量的信号进行计数。

实施方案15.根据实施方案1至14中任一项所述的方法，其中所述样品为生物学样品、优选地体液或活检样品。

实施方案16.一种用于确定疑似存在于样品中的分析物的装置，该装置包括传感器元件，该传感器元件包括：

(i)锚定层，其存在于固体支持物上；

(ii)第一结合剂，其能够与分析物特异性结合，其被锚定在锚定层中并且其包含至少一个磁性标记；

(iii)第二结合剂，其能够在分析物结合至第一结合剂的情况下与该分析物特异性结合并且其被固定在固体支持物上；以及

(iv)与所述第二结合剂功能临近的磁性隧道结，所述磁性隧道结产生与所述第一结合剂的所述至少一个磁性标记临近引发的信号。

实施方案17.根据实施方案16所述的装置用于确定样品中疑似存在于所述样品中的分析物的用途。

实施方案18.一种用于确定疑似存在于样品中的分析物的试剂盒，该试剂盒包括根据实施方案16所述的装置。

本说明书中引用的所有参考文献的全部公开内容和在本说明书中特别提及的公开内容均以引用方式并入本文。

附图说明

图1：传感器布置的示意图。在左侧，展示了锁定状态，其特征在于第一结合剂、分析物和第二结合剂的复合物。可以通过使用功能临近的磁性隧道结来测量由磁性标记引发的信号。此类信号应当具有特征锁定、解锁签名。在右侧，展示了背景噪音的原因。背景噪声将由漂浮在锚定层中并且可能已经或可能尚未与分析物分子结合的第一结合剂产生。背景信号通常不太强烈，并且不会持续很长的时间窗。

图2：展示了环状I-DNA分子的示意图，该分子经由附着到其的3个锚定分子被锚定在锚定层(例如，脂质层)中，并且其含有三个抗体片段作为根据本发明的第一结合剂，并且附着到所述抗体和环状I-DNA的七个磁性标记。